南京大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究法ppt課件

1、 任何強大的公司都不會給員工平安感，而是用最殘忍方式激發(fā)每個人變得強大！ 凡是想方法給員工平安感的公司都消滅啦，由于強大的人在溫順的環(huán)境失去了狼性！凡是逼 出員工偉大的公司都升騰不息，由于在這種環(huán)境下，要么變成狼，要么被狼吃掉！最不給員工平安感的公司，其實給了真正的安 全感，由于逼出了他們的強大，逼出了他們的 生長，也因此有了未來！; 假設(shè)真的愛他的員工，就考核他，要求他，逼 迫他生長，假設(shè)他礙于情面，低目的，低要求，養(yǎng)了一群小綿羊、老油條，這是指點對員工出路最大的損傷！由于這只會助長他們的貪 婪、無知和懶惰。 讓下屬由于他而生長，擁有正確的人生觀，價值觀，并具備了完善的品行。不斷的生長，就

2、是主管對員工最偉大的愛！;分子生物學(xué)研討法分子生物學(xué)研討法-DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)及蛋白質(zhì)操作技術(shù);DNA根本操作技術(shù)根本操作技術(shù); 將某種分子放到特定的電場中，它就會以一定的速度向適當?shù)碾姌O挪動。某物質(zhì)在電場作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場強度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等。 在生理條件下，核酸分子中的磷酸基團是離子化的，所以，DNA和RNA實踐上呈多聚陰離子形狀Polyanions。將DNA、RNA放到電場中，它就會由負極正極挪動。1核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳(Agarose & Polyacrylamid

3、e); 在凝膠電泳中，普通參與溴化乙錠EB-ethidium bromide染色，此時，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ng DNA所構(gòu)成的條帶。;Genome DNATotal RNA;2. 聚合酶鏈反響技術(shù)聚合酶鏈反響技術(shù) 在引物指點下由酶催化的對特定克隆或基在引物指點下由酶催化的對特定克隆或基因組因組DNA序列進展的體外擴增反響。序列進展的體外擴增反響。;PCR儀儀;PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理類似于類似于DNADNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。端互補的寡核苷酸引物。模板模板DNADNA變性：加熱至變性

4、：加熱至9494左右，雙鏈左右，雙鏈DNADNA解離成單鏈；解離成單鏈；模板模板DNADNA與引物的退火與引物的退火( (復(fù)性復(fù)性) )：5555左右，引物與模板左右，引物與模板DNADNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：在引物的延伸：在Taq DNATaq DNA聚合酶作用下，以聚合酶作用下，以dNTPdNTP為原料，為原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保管復(fù)制原理，合成一靶序列為模板，按堿基配對與半保管復(fù)制原理，合成一條新的雙鏈；條新的雙鏈；反復(fù)循環(huán)變性反復(fù)循環(huán)變性-退火退火-延伸三過程，使延伸三過程，使DNADNA擴增量呈指數(shù)擴增量呈指數(shù)上升。上升。 ;PCR

5、 productPCR product;例如電泳結(jié)果例如電泳結(jié)果 1 2 3 4 5 MM：DNA marker1：為陽性對照：為陽性對照2：為陰性對照：為陰性對照3-5：為擴增出的：為擴增出的DNA條帶條帶; 引物引物 primer 酶酶 Taq DNA polymerase dNTP dATP,dGTP,dCTP,dTTP 模板模板 template Mg2+ magnesium反響五要素：反響五要素：; 引物設(shè)計的原那么引物設(shè)計的原那么引物長度：15-30個堿基，常為20個堿基左右引物擴增跨度：以500bp為宜，特定條件下可擴增10kb的片段引物堿基：G+C含量以40-60%為宜, AT

6、GC最好隨機分布防止引物內(nèi)或引物間出現(xiàn)二級構(gòu)造，防止兩引物間互補，特別是 3端引物 3端的堿基要求嚴厲配對，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基引物中可以加上適宜的酶切位點，要作酶切時加引物的特異性，引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性;引物引物“設(shè)計設(shè)計step by step step by step Source: 文獻 ；在線軟件/數(shù)據(jù)庫primer bank; NCBI 下載序列DNA, RNA 用Oligo驗證評價引物 引物確定后，對于上游和下游引物分別進展Blast分析，; 酶及其濃度酶及其濃度Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶注：無注：無3 53 5方向的校正活性方向的校正

