熒光定量PCR試驗使用方法

1、第一部分一、基本步驟：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對；2、引物、探針的設(shè)計；3、引物探針的合成；4、反應(yīng)體系的配制；5、反應(yīng)條件的設(shè)定；6、反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化；7、熒光曲線和數(shù)據(jù)分析；8、標(biāo)準(zhǔn)品的制備；二、技術(shù)關(guān)鍵：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對；從/網(wǎng)點的genbank中下載所需要的序列。下載的方式有兩種：一為打開某個序列后，直接點擊Save”，保存格式為txt”文件。保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊號。然后，再打開DNAstar軟件中的Editseq軟件，點擊file”菜單中的import

2、”，打開后點擊Save”，保存為：Seq”文件。另一種直接用DNAstar軟件中的Editseq軟件，點擊file”菜單中的Openentrezsequence”,導(dǎo)入后保存為：Seq”文件，保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊號。然后要對所有的序列進行排序。用DNAstar軟件中的Seqman軟件，點擊Sequence”菜單中的add”,選擇要比較的beq”的所有文件，點擊add”或addall”，然后點擊Done”導(dǎo)入要比較的序列，再點擊assemble”進行比較。橫線的上列為一致性序列，所有紅色的堿基是不同的序列，一致的序列用黑色堿基表示。有時要設(shè)定比較序列的開始與結(jié)尾。

3、有時因為參數(shù)設(shè)置的原因，可能分為幾組（contig）,若想全部放在一組中進行比較，就調(diào)整project”菜單下的parameter”,在assembling”內(nèi)的minimummathpercentage”默認設(shè)置為80,可調(diào)彳氐即可。再選擇幾個組，點擊contig”菜單下的reassemblecontig”即可。選擇高低的原則是在保證所分析的序列在一個contig”內(nèi)的前提下，盡量提高minimummathpercentage”的值。有時因此個別序列原因，會出現(xiàn)重復(fù)序列，堿基的缺失或插入，要對contig”的序列的排列進行修改，確保排列是每個序列的真實且排列同源性最好的排列。然后，點擊sav

4、e”保存即可。分析時，主要是觀察是否全部為一致性的黑色或紅色，對于彌散性的紅色是不可用的。2、引物和探針設(shè)計2.1 引物設(shè)計細心地進行引物設(shè)計是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點：行列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；2r增片段長度根據(jù)技術(shù)的不同有所分別：sybrgreenI技術(shù)對片段長度沒有特殊要求；Taqman探針技術(shù)要求片段長度在50bp150bp;跡免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對；跡免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；統(tǒng)型的引物18到24

5、個核昔長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核昔的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55-65C,GC含量在40%60%;物之間的TM相差避免超過2C;物的3'端避免使用堿基A;物的3'端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基。效避免基因組的擴增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子。2.2 Taqman探針設(shè)計一般設(shè)計原則：賽針位置盡可能地靠近上游引物；賽針長度通常在2535bp,Tm值在65-70C,通常比引物TM高5-10C,GC含量在40%7

6、0%。賽針的5'端應(yīng)避免使用堿基Go灌條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量。效確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計好的序列在blast中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。（/BLAST）2.3 TaqmanMGB探針設(shè)計介紹MGB探針的優(yōu)點：2MGB探針較短（14-20bp）,更容易找到所有排序序列的較短片段的保守區(qū)。加片段探針（14-20bp）加上MGB后，Tm值將提高10C,更容易達到熒光探針Tm值的要求。2MGB探針的設(shè)計原則賽針的5'端避免出現(xiàn)G,即使探針?biāo)鉃閱蝹€堿基，與報告基團相相連的G堿基仍可淬滅基團

7、的熒光信號。次primerexpress軟件評價Tm值，Tm值應(yīng)為65-67C。器量縮短TaqmanMGB探針，但探針長度不少于13bp。雅量避免出現(xiàn)重復(fù)白堿基，尤其是G堿基，應(yīng)避免出現(xiàn)4個或4個以上的G重復(fù)出現(xiàn)。源則上MGB探針只要有一個堿基突變，MGB探針就會檢測到（MGB探針將不會與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號）。因此，在進行SNP檢測時，為了檢測到突變子，即TaqmanMGB不與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號，探針目的片段產(chǎn)生熒光信號檢測將探針的突變位點盡量放在中間1/3的地方。注意：為了滿足上述要求的4個條件，探針的突變位點可向3'端移動，但突變位點至少在離3'端2個堿

