E鈣黏蛋白及其相關(guān)復(fù)合物通過miRNA調(diào)控細(xì)胞行為

1、REGULATION OF CELL BEHAVIOR李曉莉、丁雅婷李曉莉、丁雅婷1簡介2方法和內(nèi)容3結(jié)果與討論4結(jié)論1簡介2方法和內(nèi)容3結(jié)果與討論4結(jié)論腫瘤與癌癥腫瘤與癌癥簡介圖解圖解250年人類抗癌史年人類抗癌史1簡介2方法和內(nèi)容3結(jié)果與討論4結(jié)論腫瘤與癌癥腫瘤與癌癥Antonis Kourtidis2015.8Distinct E-cadherin-based complexes regulate cell behavior through miRNA processing or Src and p120 catenin activity研究背景研究背景n Cadherin：鈣粘附蛋白：

2、鈣粘附蛋白鈣依賴型跨膜糖蛋白，為細(xì)胞鈣依賴型跨膜糖蛋白，為細(xì)胞-細(xì)胞識別、組織形態(tài)發(fā)細(xì)胞識別、組織形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞生、細(xì)胞-細(xì)胞粘附及維持細(xì)胞膜完整性所需。細(xì)胞粘附及維持細(xì)胞膜完整性所需。E- Cadherin：癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制物。其表達(dá)與惡性腫：癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制物。其表達(dá)與惡性腫瘤的分化程度、侵襲力、轉(zhuǎn)移能力負(fù)相關(guān)。瘤的分化程度、侵襲力、轉(zhuǎn)移能力負(fù)相關(guān)。n P120 CATENIN：P120連環(huán)蛋白連環(huán)蛋白Src磷酸化的底物磷酸化的底物E- CadherinE- Cadherin的復(fù)合物的基本組成部的復(fù)合物的基本組成部分，通過相互作用，防止細(xì)胞內(nèi)吞，分，通過相互作用，防止細(xì)胞內(nèi)吞，維持連接復(fù)合物穩(wěn)

3、定性。維持連接復(fù)合物穩(wěn)定性。調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)Rho-GTPRho-GTP酶的活性，從而調(diào)節(jié)肌酶的活性，從而調(diào)節(jié)肌動球蛋白細(xì)胞骨架的形成。動球蛋白細(xì)胞骨架的形成。誘導(dǎo)細(xì)胞非貼壁誘導(dǎo)細(xì)胞非貼壁依賴性生長依賴性生長EGFR, HER2 EGFR, HER2 或或 Src Src 誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移必不可少的中間體移必不可少的中間體E- CadherinE- Cadherin和和P120P120一方面維持上皮粘附和細(xì)胞調(diào)控動態(tài)平衡，一方面維持上皮粘附和細(xì)胞調(diào)控動態(tài)平衡，另一方面存在致癌性。另一方面存在致癌性。摘要摘要n PLEKHA7蛋白蛋白 位于頂端黏著小帶（位于頂端黏著小帶（ZA） 動員動員DRO

4、SHA酶和酶和DGCR8聚集到頂端黏著小帶（聚集到頂端黏著小帶（ZA）部位）部位 PLEKHA7-微處理器復(fù)合物和微處理器復(fù)合物和Pri-miRNA形成沉淀復(fù)合物，具有形成沉淀復(fù)合物，具有控制其加工的活性?？刂破浼庸さ幕钚?。 調(diào)節(jié)不同的調(diào)節(jié)不同的miRNA水平，尤其是水平，尤其是miR-30b，從而抑制基底部分細(xì)，從而抑制基底部分細(xì)胞轉(zhuǎn)移標(biāo)記物的表達(dá)，如胞轉(zhuǎn)移標(biāo)記物的表達(dá)，如SNAI1, MYC 和和CCND1。摘要摘要1簡介3結(jié)果與討論4結(jié)論2方法和內(nèi)容實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容 一、細(xì)胞培養(yǎng)、試劑和化學(xué)品準(zhǔn)備 CACO2（結(jié)腸上皮細(xì)胞）、 MDCK（犬腎上皮細(xì)胞）、HEK293FT（人胚胎腎細(xì)胞）、P

