第三章液質(zhì)聯(lián)用原理及應(yīng)用-2013

1、1色譜色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的原理及應(yīng)用質(zhì)譜聯(lián)用的原理及應(yīng)用2學(xué)習(xí)目的學(xué)習(xí)目的u掌握質(zhì)譜的基本組成、工作原理u掌握常用的質(zhì)譜術(shù)語、常用離子源工作原理u掌握液質(zhì)聯(lián)用的定性、定量方法u熟悉液質(zhì)聯(lián)用條件優(yōu)化u了解液質(zhì)聯(lián)用的應(yīng)用3質(zhì)譜原理簡介質(zhì)譜原理簡介 質(zhì)譜分析是先將物質(zhì)離子化，按離子的質(zhì)荷質(zhì)譜分析是先將物質(zhì)離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)分比分離，然后測量各種離子譜峰的強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)分析目的的一種分析方法。以檢測器檢測到的離子析目的的一種分析方法。以檢測器檢測到的離子信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，離子質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)所作的信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，離子質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)所作的條狀圖就是我們常見的質(zhì)譜圖。條狀

2、圖就是我們常見的質(zhì)譜圖。 4簡介簡介 色譜質(zhì)譜的在線聯(lián)用色譜質(zhì)譜的在線聯(lián)用將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分析。結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分析。而且也簡化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡便。而且也簡化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡便。色譜質(zhì)譜聯(lián)用包括氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用色譜質(zhì)譜聯(lián)用包括氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)(GC-MS)和液相色譜和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)(LC-MS)，液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用互為補(bǔ)充，分析，液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用互為補(bǔ)充，分析不同性質(zhì)的化合物。不同性質(zhì)的化合物。 5液

3、質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別: : 氣質(zhì)聯(lián)用儀氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)(GC-MS)是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用電子析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用電子轟擊方式（轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比。）得到的譜圖，可與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比。 液質(zhì)聯(lián)用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問題：不揮主要可解決如下幾方面的問題：不揮發(fā)性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩(wěn)發(fā)性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多

4、定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對比肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖。查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖。 6Analyte PolarityIonSprayAPCIGC/MS7現(xiàn)代有機(jī)和生物質(zhì)譜進(jìn)展現(xiàn)代有機(jī)和生物質(zhì)譜進(jìn)展 初期：初期：質(zhì)譜法通常只能測定分子量質(zhì)譜法通常只能測定分子量500Da以下的小分子化合以下的小分子化合物。物。20世紀(jì)世紀(jì)70年代：年代：場解吸（場解吸（FD）離子化技術(shù)，能夠測定分子）離子化技術(shù)，能夠測定分子量高達(dá)量高達(dá)15002000Da的非揮發(fā)性化合物，但重復(fù)性差

5、。的非揮發(fā)性化合物，但重復(fù)性差。20世紀(jì)世紀(jì)80年代：年代：快原子質(zhì)譜法（快原子質(zhì)譜法（FAB-MS），能夠分析分），能夠分析分子量達(dá)數(shù)千的多肽。子量達(dá)數(shù)千的多肽。電噴霧離子化質(zhì)譜法（電噴霧離子化質(zhì)譜法（ESI-MS）和基質(zhì)輔助激光解吸離子）和基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜法（化質(zhì)譜法（MALDI-MS）蛋白）蛋白-生命科學(xué)生命科學(xué)8常見術(shù)語常見術(shù)語9 910常見術(shù)語常見術(shù)語質(zhì)荷比質(zhì)荷比: 離子質(zhì)量離子質(zhì)量(以相對原子量單位計(jì)以相對原子量單位計(jì))與它所帶電荷與它所帶電荷(以電子以電子電量為單位計(jì)電量為單位計(jì))的比值的比值,寫作寫作m/Z.峰峰: 質(zhì)譜圖中的離子信號(hào)通常稱為離子峰或簡稱峰質(zhì)譜圖中的離

6、子信號(hào)通常稱為離子峰或簡稱峰.離子豐度離子豐度: 檢測器檢測到的離子信號(hào)強(qiáng)度檢測器檢測到的離子信號(hào)強(qiáng)度.基峰基峰: 在質(zhì)譜圖中，指定質(zhì)荷比范圍內(nèi)強(qiáng)度最大的離子峰稱作在質(zhì)譜圖中，指定質(zhì)荷比范圍內(nèi)強(qiáng)度最大的離子峰稱作基峰基峰.總離子流圖；質(zhì)量色譜圖；準(zhǔn)分子離子；碎片離子；多電荷總離子流圖；質(zhì)量色譜圖；準(zhǔn)分子離子；碎片離子；多電荷離子；同位素離子離子；同位素離子11總離子流圖總離子流圖在選定的質(zhì)量范圍內(nèi)，所有離子強(qiáng)度的總和對在選定的質(zhì)量范圍內(nèi)，所有離子強(qiáng)度的總和對時(shí)間或掃描次數(shù)所作的圖時(shí)間或掃描次數(shù)所作的圖,也稱也稱TIC圖圖.12質(zhì)量色譜圖質(zhì)量色譜圖指定指定某一質(zhì)量某一質(zhì)量(或質(zhì)荷比或質(zhì)荷比)的離

