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1、染色體核型分析70859 一、名詞解釋一、名詞解釋 二、染色體標(biāo)本制備二、染色體標(biāo)本制備 三、染色體核型分析三、染色體核型分析實(shí)驗(yàn)耗材前期處理實(shí)驗(yàn)步驟玻片標(biāo)本質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)、合格指標(biāo)染色體核型排列核型檢測(cè)的可重復(fù)性二、染色體標(biāo)本制備 前期處理前期處理 樣品要求：對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，狀態(tài)良好，緊密度高，折光性好，細(xì)胞量T25 / 60 mm平皿 差速貼壁法去除MEF（ KSR培養(yǎng)體系除外） 終止培養(yǎng)前12小時(shí)，加入秋水仙素秋水仙素（100ug/ml），最終濃度為0.10.2ug/ml。作用：破壞紡錘體防護(hù)：有劇毒、無揮發(fā)性因素：時(shí)間、濃度二、染色體標(biāo)本制備固定固定細(xì)胞收獲細(xì)胞收獲制片制片預(yù)固定預(yù)固定低

2、滲處理低滲處理 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟二、染色體標(biāo)本制備細(xì)胞收獲細(xì)胞收獲制片制片固定固定預(yù)固定預(yù)固定低滲處理低滲處理消化并收集細(xì)胞至離心管，吹打成單細(xì)胞懸液，250 g，5 min離心，棄上清 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟二、染色體標(biāo)本制備細(xì)胞收獲細(xì)胞收獲制片制片固定固定預(yù)固定預(yù)固定低滲處理低滲處理加入37預(yù)熱的低滲液（低滲液（0.075 mol/L）5 ml，吹打至均勻，37水浴15-20 min。 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟二、染色體標(biāo)本制備細(xì)胞收獲細(xì)胞收獲制片制片固定固定預(yù)固定預(yù)固定低滲處理低滲處理加入37預(yù)熱的低滲液低滲液（0.075 mol/L）5 ml，吹打至均勻，37水浴15-20 min。 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步

3、驟配制： 0.075 mol/L KCl溶液作用：低滲作用因素：時(shí)間、溫度、濃度二、染色體標(biāo)本制備細(xì)胞收獲細(xì)胞收獲制片制片固定固定預(yù)固定預(yù)固定低滲處理低滲處理 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟離心棄上清，將細(xì)胞沉淀震蕩懸浮或氣泡吹打法輕柔地重懸細(xì)胞。沿管壁緩慢加入固定液固定液0.5-1.0 mL，邊滴加邊震蕩均勻，靜置5 min后離心棄上清。二、染色體標(biāo)本制備細(xì)胞收獲細(xì)胞收獲制片制片固定固定預(yù)固定預(yù)固定低滲處理低滲處理 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟離心棄上清，將細(xì)胞沉淀震蕩懸浮或氣泡吹打法輕柔地重懸細(xì)胞。沿管壁緩慢加入固定液固定液0.5-1.0 mL，邊滴加邊震蕩均勻，靜置5 min后離心棄上清。配制：甲醇：冰乙酸= 3

4、：1，現(xiàn)用現(xiàn)配。作用：固定并維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性防護(hù)：甲醇毒性，冰乙酸刺激性和腐蝕性二、染色體標(biāo)本制備細(xì)胞收獲細(xì)胞收獲制片制片固定固定預(yù)固定預(yù)固定低滲處理低滲處理 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟（1）加入3ml固定液固定液，靜置30min，離心棄上清；（2）再次加入3ml固定液固定液，吹打均勻并靜置30min二、染色體標(biāo)本制備細(xì)胞收獲細(xì)胞收獲制片制片固定固定預(yù)固定預(yù)固定低滲處理低滲處理 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟離心棄上清液，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量情況，加入12 mL固定液，吹打細(xì)胞制成懸液，懸液呈微白色時(shí)為最佳。二、染色體標(biāo)本制備細(xì)胞收獲細(xì)胞收獲制片制片固定固定預(yù)固定預(yù)固定低滲處理低滲處理 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容用滴管吸取細(xì)胞懸