5、hoenix-Ampho 細(xì)胞 二、結(jié)構(gòu)體構(gòu)建 人全長PLEKHA7的克隆 切除PLEKHA7-Myc片段子克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LZRS上獲得LZRS-PLEKHA7-Myc結(jié)構(gòu)體 PLEKHA7-GFP結(jié)構(gòu)體、Themp120-1A,mp120-4A,mp120-8F和mp120-ARM1 、 adSNAI1 和 adGFP腺病毒、YFP-PBD（質(zhì)粒11407）和GFP-rGBD （質(zhì)粒26732）結(jié)構(gòu)體的獲得實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容 三、shRNAs, siRNAs, 抗miRNAs 和 miR-模擬物準(zhǔn)備 使用Lipofectamine 2000或脂質(zhì)體RNAiMAX轉(zhuǎn)染siRNAs, 抗miR

6、NAs 和 miR-模擬物 慢病毒的shRNA感染HEK 293FT細(xì)胞Phoenix-Ampho細(xì)胞中制備逆轉(zhuǎn)錄病毒 使用的抗miRNAs （ anti-hsa-miR-30a, ID MH11062; anti-hsa-let-7g, ID MH11758; anti-hsa-miR-30b, ID MH10986; anti-hsa-miR-24, ID MH10737） 設(shè)置陽性對照、陰性對照 四、抗體制備實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容 五、免疫熒光檢測 MDCK和Caco2細(xì)胞培養(yǎng)至發(fā)生極化洗滌、固定熒光染色標(biāo)記的二抗 API 共染色觀察細(xì)胞核激光共聚焦顯微鏡觀察 六、免疫印跡分析 全細(xì)胞提取物用蛋

7、白酶和磷酸抑制劑處理細(xì)胞裂解液全速離心5min蛋白提取物進(jìn)行SDS-PAGE 七、免疫組織化學(xué)分析 乳腺組織樣本、腎組織樣品匿名獲取載玻片組織置于梯度乙醇的二甲苯和再水化中進(jìn)行熱抗原修復(fù)孵育第一抗體用抗兔或抗小鼠標(biāo)記的聚合物過氧化物酶處理實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容 八、結(jié)電阻測量 電動細(xì)胞襯底阻抗系統(tǒng)測定Caco2細(xì)胞的阻抗： 4,000Hz頻率下每180秒測量交界阻抗、細(xì)胞密度64000Hz頻率下測量。 九、軟瓊脂培養(yǎng)分析 培養(yǎng)基制備 CACO2細(xì)胞培養(yǎng)直至克隆可見結(jié)晶紫染色掃描克隆計(jì)數(shù) 十、鈣離子交換測定 Caco2細(xì)胞培養(yǎng)DMSO或諾考達(dá)唑預(yù)處理培養(yǎng)于不含鈣離子培養(yǎng)基細(xì)胞生長并定型正常培養(yǎng)基培養(yǎng)再次

8、用DMSO或諾考達(dá)唑分別處理至生長為圓形測定時(shí)間實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容 十一、免疫沉淀反應(yīng) 細(xì)胞培養(yǎng)蛋白酶和磷酸酶抑制劑處理細(xì)胞裂解物與標(biāo)記的抗體培養(yǎng)過夜過柱洗脫 十二、蛋白質(zhì)組學(xué)分析 細(xì)胞培養(yǎng)至極化預(yù)處理酶裂解細(xì)胞交聯(lián)的裂解物一起溫育珠標(biāo)記的抗體過夜納米液相色譜 - 電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析樣品 十三、總RNA分離和實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄qRT-PCR 細(xì)胞裂解分離mRNA和miRNA 總的RNA濃度通過NanoDrop分光光度計(jì)來確定。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容 十四、RNA免疫沉淀反應(yīng) 十五、細(xì)胞分離分離細(xì)胞核部分 細(xì)胞裂解離心（300g5min4）沉淀細(xì)胞核RIPA核沉淀溶解離心溶胞液一半用于SDS-PAG，另一半用于