7、子的離子其強(qiáng)度對時(shí)間所作的圖。其強(qiáng)度對時(shí)間所作的圖。利用質(zhì)量色譜圖來確定特征離子，在復(fù)雜混合物分析及痕利用質(zhì)量色譜圖來確定特征離子，在復(fù)雜混合物分析及痕量分析時(shí)是量分析時(shí)是LC/MS測定中最有用的方式。當(dāng)樣品濃度很低測定中最有用的方式。當(dāng)樣品濃度很低時(shí)時(shí)LC/MS的的TIC上往往看不到峰，此時(shí)，根據(jù)得到的分子上往往看不到峰，此時(shí)，根據(jù)得到的分子量信息，輸入量信息，輸入M+1或或M+23等數(shù)值，觀察提取離子的質(zhì)量等數(shù)值，觀察提取離子的質(zhì)量色譜圖，檢驗(yàn)直接進(jìn)樣得到的信息是否在色譜圖，檢驗(yàn)直接進(jìn)樣得到的信息是否在LC/MS上都能反上都能反映出來，確定映出來，確定LC條件是否合適，以后進(jìn)行條件是否合適

8、，以后進(jìn)行MRM等其他掃等其他掃描方式的測定時(shí)可作為參考。描方式的測定時(shí)可作為參考。13 1.02.03.04.00102030405060708090100 1.02.03.04.05.06.00102030405060708090100質(zhì)量色譜圖質(zhì)量色譜圖總離子流圖總離子流圖14準(zhǔn)分子離子準(zhǔn)分子離子指與分子存在簡單關(guān)系的離子，通過它可以確定分子量。液指與分子存在簡單關(guān)系的離子，通過它可以確定分子量。液質(zhì)中最常見的準(zhǔn)分子離子峰是質(zhì)中最常見的準(zhǔn)分子離子峰是M+H+ 或或M-H-。在在ESI中中, 往往生成質(zhì)量大于分子量的離子如往往生成質(zhì)量大于分子量的離子如M+1，M+23，M+39，M+18.

9、稱準(zhǔn)分子離子，表示為稱準(zhǔn)分子離子，表示為:M+H+，M+Na+等等15碎片離子碎片離子準(zhǔn)分子離子經(jīng)過一級(jí)或多級(jí)裂解生成的產(chǎn)物離子。準(zhǔn)分子離子經(jīng)過一級(jí)或多級(jí)裂解生成的產(chǎn)物離子。碎片峰的數(shù)目及其豐度則與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，數(shù)目多碎片峰的數(shù)目及其豐度則與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，數(shù)目多表示該分子較容易斷裂，豐度高的碎片峰表示該離表示該分子較容易斷裂，豐度高的碎片峰表示該離子較穩(wěn)定，也表示分子比較容易斷裂生成該離子。子較穩(wěn)定，也表示分子比較容易斷裂生成該離子。16HNCH3OHCH3Ephedrine, MW = 1651717多電荷離子多電荷離子指帶有指帶有2個(gè)或更多電荷的離子，常見于蛋白質(zhì)或多肽等離子。有個(gè)或更多電

10、荷的離子，常見于蛋白質(zhì)或多肽等離子。有機(jī)質(zhì)譜中，單電荷離子是絕大多數(shù)，只有那些不容易碎裂的基機(jī)質(zhì)譜中，單電荷離子是絕大多數(shù)，只有那些不容易碎裂的基團(tuán)或分子結(jié)構(gòu)團(tuán)或分子結(jié)構(gòu)-如共軛體系結(jié)構(gòu)如共軛體系結(jié)構(gòu)-才會(huì)形成多電荷離子。它的存才會(huì)形成多電荷離子。它的存在說明樣品是較穩(wěn)定的。采用電噴霧的離子化技術(shù)，可產(chǎn)生帶在說明樣品是較穩(wěn)定的。采用電噴霧的離子化技術(shù)，可產(chǎn)生帶很多電荷的離子，最后經(jīng)計(jì)算機(jī)自動(dòng)換算成單質(zhì)很多電荷的離子，最后經(jīng)計(jì)算機(jī)自動(dòng)換算成單質(zhì)/荷比離子。荷比離子。 18同位素離子同位素離子由元素的重同位素構(gòu)成的離子稱為同位素離子。由元素的重同位素構(gòu)成的離子稱為同位素離子。各種元素的同位素各種元