8、基的前方（即必須確保探針的后兩個堿基是絕對的保守），以進行SNP檢測。反過來，若要進行同類檢測，找的是保守片段區(qū)，探針中不應(yīng)有突變位點。若探針即便是只有13個bp,探針仍不完全保守。有幾個突變，突變位點也應(yīng)靠近探針的5'端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產(chǎn)生熒光信號。另一種方法是設(shè)計簡并探針，也可達到即使是突變，仍可檢測到突變。2.4 實時多重PCR探針的選擇：多重實時PCR的多種含意有兩種：一為選擇保守的探針和引物，利用不同的染料標(biāo)記探針，在檢測時可根據(jù)熒光的顏色來判定不同的產(chǎn)物。另一種為選擇保守的引物，擴增不同長度的目的片段，反應(yīng)中加入SYBRN染料，最后根據(jù)不同目的片

9、段的Tm值來判定不同的物品。多重實時PCR的熒光探針應(yīng)為同一類型：如同時為Taqman探針、或同時為MGB探針、或同時為Beacon探針。在多重PCR中，多重PCR的各個引物之間相互干擾和各個探針之間相互干擾分析：設(shè)計好各對引物和探針后，重新在用DNAstar軟件中的Primerselect軟件，打開保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然后兩兩分別選中所設(shè)計的多重引物或兩兩分別選中所設(shè)計的多重探針后，在report"菜單下primerpairdimers",分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對引物有多少個dimer,并對此對引物用dG值進行評價（通常給出

10、最差的dG值，理論上是dG值越大越好）。3、影響PCR及熒光PCR的其他因素引物的設(shè)計和選擇符合熒光PCR的探針并進行設(shè)計對于實時熒光PCR尤其重要?？梢哉f，不合理的設(shè)計意味著絕對的失敗。但是，好的設(shè)計并不等于好的實驗結(jié)果，影響PCR和熒光PCR的因素非常多，下面擇其重要進行介紹。3.1 引物退火溫度引物的一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50%的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55c至IJ70Co退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5C

11、。設(shè)定Tm有幾種公式。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。大部分計算機程序使用近鄰分析法一一從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。所有oligo軟件會自動計算引物的Tm值。在設(shè)置退火溫度時可以如下進行：以低于估算的Tm5c作為起始的退火溫度，以2c為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5C,就會由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5C?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度先進行5個循環(huán)，

12、然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴謹?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝。3.2 引物濃度引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5陽。較高的引物濃度會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴增。為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD）,通過Beers法則（公式1）計算引物濃度。微摩消光系數(shù)可以使用公式2計算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數(shù)不同，確定引物的精確濃度必須使用計算的消光系數(shù)。這是因為引物較短，堿基組成差異很大。在oligo軟件上可以計算出引物的的消光系數(shù)（OD/mol）和消光系數(shù)

13、的倒數(shù)（gol/OD）。一般商業(yè)合成的引物以O(shè).D.值表示量的多少，在一般情況下，20個堿基長的引物，1個O.D.加100ul水后引物濃度為50pmol/ul（50皿）。也可以用OLIGO軟件，根據(jù)引物的的消光系數(shù)（OD/mol）,計算出一定的工作濃度下，引物的加水量。濃度（H）=A260（OD/ml）淅釋系數(shù)將肖光系數(shù)白倒數(shù)（nmol/OD）舉例：計算某寡核甘酸（溶于1ml水中），取其中的10M稀釋100倍（加入990d）水中。在A260處測吸光度為0.2。計算消光系數(shù)的倒數(shù)為4.8nmol/OD，代入得：濃度=0.2（OD/ml）X100X4.8（nmol/OD）=96nmol/ml=96