9、提取總RNA 十六、基于鄰位連接技術(shù)(PLA) 檢測 十七、體外miRNA轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物加工 總cDNA用于pri-miR-30b的擴(kuò)增 pri-miR-30b中的cDNA亞克隆到SKC載體中（T7啟動子下游EcoRI和XhoI位點(diǎn)之間）引物為pri-30bF-XhoI、 pri-30bR-EcoRI敲除PLEKHA7（同時(shí)設(shè)置對照）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及純化實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容 十八、原位雜交技術(shù)（ISH） 探針：人PRI-MIR-30B，ACD，415331 陽性對照探針：HS-PPIB，ACD，313906 陰性對照探針：DAPB，ACD，310048 十九、miRNA的NanoString分析（數(shù)字基因定量

10、技術(shù)） 分離總RNA分析全部735個(gè)miRNA數(shù)字分析儀收集資料 二十、Northern雜交 探針：HSA-MIR-30B miRCURY LNA檢測探針、DIG標(biāo)記、Exiqon，18143-15；U6 HSA/ MMU/ RNO，miRCURY LNA檢測探針，標(biāo)記的DIG，Exiqon，99002-011簡介4結(jié)論2方法和內(nèi)容3結(jié)果與討論1.極化極化上皮細(xì)胞中上皮細(xì)胞中P120相關(guān)相關(guān)組分的分布組分的分布D. ES、iPS細(xì)胞和細(xì)胞和MEF細(xì)胞生長曲細(xì)胞生長曲線線重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到29個(gè)G418抗性克隆，挑選出6克隆。其中4個(gè)克隆具有與胚胎干細(xì)胞極其相似的形態(tài)和增殖特性。1.極化極化上皮細(xì)胞中

11、上皮細(xì)胞中P120相關(guān)相關(guān)組分的分布組分的分布2.蛋白質(zhì)組學(xué)確定極化上皮細(xì)胞中蛋白質(zhì)組學(xué)確定極化上皮細(xì)胞中兩種不同的連接復(fù)合物兩種不同的連接復(fù)合物2.蛋白質(zhì)組學(xué)確定極化上皮細(xì)胞中蛋白質(zhì)組學(xué)確定極化上皮細(xì)胞中兩種不同的連接復(fù)合物兩種不同的連接復(fù)合物3.PLEKHA7抑制抑制非貼壁非貼壁依賴性生長依賴性生長以及相關(guān)轉(zhuǎn)以及相關(guān)轉(zhuǎn)化化標(biāo)記的表達(dá)標(biāo)記的表達(dá)A.用用RTPCR對對IPS細(xì)胞、細(xì)胞、ES細(xì)胞、細(xì)胞、MEFS細(xì)胞中在細(xì)胞中在胚胎干細(xì)胞標(biāo)記基因的分析胚胎干細(xì)胞標(biāo)記基因的分析。所。所用引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增內(nèi)源性基因，而不是轉(zhuǎn)入用引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增內(nèi)源性基因，而不是轉(zhuǎn)入的基因拷貝。的基因拷貝。IPS-MEF10和

12、IPS-MEF4克隆可以表達(dá)大多數(shù)標(biāo)記基因；SOX2只在 IPS-MEF10-6中表達(dá)。3.PLEKHA7抑制抑制非貼壁非貼壁依賴性生長依賴性生長以及相關(guān)轉(zhuǎn)以及相關(guān)轉(zhuǎn)化化標(biāo)記的表達(dá)標(biāo)記的表達(dá)3.PLEKHA7抑制抑制非貼壁非貼壁依賴性生長依賴性生長以及相關(guān)轉(zhuǎn)以及相關(guān)轉(zhuǎn)化化標(biāo)記的表達(dá)標(biāo)記的表達(dá)4.基底復(fù)合物促進(jìn)細(xì)胞基底復(fù)合物促進(jìn)細(xì)胞生長和生長和相關(guān)標(biāo)記物相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)的表達(dá)4.基底復(fù)合物促進(jìn)細(xì)胞基底復(fù)合物促進(jìn)細(xì)胞生長和生長和相關(guān)標(biāo)記物相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)的表達(dá)4.基底復(fù)合物促進(jìn)細(xì)胞基底復(fù)合物促進(jìn)細(xì)胞生長和生長和相關(guān)標(biāo)記物相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)的表達(dá)5.PLEKHA7通過的通過的miRNA抑制抑制SNAI