11、素的同位素, ,基本上按照其在自然界的豐度比出基本上按照其在自然界的豐度比出現(xiàn)在質(zhì)譜中現(xiàn)在質(zhì)譜中, ,這對于利用質(zhì)譜確定化合物及碎片的元素這對于利用質(zhì)譜確定化合物及碎片的元素組成有很大方便組成有很大方便, , 還可利用穩(wěn)定同位素合成標(biāo)記化合物還可利用穩(wěn)定同位素合成標(biāo)記化合物, ,如如: :氘等標(biāo)記化合物氘等標(biāo)記化合物, ,再用質(zhì)譜法檢出這些化合物再用質(zhì)譜法檢出這些化合物, ,在質(zhì)在質(zhì)譜圖外貌上無變化譜圖外貌上無變化, ,只是質(zhì)量數(shù)的位移只是質(zhì)量數(shù)的位移, ,從而說明化合物從而說明化合物結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu), ,反應(yīng)歷程等。反應(yīng)歷程等。19有機(jī)質(zhì)譜有機(jī)質(zhì)譜Organic Mass Spectroscopy優(yōu)

12、點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1. 靈敏度高靈敏度高2. 測定分子量，確定分子式測定分子量，確定分子式3. 分析分析范圍廣（范圍廣（氣體、液體、固體）氣體、液體、固體）4. 各種聯(lián)用技術(shù)各種聯(lián)用技術(shù)5. 新的電離、檢測技術(shù)新的電離、檢測技術(shù)20真空系統(tǒng)真空系統(tǒng)Vacuum System進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)Sample Inlet檢測器檢測器Detector數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)Data System質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器Mass Analyser離子源離子源Ionization Source一、質(zhì)譜儀的組成一、質(zhì)譜儀的組成Components of any Mass Spectrometer2121進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)離

13、子源離子源質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器檢測器檢測器22真空系統(tǒng)真空系統(tǒng) 質(zhì)譜儀的離子源、質(zhì)量分析器和檢測器必須在高真空狀質(zhì)譜儀的離子源、質(zhì)量分析器和檢測器必須在高真空狀態(tài)下工作，以減少本底的干擾，避免發(fā)生不必要的離子態(tài)下工作，以減少本底的干擾，避免發(fā)生不必要的離子- -分子反應(yīng)。所以質(zhì)譜反應(yīng)屬于單分子分解反應(yīng)。利用這分子反應(yīng)。所以質(zhì)譜反應(yīng)屬于單分子分解反應(yīng)。利用這個(gè)特點(diǎn)，我們用液質(zhì)聯(lián)用的軟電離方式可以得到化合物個(gè)特點(diǎn)，我們用液質(zhì)聯(lián)用的軟電離方式可以得到化合物的準(zhǔn)分子離子，從而得到分子量。的準(zhǔn)分子離子，從而得到分子量。由機(jī)械真空泵由機(jī)械真空泵( (前極低真空泵前極低真空泵) )，擴(kuò)散泵或分子泵，擴(kuò)散泵或

14、分子泵( (高真空高真空泵泵) )組成真空機(jī)組，抽取離子源和分析器部分的真空。組成真空機(jī)組，抽取離子源和分析器部分的真空。只有在足夠高的真空下，離子才能從離子源到達(dá)接收器只有在足夠高的真空下，離子才能從離子源到達(dá)接收器，真空度不夠則靈敏度低。，真空度不夠則靈敏度低。23進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)把分析樣品導(dǎo)入離子源的裝置，包括：直接進(jìn)樣，把分析樣品導(dǎo)入離子源的裝置，包括：直接進(jìn)樣，GCGC，LCLC及接口，加熱進(jìn)樣，參考物進(jìn)樣等。及接口，加熱進(jìn)樣，參考物進(jìn)樣等。24離子源離子源GC-MS的的EI和和CI源，離子化方式有大氣壓電離（源，離子化方式有大氣壓電離（API）（包括）（包括大氣壓電噴霧電離大氣壓電

15、噴霧電離ESI、大氣壓化學(xué)電離、大氣壓化學(xué)電離APCI、大氣壓光電離、大氣壓光電離APPI）與基質(zhì)輔助激光解吸電離。）與基質(zhì)輔助激光解吸電離。API采用四極桿或離子阱質(zhì)量分析器，統(tǒng)稱采用四極桿或離子阱質(zhì)量分析器，統(tǒng)稱API-MS。MALDI常用飛行時(shí)間作為質(zhì)量分析器，所構(gòu)成的儀器稱為基質(zhì)常用飛行時(shí)間作為質(zhì)量分析器，所構(gòu)成的儀器稱為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）。）。2525質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器磁質(zhì)量分析器（磁質(zhì)量分析器（Magnetic Sector Analyzer） 飛行時(shí)間質(zhì)譜計(jì)（飛行時(shí)間質(zhì)譜計(jì)（time of flight

16、, TOF ）四極質(zhì)量分析器（四極質(zhì)量分析器（quadrupole mass analyzer）離子阱（離子阱（ion trap）傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜計(jì)（傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜計(jì)（Fourier transform ion cyclotron resonance, FT-ICR）26檢測接收器檢測接收器接收離子束流的裝置，有：電子倍增器、光電倍增接收離子束流的裝置，有：電子倍增器、光電倍增器、微通道板器、微通道板27數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng)數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng)將接收來的電信號(hào)放大、處理并給出分析結(jié)果將接收來的電信號(hào)放大、處理并給出分析結(jié)果及控制質(zhì)譜儀個(gè)部分工作。及控制質(zhì)譜儀個(gè)部分工作。從幾伏低壓到幾