14、皿3.3 引物、探針的純度和穩(wěn)定性定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。部分應(yīng)用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截斷序列的產(chǎn)生是因為DNA合成化學(xué)的效率不是100%。這是個循環(huán)過程，在每個堿基加入時使用重復(fù)化學(xué)反應(yīng)，使DNA從3'到5合成。在任何一個循環(huán)都可能失敗。較長的引物，尤其是大于50個堿基，截斷序列的比例很大，可能需要純化。引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100皿。也可以用雙蒸水溶解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20C。以大于10皿濃度溶于TE的引物在-2

15、0C可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15c至IJ30C）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20C保存至少1年，在室溫（15c到30C）最多可以保存2個月。探針即寡核甘酸進行熒光基團的標(biāo)記，標(biāo)記本身有效率的區(qū)別。探針標(biāo)記以后一般應(yīng)該純化，純度高、標(biāo)記效率高的探針不僅熒光值高，且保存時間可以高達一年以上。不同的生物技術(shù)公司探針標(biāo)記效率和純度有很大的區(qū)別。由于反復(fù)凍融易導(dǎo)致探針降解，在確認探針質(zhì)量好的情況下，最好稀釋成2uM（10X），作為工作濃度分裝多支，避光保存。3.4 熱啟動熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管TaqDNA聚合酶的最佳延伸溫度在72C,聚合酶

16、在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設(shè)計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如定點突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效。限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴增。熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入TaqDNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對

17、高通量應(yīng)用。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。Transitor?HotStartTaq酶對于自動熱啟動PCR來說高效可靠。Transitor?HotStartTaq是在常規(guī)Taq酶的基礎(chǔ)上進行了化學(xué)修飾，使得該酶在低溫或常溫下沒有酶活，因此在加樣至PCR擴增前，不會產(chǎn)生由于引物隨機粘連而形成的非特異性擴增。高溫條件下，化學(xué)修飾集團會被剪切，從而釋放酶活。此外，隨著PCR擴增的進行，酶活會

18、被逐步釋放，有效提高擴增效率及產(chǎn)物量。Transitor?HotStartTaqDNA聚合酶在變性步驟的95c保溫過程中要持續(xù)20分鐘才會被釋放到反應(yīng)中，從而完全恢復(fù)聚合酶活性。3.5 鎂離子濃度鎂離子影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性，這會影響產(chǎn)量；再如引物退火，這會影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。最佳的鎂離子濃度對于不同的引物對和模板都不同，但是包含200附dNTP的實時定量PCR,使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液（普通PCR是1.5mM）。較高的游離鎂離子濃度可以增加產(chǎn)量，但也會增加非特異性擴增，降低忠實性。為了確定最佳濃度，普通

19、PCR從1mM到3mM,以0.5mM遞增，進行鎂離子滴定。為減少對鎂離子優(yōu)化的依賴，可以使用Transitor?HotStartTaq酶。Transitor?HotStartTaqDNA聚合酶能夠在比一般的TaqDNA聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內(nèi)保持功能，因此僅需較少的優(yōu)化。3.6 模板質(zhì)量模板的質(zhì)量會影響產(chǎn)量。DNA樣品中發(fā)現(xiàn)有多種污染物會抑制PCR。一些在標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA制備中使用的試劑，如SDS,在濃度低至0.01%時就會抑制擴增反應(yīng)。分離基因組DNA較新的方法包括了DNAZol,一種月瓜去垢劑裂解液，以及FTAGeneGuardSystem,其可以同基質(zhì)結(jié)合，在血液及其他生物樣品中純化

20、貯存DNA。應(yīng)注意進行PCR反應(yīng)的模板質(zhì)量，以增加PCR反應(yīng)的成功率。3.7 模板濃度起始模板的量對于獲得高產(chǎn)量很重要。對大多數(shù)PCR擴增和熒光PCR擴增，104到106個起始目的分子就足以觀測到好的熒光曲線（或在澳化乙錠染色膠上觀察到）。所需的最佳模板量取決于基因組的大?。ㄏ卤恚?。舉例說，100ng到1閔的人類基因組DNA,相當(dāng)于3X104到3X105個分子，足以檢測到單拷貝基因的PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒DNA比較小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg級的。對于一般的檢測樣品，10100ng的量就足夠檢測了。當(dāng)然對模板做一個梯度稀釋，對于定量PCR而言是非常容易，且能分析擴增效率。表1.基因組大小

21、和分子數(shù)目的比例基因組DNASize(bp)*TargetMolecules/聞ofGenomicDNAAmountofDNA(聞)for-10A5MoleculesE.coli4.7X1061.8X1080.001Saccharomycescerevisiae2.0X1074.5X1070.01Arabidopsisthaliana7.0X1071.3X1070.01Drosophilamelanogaster81.6X108一一一56.6X1050.5Homosapiens一一一92.8X109一一一53.2X1051.0Xenopuslaevis一一一92.9X10953.1X1051.