13、1，MYC和和CCND1表達(dá)表達(dá)5.PLEKHA7通過的通過的miRNA抑制抑制SNAI1，MYC和和CCND1表達(dá)表達(dá)6.黏著小帶與微處理器復(fù)合物的聯(lián)系黏著小帶與微處理器復(fù)合物的聯(lián)系A(chǔ).小鼠尾尖成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的小鼠尾尖成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的IPS細(xì)胞形態(tài)與胚胎肝細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)與胚胎肝細(xì)胞形態(tài)相似形態(tài)相似，幾乎無法區(qū)分幾乎無法區(qū)分6.黏著小帶與微處理器復(fù)合物的聯(lián)系黏著小帶與微處理器復(fù)合物的聯(lián)系6.黏著小帶與微處理器復(fù)合物的聯(lián)系黏著小帶與微處理器復(fù)合物的聯(lián)系C. IPS細(xì)胞微注射進(jìn)胚泡，胚經(jīng)熒細(xì)胞微注射進(jìn)胚泡，胚經(jīng)熒光顯微鏡分析結(jié)果光顯微鏡分析結(jié)果6.黏著小帶與微處理器復(fù)合物的聯(lián)系黏著小帶與微處理器復(fù)合

14、物的聯(lián)系6.黏著小帶與微處理器復(fù)合物的聯(lián)系黏著小帶與微處理器復(fù)合物的聯(lián)系7.依賴于依賴于PLEKHA7的的DROSHA酶酶 和和 DGCR8在在ZA的定位的定位7.依賴于依賴于PLEKHA7的的DROSHA酶酶 和和 DGCR8在在ZA的定位的定位7.依賴于依賴于PLEKHA7的的DROSHA酶酶 和和 DGCR8在在ZA的定位的定位A. IPS細(xì)胞（細(xì)胞（MEF4-7，MEF10-6，TTFGFP4-3和和TTFGFP4-7）、）、ES細(xì)胞和細(xì)胞和MEFS細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)四因子和其他蛋白的四因子和其他蛋白的免疫印跡分析免疫印跡分析。結(jié)果表明，IPS細(xì)胞內(nèi)四因子的總蛋白含量與胚胎干細(xì)胞相當(dāng)。我們可

15、以在IPS細(xì)胞內(nèi)檢測到NANOG和E-RAS蛋白，但比胚胎干細(xì)胞的水平低。8、PLEKHA7在細(xì)胞連接處調(diào)節(jié)在細(xì)胞連接處調(diào)節(jié)pri-miR-30b加工加工8、PLEKHA7在細(xì)胞連接處調(diào)節(jié)在細(xì)胞連接處調(diào)節(jié)pri-miR-30b加工加工8、PLEKHA7在細(xì)胞連接處調(diào)節(jié)在細(xì)胞連接處調(diào)節(jié)pri-miR-30b加工加工1簡介2方法和內(nèi)容3結(jié)果與討論4結(jié)論結(jié)論P(yáng)LEKHA7能夠?qū)⒁唤M前體能夠?qū)⒁唤M前體MIRNA招募到招募到E-CADHERIN和和P120定位的定位的頂端粘著小帶頂端粘著小帶（ZA）并將其加工為一組特定的并將其加工為一組特定的MIRNA，進(jìn)而調(diào)控一些，進(jìn)而調(diào)控一些與細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)的基因表達(dá)以維持細(xì)胞正