17、千伏高壓。從幾伏低壓到幾千伏高壓。281. 質(zhì)量范圍（質(zhì)量范圍（mass range） 質(zhì)譜儀所能測定的離子質(zhì)荷比的范圍。質(zhì)譜儀所能測定的離子質(zhì)荷比的范圍。 四極質(zhì)譜：四極質(zhì)譜： 1000以內(nèi)以內(nèi) 離子阱質(zhì)譜：離子阱質(zhì)譜： 6000 飛行時(shí)間質(zhì)譜：飛行時(shí)間質(zhì)譜： 無上限無上限二、質(zhì)譜儀的主要性能指標(biāo)29292. 分辨率（分辨率（resolution）分辨率分辨率R是指質(zhì)荷比相鄰的兩質(zhì)譜峰的分辨能力。是指質(zhì)荷比相鄰的兩質(zhì)譜峰的分辨能力。若近似等強(qiáng)度的質(zhì)量分別為若近似等強(qiáng)度的質(zhì)量分別為M1及及M2的兩個(gè)相鄰峰的兩個(gè)相鄰峰正好正好分開，則分開，則質(zhì)譜儀的分辨率定義為：質(zhì)譜儀的分辨率定義為：R = ;

18、 式中式中 M = ; M = M2 -M1M MM1+M2230國際上：國際上：1）R10%：兩峰間的峰谷高度為峰高的：兩峰間的峰谷高度為峰高的10%時(shí)的測定值；時(shí)的測定值；2）一般難以找到兩個(gè)質(zhì)量峰等高，且重疊的谷高正好等于峰高的）一般難以找到兩個(gè)質(zhì)量峰等高，且重疊的谷高正好等于峰高的10%，則定義：則定義：R = ; 式中式中 a為其中一峰的峰高為其中一峰的峰高5%處的峰寬處的峰寬; b為相鄰兩峰的中心距離為相鄰兩峰的中心距離M Mb a3131低分辨率質(zhì)譜儀：低分辨率質(zhì)譜儀： R 50 1）的分子離子峰所需的樣品）的分子離子峰所需的樣品量。量。3333質(zhì)譜圖質(zhì)譜圖橫坐標(biāo)：質(zhì)荷比橫坐標(biāo)：

19、質(zhì)荷比 (m/z)縱坐標(biāo)：縱坐標(biāo)：相對豐度相對豐度(最強(qiáng)峰的強(qiáng)度定為最強(qiáng)峰的強(qiáng)度定為100%)1008060402020CCH3O7710577105 CO120(M+)5143406080100120m/z相對豐度/(%) 苯乙酮的質(zhì)譜圖苯乙酮的質(zhì)譜圖 3434三、離子源（三、離子源（Ionization Source）電子轟擊電離（電子轟擊電離（electron impact ionization, EI）化學(xué)電離（化學(xué)電離（chemical ionization, CI）場電離（場電離（field ionization, FI）場解吸（場解吸（field desorption, FD）快

20、原子轟擊（快原子轟擊（fast atom bombardment, FAB）基質(zhì)輔助激光解吸電離（基質(zhì)輔助激光解吸電離（matrix-assisted laser desportion ionization, MALDI）電噴霧電離（電噴霧電離（electrospray ionization, ESI）大氣壓化學(xué)電離（大氣壓化學(xué)電離（atmospheric pressure chemical ionization, APCI）3535 質(zhì)譜中最常用的離子源，一般為質(zhì)譜中最常用的離子源，一般為70eV的電子束，遠(yuǎn)大于的電子束，遠(yuǎn)大于大多數(shù)有機(jī)化合物的電離電位（大多數(shù)有機(jī)化合物的電離電位（715e

21、V），會(huì)使相當(dāng)多的分），會(huì)使相當(dāng)多的分子離子進(jìn)一步裂解，產(chǎn)生廣義的碎片離子。子離子進(jìn)一步裂解，產(chǎn)生廣義的碎片離子。 Soft Ionization EventHard Ionization EventNETHard+Soft Events+FragmentsFragmentseeeeeeMMM+(Stable)M+*M+圖 電子轟擊分子示意圖1、電子轟擊電離（、電子轟擊電離（electron impact ionization, EI）3636優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1）穩(wěn)定）穩(wěn)定, 質(zhì)譜圖再現(xiàn)性好，便于計(jì)算機(jī)檢索及比較；質(zhì)譜圖再現(xiàn)性好，便于計(jì)算機(jī)檢索及比較；2）離子碎片多，可提供較多的分子結(jié)構(gòu)信息。）離