22、01.0Musmusculus一一一93.3X10952.7X1051.0Zeamays101.5X106.0X1042.0pUC18plasmidDNA32.69M0113.4X10-61X103.8 防止殘余（Carry-over）污染PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴增。當(dāng)前一次擴增產(chǎn)物用來進行新的擴增反應(yīng)時，會發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源（非殘余污染）。可以在PCR過程中使用良好的實驗步驟減少殘余污染。使用帶濾芯的移液管可以阻止氣霧劑進入eppendorf管內(nèi)。為PCR

23、樣品配制和擴增后分析設(shè)計隔離的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套。總是使用不含有模板的陰性對照檢測污染。使用預(yù)先混合的反應(yīng)成分，而不是每個反應(yīng)的每個試劑單獨加入。一種防止殘余污染的方法是使用尿喀咤DNA糖基化酶（UDG）。這種酶（也稱為尿喀咤-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿喀咤。在擴增過程中將脫氧尿喀咤替換為胸腺喀咤使得可以把前面的擴增產(chǎn)物同模板DNA區(qū)分開來。因為前面的擴增產(chǎn)物對UDG敏感，所有可以在PCR前對新配制的反應(yīng)用UDG處理以破壞殘余產(chǎn)物。第二部分1、高產(chǎn)量，特異和靈活的定量PCR試劑體系影響PCR的因素如此之多，您有時很難區(qū)分是什么導(dǎo)致您的實驗結(jié)果不佳。降低實驗的不穩(wěn)定因素是使

24、用優(yōu)質(zhì)可靠的產(chǎn)品。使用優(yōu)質(zhì)、性能可靠的熱啟動酶、優(yōu)質(zhì)的dNTP、Mg離子、UNG/dUTP防污染系統(tǒng)預(yù)混成的定量PCR試劑體系，最大程度的降低了反應(yīng)變量，提高了實驗的可重復(fù)性和可靠性。您還需要進行以下步驟的準(zhǔn)備：設(shè)計引物和探針、合成引物和探針、正確儲藏、得到高質(zhì)量的模板，隨后，您僅需要進行退火溫度的優(yōu)化，就能得到好的實驗結(jié)果。FQPCRMASTERMix-UDG（hotstart）同競爭對手的定量PCR體系相比提供了更優(yōu)異的結(jié)果。使用這種產(chǎn)品，您可以在您的PCR中得到更好特異性和更高的靈敏度，同時可以靈活地選擇您所喜歡的擴增條件，檢測方法和設(shè)備。實時定量PCR是快速增長的PCR方法，它可以精確

25、、可重復(fù)地定量起始物質(zhì)。FQPCRMASTERMix-UDG（hotstart）是一種方便使用的反應(yīng)混合液，為定量分析進行了優(yōu)化。它包含了熒光PCR所必須的成分（如緩沖液，dNTP,聚合酶）。只需加入您的模板，擴增引物和熒光標(biāo)記探針。您就可以得到實時qPCR所需的特異性和靈活性。您可以利用成套的hotstartTaq酶kit（A2010A0106），來配制不含有UNG/dUTP防污染系統(tǒng)的熱啟動熒光PCR體系。您也可以選擇hotstartTaq酶，UNG酶和dNTPS,來配制含有UNG/dUTP防污染系統(tǒng)的熱啟動熒光PCR體系。您可以從實驗角度得到多種選擇，得到高產(chǎn)量、特異和靈活的定量PCR試