7、活性DNADNA復(fù)制復(fù)制1/1091/109；PCR PCR 出錯率出錯率1/(21/(2104)104)一個典型的一個典型的 PCR PCR 反響約需酶量反響約需酶量 2.5 U 2.5 U濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低那濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低那么合成產(chǎn)物量減少么合成產(chǎn)物量減少;dNTP dNTP 的質(zhì)量與濃度的質(zhì)量與濃度 dNTP dNTP運用留意：運用留意：1)1)保管：運用時應(yīng)配成高濃度，小量分裝，保管：運用時應(yīng)配成高濃度，小量分裝，-20-20冰凍保管。多次凍融會使冰凍保管。多次凍融會使dNTPdNTP降解；降解；2)2)運用量：在運用量：在PCRPCR反響中，反

8、響中，dNTPdNTP應(yīng)為應(yīng)為20-200umol/L20-200umol/L。3)3)成分配比：留意成分配比：留意4 4種種dNTPdNTP的濃度要相等；的濃度要相等；;模板模板templatetemplate 模板核酸的量與純化程度，是模板核酸的量與純化程度，是PCRPCR成敗成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。; Mg2+ Mg2+濃度濃度1)Mg2+1)Mg2+對擴增特異性和產(chǎn)量有顯著影響對擴增特異性和產(chǎn)量有顯著影響: : Mg2+ Mg2+濃度過高，反響特異性降低；濃度過濃度過高，反響特異性降低；濃度過低會降低低會降低 Taq DNA Taq DNA聚合酶活性，使反響產(chǎn)物聚合酶活性，

9、使反響產(chǎn)物減少。減少。2)2)在普通的在普通的PCRPCR反響中，各種反響中，各種dNTPdNTP濃度為濃度為200mol/L200mol/L時，時，Mg2+Mg2+濃度為濃度為1.51.52.0 2.0 mmol/Lmmol/L為宜；為宜；;熱循環(huán)條件的選擇熱循環(huán)條件的選擇 PCR反響條件反響條件: 溫度溫度 時間時間 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù);溫度與時間的設(shè)置溫度與時間的設(shè)置 設(shè)置變性設(shè)置變性- -退火退火- -延伸三個溫度點：延伸三個溫度點： 規(guī)范反響中采用三溫度點法：規(guī)范反響中采用三溫度點法： 1 193-9593-95變性；變性； 2 240-6040-60退火；退火； 3 370-7570

10、-75延伸延伸 對于較短靶基因長度為對于較短靶基因長度為100100300bp300bp時可時可采用二溫度點法，采用二溫度點法， 普通采用普通采用9494變性，變性，6565左右退火與延伸左右退火與延伸 ;變性溫度與時間：變性溫度與時間： 變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCRPCR失敗的最失敗的最主要緣由主要緣由 普通普通939394 l min94 l min足以使模板足以使模板DNADNA變性變性 假設(shè)低于假設(shè)低于9393那么需延伸時間那么需延伸時間 但溫度不能過高，高溫環(huán)境對酶的活性有影但溫度不能過高，高溫環(huán)境對酶的活性有影響。響。;退火退火( (復(fù)性復(fù)性) )

11、溫度與時間：溫度與時間： 退火溫度是影響退火溫度是影響PCRPCR特異性的較重要要素特異性的較重要要素 退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有模板的長度當引物長度為及其濃度，還有模板的長度當引物長度為15-2015-20個堿基時，在高離子強度中反響如個堿基時，在高離子強度中反響如1M NaCl1M NaCl Tm = 4Tm = 4G+CG+C2 2A+TA+T 復(fù)性溫度復(fù)性溫度=Tm=Tm值值 - -5 51010普通普通3060 sec，足以使引物與模板間完全結(jié)，足以使引物與模板間完全結(jié)合合;延伸溫度與時間：延伸溫度與時間：溫度：

12、溫度： 普通普通70707575，常用溫度為，常用溫度為7272。時間：時間： 根據(jù)待擴增片段長度而定根據(jù)待擴增片段長度而定,1Kb,1Kb以內(nèi)的以內(nèi)的DNADNA片段，延伸時間片段，延伸時間1min1min。; 特異性強特異性強反響特點：反響特點：靈敏度高靈敏度高簡便、快速簡便、快速 對模板的純度要求低對模板的純度要求低;常見問題與對策常見問題與對策; 無擴增產(chǎn)物1. 模板:含有抑制物，含量低2. Buffer對樣品不適宜3. 引物設(shè)計不當或者發(fā)生降解4. 退火溫度太高，延伸時間太短 景象：正對照有條帶，而樣品那么無; 非特異性擴增PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與估計的大小不一致；或者同時出現(xiàn)特異性

13、擴增帶與非特異性擴增帶。1. 引物特異性差, 2. 模板或引物濃度過高3. 酶量過多4. Mg2+濃度偏高5. 退火溫度偏低6. 循環(huán)次數(shù)過多; 拖尾 景象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear形狀 M 1 21. 模板不純或降解2. Buffer不適宜3. 退火溫度偏低4. 酶量過多5. dNTP、Mg2+濃度偏高6. 循環(huán)次數(shù)過多; 假陽性挑選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達情況假陽性挑選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達情況) )緣由：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染 景象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物1. 操作時防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外；2. 除不能耐高溫的物質(zhì)外，一切試劑器材均高壓消毒。離心管及槍頭等一次性運用。3.