22、子碎片多，可提供較多的分子結(jié)構(gòu)信息。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：1）樣品必須易于氣化；）樣品必須易于氣化；2）當(dāng)樣品分子穩(wěn)定性不高時(shí)，分子離子峰的強(qiáng)度低，甚）當(dāng)樣品分子穩(wěn)定性不高時(shí)，分子離子峰的強(qiáng)度低，甚至不存在分子離子峰。至不存在分子離子峰。372 化學(xué)電離（化學(xué)電離（chemical ionization, CI）化學(xué)電離是通過離子化學(xué)電離是通過離子-分子反應(yīng)來完成的。反應(yīng)氣體一般是分子反應(yīng)來完成的。反應(yīng)氣體一般是甲烷、異丁烷、氨等甲烷、異丁烷、氨等, 生成生成(M+H)+, (M-H)+, (M+NH4)+ 的準(zhǔn)的準(zhǔn)分子離子。分子離子。37優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度高，便于推算分子量；準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度

23、高，便于推算分子量；缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：1）只適用于易揮發(fā)、受熱不分解的樣品；）只適用于易揮發(fā)、受熱不分解的樣品；2）碎片離子峰少，強(qiáng)度低。）碎片離子峰少，強(qiáng)度低。例：例：CH4 + e CH4+ + 2e CH4+ + CH4 CH5+ + CH3 CH5+ + M CH4 + (M+H)+ CH5+ + M CH4 + (M-H)+ + H23838CO2C8H17CO2C8H17149100 200 300 400100435771113167EIm/z0100113m/z0100 200 300 400149CI(CH4)261279391CI(CHMe3)100m/z0391100 200

24、300 400相對豐度/(%)相對豐度/(%)相對豐度/(%)(a)(b)(c)(a) EI源源 (b) CI源（甲烷）源（甲烷） (c) CI源（異丁烷）源（異丁烷）圖1-4 鄰苯二甲酸二辛酯的質(zhì)譜圖39393 場電離（場電離（field ionization, FI）和）和 場解吸（場解吸（field desorption, FD）場解吸：場解吸：原理與原理與FI相同，但樣品是被沉積在電極上。相同，但樣品是被沉積在電極上。FD適用于適用于難汽化的、熱不穩(wěn)定難汽化的、熱不穩(wěn)定樣品。樣品。FD的準(zhǔn)分子離子峰比的準(zhǔn)分子離子峰比FI的強(qiáng)，質(zhì)譜圖比的強(qiáng)，質(zhì)譜圖比FI的還要簡單。的還要簡單。場電離：場

25、電離：是一種軟電離技術(shù)。當(dāng)樣品蒸汽鄰近或接觸到帶高正是一種軟電離技術(shù)。當(dāng)樣品蒸汽鄰近或接觸到帶高正電位的金屬針時(shí)，由于高曲率的針端產(chǎn)生很強(qiáng)的電位梯度，樣電位的金屬針時(shí)，由于高曲率的針端產(chǎn)生很強(qiáng)的電位梯度，樣品分子可被電離。品分子可被電離。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：電離快速，適合于和氣相色譜聯(lián)機(jī)；電離快速，適合于和氣相色譜聯(lián)機(jī)；缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：要求樣品汽化，靈敏度低。要求樣品汽化，靈敏度低。40404 快原子轟擊（快原子轟擊（fast atom bombardment, FAB）FAB：是一種廣泛應(yīng)用的軟電離技術(shù)?？煸愚Z擊利用的重原子：是一種廣泛應(yīng)用的軟電離技術(shù)。快原子轟擊利用的重原子一般為一般為 He 或或

26、Ar。Ar+(高動(dòng)能的高動(dòng)能的) + Ar(熱運(yùn)動(dòng)的熱運(yùn)動(dòng)的) Ar(高動(dòng)能的高動(dòng)能的) + Ar+(熱運(yùn)動(dòng)熱運(yùn)動(dòng)的的)Ar+槍Ar+ArAr(6kV)碰撞室樣品探頭MS分析系統(tǒng)圖 FAB離子源原理示意圖電離室4141FAB可完成連可完成連FD都有困難的、都有困難的、高極性、難汽化的化合物高極性、難汽化的化合物的電離。的電離。FAB得到的是準(zhǔn)分子離子峰得到的是準(zhǔn)分子離子峰(M+H)+;當(dāng)分析極性樣品（糖類），常加入當(dāng)分析極性樣品（糖類），常加入NaCl水溶液，得到水溶液，得到(M+Na)+離子峰。離子峰。4242MALDI的方法：的方法：將被分析化合物的溶液和某種基質(zhì)溶液相混合。蒸發(fā)掉溶劑，則