26、劑體系！高產(chǎn)量和特異性的擴增FQPCRMASTERMix-UDG（hotstart）提供了強大的PCR擴增，可以使用多個模板組。所使用的TaqDNA聚合酶具有熱啟動特性。這極大地降低和消除了錯誤配對和非特異性擴增，使您得到較高產(chǎn)量，并增加特異性。整合的UDG（尿甘酸DNA糖基化酶）防止殘余污染的能力防止了非模板DNA的擴增，從而降低了假陽性，使結(jié)果更可靠。在產(chǎn)量和靈敏度方面，QuantitativePCRMASTERMix-UDG（hotstart）的靈敏度極高（閾循環(huán)）。您可以更精確地定量低拷貝的基因，并在較寬的目的濃度范圍內(nèi)檢測線性劑量反應(yīng)。高度靈活性除了靈敏度和特異性外，Universa

27、lPCRMasterMixKit在分析設(shè)置，檢測方法和設(shè)備上給您提供了較高的自由度。使用UniversalPCRMasterMixKit,您可以：對擴增的不同模板優(yōu)化鎂離子濃度，由于提供了WW口的氯化鎂，所以您可以方便地配置Mix體系?？梢愿`活的進行普通PCR和熒光PCR?？梢栽诙喾N設(shè)備上使用，如ABIPrism?7700,ABIGeneAmp?5700和Bio-Rad的I-Cycler?？梢岳枚喾N檢測方法的優(yōu)點，包括TaqMan?探針和MolecularBeacon,您不必局限于特定的試劑盒。您還可以靈活的選擇進行自配熒光PCR體系，不論是含UNG/dUTP防污染系統(tǒng)還是不含該系統(tǒng)的。2

28、、反應(yīng)體系配制：A2010A0101試劑盒：（探針體系）FQ-PCRMasterMix-UNG混合物（2X）25ul（終濃度為1X）;上游引物（終濃度為50900nM）（可先設(shè)200nM）,下游引物（終濃度為50900nM）（可先設(shè)200nM）;探針（終濃度為200nM）;待檢樣品5ul（終濃度為10100ng）;無菌去離子水補足，使總體積達到50ul。您可以選擇熒光染料SYBGREEN體系，具體請參照說明書。您可靈活使用20-50ul間其他體積，注意保證終濃度相同。A2010A0106試劑盒：反應(yīng)體系終濃度（自配熱啟動熒光系統(tǒng)）：1-2U的hotstartTaq酶、3-5.5mM的Mg2+、

29、0.2mM的dNTPs、1XPCRbuffer（A2010A0106）;50-900nM的上游引物（可先設(shè)200nM）、50-900nM的下游引物（可先設(shè)200nM）、200nM的探針、通常取2-5ul的模板，無菌去離子水補足，反應(yīng)總體積通常為20-50ul自配熱啟動熒光一UNG體系：1-2U的Taq酶、1XPCRbuffer、2.5-4.0mM的Mg2+（A2010A0105）;0.2-1U的UNG酶（A2010A0107）（可先設(shè)為0.5U）、0.2mM的d（A,C,G）TPs、0.2-0.4mMdUTP（要調(diào)整）(A2010A0108);50-900nM的上游引物(可先設(shè)200nM)、5

30、0-900nM的下游引物(可先設(shè)200nM)、200nM的探針、通常取2-5ul的模板、反應(yīng)總體積通常為2050ul。3、反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化：使用高產(chǎn)量，特異和靈活的定量PCR試劑體系FQPCRMASTERMix-UDG(hotstart),優(yōu)化參數(shù)最少。您只需要優(yōu)化退火溫度，就可以得到更靈敏、更可靠的定量結(jié)果。對于特殊結(jié)構(gòu)的熒光PCR,您可以優(yōu)化引物濃度，來得到更特異或更靈敏的結(jié)果。使用通用PCRMasterMix試劑盒進行反應(yīng)體系的配制，可以適合更多的反應(yīng)體系，如mRNA的普通RT-PCR檢測，適用于合成質(zhì)粒的PCR,同時也適用于熒光PCR,范圍更寬。采用成套的hotstartTaq酶k