14、 各種試劑先進展分裝，低溫儲存。;* * 實時定量實時定量PCRPCR* * RT-PCR real-time PCR RT-PCR real-time PCR 由于PCR技術(shù)具有極高的敏感性，擴增產(chǎn)物總量的變異系數(shù)經(jīng)常到達10%-30%。 20世紀90年代末期出現(xiàn)了實時定量PCR技術(shù)，利用帶熒光檢測的PCR儀對整個PCR過程中的擴增DNA的積累素來繪制動態(tài)變化圖，從而消除了在測定終端產(chǎn)物豐度時有較大變異系數(shù)的問題。; 實時定量PCR反響在帶透明蓋的塑料小管中進展，激發(fā)光可以直接透過管蓋，使其中的熒光探針被激發(fā)。 熒光探針事先被混合在PCR反響液中，只需與DNA結(jié)合后，才可以被激發(fā)出熒光。隨著

15、新合成目的DNA片段的添加，結(jié)合到DNA上的熒光探針，即被激發(fā)產(chǎn)生的熒光相應(yīng)添加。實時定量實時定量PCR;例如：熒光染料例如：熒光染料SYBR GreenSYBR Green僅能與雙鏈僅能與雙鏈DNADNA結(jié)合，被激發(fā)結(jié)合，被激發(fā)出綠色熒光，其熒光強度反映出綠色熒光，其熒光強度反映PCRPCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。產(chǎn)物的產(chǎn)量。;SYBR GreenSYBR Green做探針的實時定量做探針的實時定量PCRPCR實驗實驗;SYBR GreenSYBR Green做探針的實時定量做探針的實時定量PCRPCR實驗實驗;Taqman Taqman 探針法探針法;RNA根本操作技術(shù)根本操作技術(shù);總總RNA的提取的

16、提取Total RNA; 1. 制備RNA的關(guān)鍵防止內(nèi)外源RNase的作用 1) RNase的特點：抗酸抗堿,具很廣pH作用范圍; 抗高溫嚴寒(065均具活性；抗變性劑 2) 處理方法：外源RNase低溫，焦磷酸二乙酯(DEPC)處置 一切溶液TrisHCl除外和器皿，操作者帶手套 內(nèi)源RNase高溫抽提，強蛋白量變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶K等 2. 總RNA的制備 根據(jù)所用蛋白量變性劑種類不一樣分為以下三種制備方法： 1熱苯酚抽提法 2胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍 3LiCl/尿素法 ;實驗室常用方法：異硫氰酸胍實驗室常用方法：異硫氰酸胍-苯酚抽提法苯酚抽提法 Trizol試劑是運用最

17、廣泛的抽提RNA公用試劑，主要有苯酚和異硫氰酸胍組成。 Trizol試劑可以迅速破壞細胞構(gòu)造，使存在于細胞質(zhì)及核內(nèi)的RNA釋放出來，并是核糖體蛋白與RNA分子分別，還能保證RNA的完好。;運用Trizol試劑提取RNA詳細實驗過程資料處置資料處置液氮研磨，勻漿，加Trizol試劑，進一步破碎細胞并溶解細胞成分氯仿抽提，離心，分別水相和有機相氯仿抽提，離心，分別水相和有機相搜集水相搜集水相異丙醇沉淀，得到比較純的異丙醇沉淀，得到比較純的RNA;RNA的濃度和純度可以經(jīng)過測定其OD和OD 來判別260280 OD 為1時， 相當于濃度為40g/mL OD /OD 假設(shè)在1.8-2.0，表示所提取的

18、RNA純度較好 OD /OD 低于1.8，樣品中那么混有蛋白質(zhì)或酚污染 260260260280280;mRNA的純化 真核細胞的mRNA分子最顯著的構(gòu)造特征是具有 實驗中常用寡聚dT-纖維素柱色譜法獲得高純度mRNA。5端帽子構(gòu)造m G3端polyA尾巴7; 寡聚dT-纖維素柱色譜法獲得高純度mRNA 當RNA流經(jīng)寡聚dT-纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異性結(jié)合在柱子上， 再用低鹽溶液會蒸餾水洗脫mRNA。 經(jīng)過兩次寡聚dT-纖維素柱后可得到較高純度的mRNA.;cDNA的合成 主要包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。 第一鏈cDNA的合成是以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，