27、被分析物質(zhì)與基質(zhì)形成晶體或半晶體。用一定波長的脈沖式激光進(jìn)行照射?；|(zhì)分子能有效地吸收激光的能量，并間接地傳給樣品分子，從而得到電離。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1）使一些難于電離的樣品電離，且無明顯的碎裂，從而得到）使一些難于電離的樣品電離，且無明顯的碎裂，從而得到完整的被分析化合物分子的電離產(chǎn)物；完整的被分析化合物分子的電離產(chǎn)物；2）特別適用于與飛行時(shí)間質(zhì)譜相配（）特別適用于與飛行時(shí)間質(zhì)譜相配（MALDI-TOFMS）。）。5 基質(zhì)輔助激光解吸電離 （matrix-assisted laser desportion ionization, MALDI）434344446 電噴霧電離（電噴霧電離（elect

28、rospray ionization, ESI）NebulizerGasHeatHeatSolutionMakeup GasHigh VoltagePower SupplyIonsSamplingOrifice3)4)3) Field Evaporation4) Coulomb Explosion1) Desolvation2) Charge Accumulation120Barrier Gas Flow(Differential Pumping)ESIESI源示意圖源示意圖 主要應(yīng)用于高效液相色譜主要應(yīng)用于高效液相色譜HPLC與質(zhì)譜儀的聯(lián)用。與質(zhì)譜儀的聯(lián)用。 從霧化器套管的毛細(xì)管端噴出的帶電

29、液滴，隨著溶劑的不斷快速蒸發(fā)，從霧化器套管的毛細(xì)管端噴出的帶電液滴，隨著溶劑的不斷快速蒸發(fā)，液滴迅速變小，表面電荷密度不斷增大。由于電荷間的排斥作用，就會(huì)排出液滴迅速變小，表面電荷密度不斷增大。由于電荷間的排斥作用，就會(huì)排出溶劑分子，得到樣品的準(zhǔn)分子離子。溶劑分子，得到樣品的準(zhǔn)分子離子。45毛細(xì)管2-4kV離子從液滴表面蒸發(fā)出來-+-+-含各種離子的液滴-+-+-+-+-隨著液滴的揮發(fā),電荷密度增大, 離子集中到液滴表面+-+-+-+-+-+-電噴霧離子大致化分為三個(gè)過程電噴霧離子大致化分為三個(gè)過程: :1. 形成帶電液滴2. 溶劑蒸發(fā)和液滴碎裂3. 形成氣相離子6 電噴霧電離（電噴霧電離（e

30、lectrospray ionization, ESI）46ESIESI中的多電荷離子中的多電荷離子質(zhì)譜測定是基于質(zhì)荷比 (m/z)z)。 1.1.單電荷離子單電荷離子m/z = (M+H)/1m/z = (M+H)/12.2.雙電荷離子雙電荷離子m/z = (M+2H)/2m/z = (M+2H)/23.3.多電荷離子多電荷離子 m/z = (M+nH)/nm/z = (M+nH)/n多電荷離子的同位素峰等于 1/n Da (例如,雙電荷離子的質(zhì)荷比等于 0.5 Da)。多電荷離子可以擴(kuò)展質(zhì)譜的質(zhì)量范圍。47(M + nH)n+M + (n+1)H(n+1)+M + (n-1)H(n-1)+

31、M + (n-2)H(n-2)+m/z abcdM/z軸上,b處離子所帶電荷數(shù)n(整數(shù))為n =c/(c-b)分子量可以通過以下公式計(jì)算:a x (n + 1) - (n + 1)b x n - nc x (n - 1) - (n - 1)d x (n - 2) - (n - 2)專用軟件可用 (Transform and MaxEnt)多電荷離子的解析多電荷離子的解析48多電荷離子簇多電荷離子簇 n = 20n = 22n = 18n = 16, m/z = 1060n = 23, m/z = 738n = 21n = 19n = 17Horse Heart Myoglobin( (馬心肌紅

32、蛋白馬心肌紅蛋白) )49497. 大氣壓化學(xué)電離（大氣壓化學(xué)電離（atmospheric pressure chemical ionization, APCI）輔助氣體常壓區(qū)MS104PaN2氣簾用于噴霧的空氣放電電極加熱器LCAPCIAPCI工作原理示意圖工作原理示意圖 是由ESI源派生出來的，常壓下電暈放電。 噴出的液滴先汽化，隨后溶劑分子溶劑分子被電離，發(fā)生化學(xué)電離的過程。 要樣品汽化，適用于弱極性的小分子化合物(M 165.0995.200e+0020.1 ppb, S/N = 10.721.07Quattro micro APIr2 = 0.99801000200030004000

33、5000ppb0r2 = 0.9930102030405060708090100ppb01 ppb 5000 ppb0.1 ppb 100 ppbZQ112LC-MS技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用 以大氣壓電離為接口的以大氣壓電離為接口的LC-MS技術(shù)已經(jīng)在藥物技術(shù)已經(jīng)在藥物、化工、臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)等許多領(lǐng)域中獲得、化工、臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)等許多領(lǐng)域中獲得廣泛的應(yīng)用廣泛的應(yīng)用113具體應(yīng)用領(lǐng)域具體應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)藥學(xué)：醫(yī)藥學(xué)：藥物代謝、藥物動(dòng)力學(xué)、雜質(zhì)分析、天然產(chǎn)物分析藥物代謝、藥物動(dòng)力學(xué)、雜質(zhì)分析、天然產(chǎn)物分析生物化學(xué)：生物化學(xué)：肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、糖肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、糖環(huán)境化學(xué)：環(huán)境化學(xué)：農(nóng)藥