31、it(A2010A0106),該試劑盒中含有進行熱啟動熒光核心試劑盒的所有成分，也降低了選擇純度不夠或不合適產(chǎn)品的風(fēng)險。您需要根據(jù)以下原則進行優(yōu)化：1、您需要對酶量和鎂離子濃度進行優(yōu)化。酶的推薦反應(yīng)濃度為1.25-1.5U(50ul),必要時可在1-2U之間探討酶的最佳條件；Mg離子推薦濃度普通PCR終濃度為13mM,熒光PCR終濃度為3-5.5mM，請在該范圍內(nèi)探討最佳條件。2、試劑盒中提供的dNTP已經(jīng)預(yù)混，能夠充分保證產(chǎn)品質(zhì)量和PCR的忠實性。dNTP選擇經(jīng)典的0.2mM的濃度即可。3、另外，上游引物和下游引物濃度可先設(shè)為200nM。當(dāng)結(jié)果不理想時，可以在50nM-900nM之間進行探討

32、。4、如選用Taqman探針，探針濃度可設(shè)為200nM,不須探討。選擇其他種類的探針需根據(jù)要求設(shè)置探針濃度。5、可以先用推薦的反應(yīng)條件，如果結(jié)果不佳，可根據(jù)引物、探針設(shè)計的具體情況適合的退火溫度，退火時間和循環(huán)數(shù)。6、DNA模板的添加量通常在100ng以下，因不同種類的DNA模板中含有的靶基因的拷貝數(shù)不同，必要時可進行梯度稀釋，確定最佳的DNA模板添加量。如果欲進行2StepRT-PCR反應(yīng)的第二步PCR擴增反應(yīng)，第一步的RT反應(yīng)液作為DNA模板時的添加量不要超過PCR反應(yīng)液總體積的10%。7、稀釋所有探針、引物或配制模板請使用無菌雙蒸水或Tris溶液。所有反應(yīng)容器應(yīng)保證無菌無酶無熱源。如進行

33、RNA反應(yīng)應(yīng)采用無RNA降解酶的水和容器進行操作。如采用hotstartTaq酶來配制與A2010A0101相同的熱啟動熒光體系(含UNG/dUTP防污染體系)，您可以選擇A2010A0105,A2010A0107和A2010A0108進行。與A2010A0106不同的是除了以上的優(yōu)化步驟外，還增加了對UNG/dUTP系統(tǒng)進行探討。建議先使用A2010A0106優(yōu)化好產(chǎn)品體系后，再來優(yōu)化該防污染系統(tǒng)。0.2-1U的UNG酶(A2010A0107)(可先設(shè)為0.5U)、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP(A2010A0108)。反應(yīng)條件如酶量、Mg離子等都已經(jīng)調(diào)好(參

34、照A2010A0106)，您可以固定d(A,C,G)TPs的濃度為0.2mM,并設(shè)定UNG濃度為0.5U(50ul),dUTP濃度也設(shè)為0.2mM,初步來看反應(yīng)結(jié)果。如結(jié)果不理想可調(diào)整dUTP濃度(上調(diào))。直至得到滿意結(jié)果。并可進行防污染能力測試(用含U的擴增片斷進行)。請參照3:影響PCR及熒光PCR的其他因素進行優(yōu)化。總之，優(yōu)化的指標(biāo)越多，實驗的不確定性就越大。避免在操作中引入更大的不確定性和不可重復(fù)性。可參照的QPCRMASTERMix-UDG(hotstart)使用注意事項。4、適用的熒光儀器、實驗設(shè)計、熒光曲線和數(shù)據(jù)分析；目前市場上有許多種實時PCR儀：其中包括ABI7700,ABI

35、7900,ABI7000(AppliedBiosystems);MX4000(Stratagene);iCycler(Bio-Rad);Smartcycler(Cepheid);Robocycler(MJResearch);Lightcycler(Roche);ROTORGENE(CORBERT);杭州博日(Linegene)。不同的儀器使用方法有所區(qū)別，但都具備對Taqman探針和sybgreen染料法的檢測波長和檢測能力。QPCRMASTERMix-UDG（hotstart）和通用PCRMasterMix均適合在這些儀器上進行使用。為確保實驗數(shù)據(jù)的有效性，每次實驗都設(shè)陰性對照和4個標(biāo)準(zhǔn)品，