5、液，高空滴在冰凍玻片冰凍玻片上，立即在酒精燈的火焰下過火幾次，置80烤箱中烤片2h。二、染色體標(biāo)本制備細(xì)胞收獲細(xì)胞收獲制片制片固定固定預(yù)固定預(yù)固定低滲處理低滲處理 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟用滴管吸取細(xì)胞懸液，高空滴在冰凍玻片冰凍玻片上，立即在酒精燈的火焰下過火幾次，置80烤箱中烤片2h。要求：潔凈、冰凍處理：逐片清洗（洗潔精超聲波自來水純水），95%乙醇浸泡24 h，純水逐片刷洗，放置于裝有純水的器皿中，4 保存。二、染色體標(biāo)本制備細(xì)胞收獲細(xì)胞收獲制片制片固定固定預(yù)固定預(yù)固定低滲處理低滲處理 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟預(yù)熱胰蛋白酶胰蛋白酶消化25-30s，Giemsa染色10min。清水沖洗染液，用吹風(fēng)機(jī)吹干。

6、二、染色體標(biāo)本制備細(xì)胞收獲細(xì)胞收獲制片制片固定固定預(yù)固定預(yù)固定低滲處理低滲處理 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟預(yù)熱胰蛋白酶胰蛋白酶消化25-30s，Giemsa染色10min。清水沖洗染液，用吹風(fēng)機(jī)吹干。要求：0.25%，pH6.87.2作用：去除染色體上的蛋白質(zhì)，便于染色。配制： Giemsa原液：磷酸緩沖液（pH 7.4）= 1：9，現(xiàn)用現(xiàn)配。三、染色體核型分析 玻片標(biāo)本質(zhì)量評(píng)價(jià)玻片標(biāo)本質(zhì)量評(píng)價(jià)玻片顏色藍(lán)紫色 玫紅色 著色淺解決方案配制新的染液；適當(dāng)提高胰酶消化玻片的時(shí)間。三、染色體核型分析 玻片標(biāo)本質(zhì)量評(píng)價(jià)玻片標(biāo)本質(zhì)量評(píng)價(jià)細(xì)胞密度過密 適中 過稀解決方案制備玻片時(shí)，對(duì)每一個(gè)樣品都先進(jìn)行試片，并在鏡下觀

7、察細(xì)胞密度，從而調(diào)整懸液密度。三、染色體核型分析 玻片標(biāo)本質(zhì)量評(píng)價(jià)玻片標(biāo)本質(zhì)量評(píng)價(jià)分裂相密度足夠 稀少解決方案適當(dāng)提高固定液中冰醋酸比例；制備較多的玻片三、染色體核型分析 玻片標(biāo)本質(zhì)量評(píng)價(jià)玻片標(biāo)本質(zhì)量評(píng)價(jià)分裂相形態(tài)-緊密度過密 適中 過散解決方案過密：適當(dāng)提高固定液中冰醋酸比例；過散：適當(dāng)降低固定液中冰醋酸比例。三、染色體核型分析 玻片標(biāo)本質(zhì)量評(píng)價(jià)玻片標(biāo)本質(zhì)量評(píng)價(jià)分裂相形態(tài)過密 適中 過散解決方案過密：適當(dāng)提高固定液中冰醋酸比例，增加滴片高度；過散：適當(dāng)降低固定液中冰醋酸比例，減小滴片高度。三、染色體核型分析 玻片標(biāo)本質(zhì)量評(píng)價(jià)玻片標(biāo)本質(zhì)量評(píng)價(jià)分裂相形態(tài)解決方案盡量將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液；滴片時(shí)勿重復(fù)滴加同一區(qū)域。重疊三、染色體核型分析 玻片標(biāo)本質(zhì)量評(píng)價(jià)玻片標(biāo)本質(zhì)量評(píng)價(jià)染色體形態(tài)適中 短小 過長(zhǎng) 扭曲交聯(lián) 消化過度三、染色體核型分析 計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn) 合格指標(biāo)合格指標(biāo)分裂相需完整獨(dú)立，染色體不過于松散，周圍無其他距離很近的分裂相。染色體形態(tài)適中，不過度短小或纖長(zhǎng)，染色體彼此間無交聯(lián)纏繞或者交聯(lián)的染色體能明確的區(qū)分。染色體G顯帶普遍較清晰，質(zhì)檢人員能夠精確的判斷核型位置。計(jì)數(shù)30個(gè)分裂相，正常比例50% 數(shù)量是否異常暫不涉及核型排列 結(jié)構(gòu)是否異常三、染色體核型分析 染色體核型排列染色體核型排列三