34、和農(nóng)殘分析、有機(jī)污染物、土壤農(nóng)藥和農(nóng)殘分析、有機(jī)污染物、土壤/食品食品/水分析水分析臨床醫(yī)學(xué)：臨床醫(yī)學(xué)：新生兒檢查、糖化血紅蛋白（糖尿?。⒀t蛋白變異、膽酸新生兒檢查、糖化血紅蛋白（糖尿?。?、血紅蛋白變異、膽酸食品科學(xué)：食品科學(xué)：香料、添加物、包裝物、蛋白質(zhì)、致癌物香料、添加物、包裝物、蛋白質(zhì)、致癌物法醫(yī)學(xué)：法醫(yī)學(xué)：濫用藥物、爆炸物、興奮劑檢測濫用藥物、爆炸物、興奮劑檢測獸醫(yī)學(xué)：獸醫(yī)學(xué)：興奮劑、磺胺類藥物、抗體興奮劑、磺胺類藥物、抗體合成化學(xué)：合成化學(xué)：有機(jī)金屬化合物、有機(jī)合成物有機(jī)金屬化合物、有機(jī)合成物有機(jī)化學(xué)：有機(jī)化學(xué)：表面活性劑、染料表面活性劑、染料114藥物代謝研究藥物代謝研究 藥物

35、代謝與藥物動(dòng)力學(xué)：對液態(tài)樣品和混合樣品的分藥物代謝與藥物動(dòng)力學(xué)：對液態(tài)樣品和混合樣品的分離能力高。離能力高?？赏ㄟ^二級(jí)離子碎片尋找原型藥物并推導(dǎo)其結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^二級(jí)離子碎片尋找原型藥物并推導(dǎo)其結(jié)構(gòu)。已在世界上大型制藥企業(yè)中取代已在世界上大型制藥企業(yè)中取代HPLC而占據(jù)了主導(dǎo)而占據(jù)了主導(dǎo)地位，其測試的樣品量占總量的地位，其測試的樣品量占總量的70%以上。以上。115天然產(chǎn)物天然藥物的研究天然產(chǎn)物天然藥物的研究目前中藥開發(fā)研究有兩條途徑。一條途徑是從單一植物中目前中藥開發(fā)研究有兩條途徑。一條途徑是從單一植物中提取一種有效成分提取一種有效成分(單體化合物單體化合物)或提取物開發(fā)成新藥。另或提取物開發(fā)成

36、新藥。另一途徑則是中藥復(fù)方制劑的開發(fā)研究。一途徑則是中藥復(fù)方制劑的開發(fā)研究。 指紋圖譜分離鑒定指紋圖譜分離鑒定定量四、五種指標(biāo)成分定量四、五種指標(biāo)成分(有效成分或特征成分有效成分或特征成分)進(jìn)行，可以進(jìn)行，可以確定出簡化的指紋圖譜和指標(biāo)成分。確定出簡化的指紋圖譜和指標(biāo)成分。國內(nèi)外很多學(xué)者已進(jìn)行了復(fù)方丹參、清開靈、瀉心湯、人國內(nèi)外很多學(xué)者已進(jìn)行了復(fù)方丹參、清開靈、瀉心湯、人參或黨參制劑等中藥中的主要成分的分析。參或黨參制劑等中藥中的主要成分的分析。 116臨床診斷和疾病生物標(biāo)志物的分析臨床診斷和疾病生物標(biāo)志物的分析 新生兒遺傳疾病篩選（新生兒遺傳疾病篩選（PKU、MCAD等四十種左右）、新等四十

37、種左右）、新生兒性激素變異的檢測、男女激素的監(jiān)測、老年癡呆癥的生兒性激素變異的檢測、男女激素的監(jiān)測、老年癡呆癥的早期診斷、抗排異藥物的檢測、磷酸脂的檢測、血紅蛋白早期診斷、抗排異藥物的檢測、磷酸脂的檢測、血紅蛋白變異檢測、糖化血紅蛋白（糖尿病早期檢測）、某些心臟變異檢測、糖化血紅蛋白（糖尿病早期檢測）、某些心臟病、癌癥疾病篩查如乳腺癌等等（病、癌癥疾病篩查如乳腺癌等等（Biomarker法、通過鑒法、通過鑒定定DNA損傷程度測定）、藥物劑量監(jiān)測、藥物相互作用監(jiān)損傷程度測定）、藥物劑量監(jiān)測、藥物相互作用監(jiān)測、地區(qū)性突發(fā)性中毒病人的毒物檢測等。測、地區(qū)性突發(fā)性中毒病人的毒物檢測等。 117殘留、法