36、每個樣品都平行做2個復(fù)孔。基線或閥值的設(shè)定通常是以10-15個循環(huán)的熒光值作為閥值，也可以以陰性對照熒光值的最高點作為基線。'可題可能原因建議解決方法定量PCFDNA模板質(zhì)量不提高模板質(zhì)量，諸如DMSOSDS和甲酰胺之類的試劑會抑無擴增產(chǎn)量好，含有抑制劑制TaqDNAm合酶。如果懷疑污染了抑制劑，可以使用乙或很少的擴醇沉淀DNAVt日.里PCR引物設(shè)計較避免在引物3'端含有互補序列。避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)1塞構(gòu)的序列。設(shè)計Tm類似的引物。保針設(shè)計較差對探針序列進行blast比對，設(shè)計符H要求的探針PCR引物合成較用普通電泳法，看引物的設(shè)計和合成質(zhì)量，是否有目的條塞帶出現(xiàn)。英光探

37、針無功能確保探針設(shè)計的有效性和fluorophore和quencher的存在。用DNase處理TaqMan探針，校驗天光是否增強。必要的話設(shè)計和合成探針。模板濃度太低使用10A4拷貝的靶序列，以在25到30個循環(huán)中獲得信號?？惦x子濃度太低從3mMiij5mM間隔0.5mM進彳口一系列反應(yīng)，確定對于每個模板和引物對的最佳鎂離子濃度。FQ-PCMasterMix-UNG試劑盒不需優(yōu)化鎂離子濃度。引物濃度太低最佳引物濃度介于0.1M到0.5科M之間。為了精確確定引物濃度，在260nm測量光號度，然后使用光吸收值和消光系數(shù)計算濃度。（見公式1）選擇優(yōu)質(zhì)酶進行選擇hotstartlaq酶進行擴增，可提局

38、靈敏度，增加產(chǎn)忙增量，降低干擾因素退火溫度太高使用表4的公式估算Tm,把退火溫度設(shè)定為彳氐于Tm5Co因為這些公式只是估算Tm值，所后真止的退火溫度實際會高些或低些。反應(yīng)物中有小明在各個反應(yīng)物中存在不明物質(zhì)對PCRS行干擾，對任何實物干擾驗樣品或試劑，均應(yīng)米用無菌無酶無熱源的離心管進行試劑的分裝和使用。mmPCR叫弓1物、探針設(shè)計反應(yīng)成分是否漏加；確7E反應(yīng)條件是否合適；性對照無擴合格；原來合成正常標(biāo)本是否能擴增來判斷是對照的問題還是體系的問增曲線（針質(zhì)量已經(jīng)驗證。題；對:已經(jīng)優(yōu)需確認：確認體系：1、引物是否降解（看力增產(chǎn)物是否可電泳出）化好的體來判斷引物和酶功能；2、探針是否B1解（用DNa

39、se處理系）TaqMan探針，校驗天光是否增強）。1儀器是否止常工作訓(xùn)PCR陰性對照一直有擴增曲線模板或PCR殘余虧染隔離污染來源，更換試劑。使用UNG/dUTFW污染系統(tǒng)。使用專用的精致移液器。在尢DNAE域準(zhǔn)備反應(yīng)，使用抗氣溶膠的吸頭。體系有問題的濃度/、對，Mg離子濃度/、對定量PCF（染料法）出現(xiàn)非特異桁號弓1物二聚體多檢查引物設(shè)計和合成環(huán)節(jié)，必要時更改引物更換熱啟動酶熱啟動酶能增加反應(yīng)的特異性，提高靈敏度設(shè)定檢測信號時的溫度在更高的溫度卜-檢測熒光信號（此時引物二聚體已經(jīng)解鏈）MMRT-PCF無擴增產(chǎn)量相對熒光信號小于等于背景或沒有模板對照沅cDNA合成cDNA合成溫度太高降低保溫溫度反轉(zhuǎn)錄cDNAT物被二級結(jié)構(gòu)封閉提高保溫溫度。重新設(shè)計引物RNA被損害或降解必要的話更換RNARNAse污染維持無菌條件；加入RNase抑制劑英光探針無功能確保探針設(shè)計的有效性和fluorophore和quencher的存在。用DNase處理TaqMan探針，校驗天光是否增強。必