38、醫(yī)學(xué)和環(huán)境樣品測定殘留、法醫(yī)學(xué)和環(huán)境樣品測定進(jìn)口動(dòng)物源性食品中禁止使用的藥物名單，提高了最高限進(jìn)口動(dòng)物源性食品中禁止使用的藥物名單，提高了最高限量標(biāo)準(zhǔn)。量標(biāo)準(zhǔn)。對環(huán)境中各種污染物、有害或有毒物以及法庭科學(xué)中毒物對環(huán)境中各種污染物、有害或有毒物以及法庭科學(xué)中毒物、濫用藥物等進(jìn)行更加嚴(yán)格的監(jiān)控。、濫用藥物等進(jìn)行更加嚴(yán)格的監(jiān)控。數(shù)百種農(nóng)藥、獸藥、抗生素、興奮劑類殘留和毒物、毒素?cái)?shù)百種農(nóng)藥、獸藥、抗生素、興奮劑類殘留和毒物、毒素如氯霉素、磺胺類、硝基呋喃類、毒品、多環(huán)芳烴等等化如氯霉素、磺胺類、硝基呋喃類、毒品、多環(huán)芳烴等等化合物的檢測。合物的檢測。118應(yīng)用示例應(yīng)用示例119119高效液相色譜高效液

39、相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定清開靈復(fù)方中膽酸清開靈復(fù)方中膽酸 采用采用HPLC/MS/MS技術(shù)，從清開靈注射液中，通過分子量技術(shù)，從清開靈注射液中，通過分子量、二級(jí)質(zhì)譜碎片信息定性測定了清開靈復(fù)方中的膽酸。、二級(jí)質(zhì)譜碎片信息定性測定了清開靈復(fù)方中的膽酸。 直接進(jìn)樣實(shí)驗(yàn)。清開靈注射液經(jīng)過初步化學(xué)處理后采用電直接進(jìn)樣實(shí)驗(yàn)。清開靈注射液經(jīng)過初步化學(xué)處理后采用電噴霧（噴霧（ESI）離子源，在負(fù)離子掃描方式下，得到一極質(zhì)）離子源，在負(fù)離子掃描方式下，得到一極質(zhì)譜圖、即分子離子峰譜圖、即分子離子峰M-H-，再用二級(jí)質(zhì)譜（，再用二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）掃）掃描目標(biāo)分子離子的碎片峰。再以相同的

40、實(shí)驗(yàn)條件對標(biāo)準(zhǔn)品描目標(biāo)分子離子的碎片峰。再以相同的實(shí)驗(yàn)條件對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，做出其一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖。進(jìn)行測定，做出其一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖。 120120通過對樣品進(jìn)行分子離子峰的掃描發(fā)現(xiàn)M-H-的峰中有一個(gè)很強(qiáng)的407，根據(jù)樣品處理過程以及對復(fù)方各單味藥材的研究，其應(yīng)該為一有機(jī)酸的負(fù)離子峰，并初步推斷其為膽酸。（膽酸的分子量為408）。如圖所示：通過對照樣品(右)和標(biāo)準(zhǔn)品（左）的二級(jí)質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)其主要碎片峰均吻合較好。 121菲駢吲哚里西定122123124124125125126126127128129130130131131大鼠血清樣品中馬兜鈴酸SPE凈化及HPLC-MS含量測定132研究對象

41、研究對象132133研究對象研究對象133OOCOOHNO2R1R2R1R2AA IHOCH3AA IIHHAA IIIaOHHAA IVaOHOCH3四種馬兜鈴酸結(jié)構(gòu)式134馬兜鈴酸凈化方法馬兜鈴酸凈化方法134純化方法有機(jī)溶劑萃取速度加樣回收率（%）所得樣品純度液液-液萃取液萃取大量乙醚，大量乙醚，少量甲醇少量甲醇較慢較慢97.3105.0無選擇性無選擇性固相萃取固相萃取少量甲醇少量甲醇快速快速87.1105.693.7297.83%常用固相萃取材料為C18，雖然對馬兜鈴酸的富集有一定的效果，但是對強(qiáng)保留物質(zhì)無法有效去除。 61%6%27%6%樣 品 采 集樣 品 前 處 理分 析 測 試數(shù) 據(jù) 處 理 與 報(bào) 告135SPE分離材料的選擇分離材料的選擇135136血清中馬兜鈴酸前處理方法血清中馬兜鈴酸前處理方法136樣品配制活化上樣洗脫淋洗氮?dú)獯蹈?，?00 L甲醇重溶，過0.22 m濾膜備用 取血清，加馬兜鈴酸和內(nèi)標(biāo)物，作為上樣液3 mL甲醇5 mL純水1 mL 樣品3 mL甲醇/水（2:98，v/v）溶液6 mL三氟乙酸/甲醇（4:96，v/v）137SPE洗脫條件考察洗脫條件考察137實(shí)驗(yàn)分別考察了3mL甲酸/甲醇（5:100，v/v）、6 mL甲酸/甲醇（5:1