19、由反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶合成DNA時需求引物引導(dǎo)，常用的引物是oligo dT。 oligo dT引物普通包含12-20個脫氧胸腺嘧啶核苷酸，后面加一個銜接引物通常是Xho等酶切位點以便于克隆構(gòu)建.;cDNA的合成的合成;DNA變異變異eg. SNP的的實際與運用實際與運用;DNA DNA 多多 態(tài)態(tài) 性性 基因組基因組DNADNA中中, ,由不同堿基構(gòu)造的等位基因由不同堿基構(gòu)造的等位基因所構(gòu)成的多態(tài)性所構(gòu)成的多態(tài)性產(chǎn)活力制點產(chǎn)活力制點 突突 變變-序列多態(tài)性序列多態(tài)性 插入或缺失插入或缺失-長度多態(tài)性長度多態(tài)性存在部位編存在部位編 碼碼 區(qū)區(qū) 非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNADNA遺傳標志遺傳標志 是特定

20、的堿基序列是特定的堿基序列 遵照孟德爾遺傳規(guī)律遺傳遵照孟德爾遺傳規(guī)律遺傳 具有終身不變的遺傳特征具有終身不變的遺傳特征; SNP 指基因組DNA序列中由于單個核苷酸A,T,C,G的突變而引起的多態(tài)性。 染色體DNA同一位置上的每一個堿基類型叫做一個等位位點。 SNP-RFLP-SSR (限制性片段多態(tài)性) 微衛(wèi)星標志;根據(jù)SNP在基因組中的分布位置可分為： 基因編碼區(qū)SNPcSNP 基因調(diào)控區(qū)SNPpSNP 基因間隨機非編碼區(qū)SNPrSNP同義cSNP，即SNP所導(dǎo)致的編碼序列改動并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義一樣非同義cSNP，即SNP所導(dǎo)致的編碼序列改動可

21、使以其為模板翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列發(fā)生改動，從而影響蛋白質(zhì)功能;SNP的檢測技術(shù) 常用技術(shù)： 限制性酶切片段長度多態(tài)性RFLP PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR-SSCP 毛細管電泳 變性高效液相色譜DHPLC以上技術(shù)僅能判別SNP的有無，而不能知道確切的堿基類型，只需進展DNA序列分析才干確認所發(fā)現(xiàn)的SNP經(jīng)過DNA測序法獲得新的SNP;SNP的運用 人類基因單體型圖的繪制 SNP與疾病易感基因的相關(guān)性分析 當一個遺傳標志的頻率在患者中明顯超越非患者時，就闡明該標志能夠與這種疾病有關(guān)。 指點用藥與藥物設(shè)計 由于SNP可以充分反映個體間的遺傳差別，所以經(jīng)過研討SNP與個體對藥物敏感或耐受的相關(guān)性

22、研討，能夠闡明遺傳要素對藥效的英系那個，因此能夠建立與基因型相關(guān)的治療方案，對患者施行個性化用藥。;DNA 變異變異基因量的分析基因量的分析;雜合性喪失LOH;基因拷貝數(shù)的分析;RNA 量的分析; 蛋白質(zhì)技術(shù)蛋白質(zhì)技術(shù) Western blot;定義：印跡法blotting是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反響來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜NC膜上，并利用DNARNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進展印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電

23、泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法;Western BlotWestern Blot根本原理根本原理 在電場的作用下將電泳分別的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。; 蛋白樣品的制備 SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳l轉(zhuǎn)膜l封鎖l一抗雜交l二抗雜交l底物顯色;?經(jīng)過層析或電洗脫法制備目的蛋白蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備;蛋白樣品的定量蛋白樣品的定量Bradford法 考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色的方式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后構(gòu)成藍色化合物，該化合物

24、在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比 。(上樣量)試劑：考馬斯亮藍任務(wù)液，0.1N鹽酸，雙蒸水，蛋白規(guī)范液 將10mg/ml蛋白溶液稀釋至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。管號012345678ddH2O807070707070707070蛋白標準液01010101010101010樣品101010101010101010HCL101010101010101010;SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：原理： SDS 是一種離子性的界面活性劑是一種離子

25、性的界面活性劑,它有強離子性的硫酸根離它有強離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈子也帶有疏水性的長碳鏈.當當 SDS 與蛋白質(zhì)混合時與蛋白質(zhì)混合時,它會它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以分量為單位以分量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之 SDS 後後,由於由於 SDS 帶強負價帶強負價,使蛋白質(zhì)原先的帶電價微缺乏道使蛋白質(zhì)原先的帶電價微缺乏道,且每單位分量之蛋白

26、質(zhì)且每單位分量之蛋白質(zhì)帶電價一致帶電價一致 (charge density),所以決議不同蛋白的泳動所以決議不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項要素速率就只剩下分子大小一項要素;M丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺 MSDSM配膠的Tris緩沖液MTEMEDM過硫酸銨(時間)MTris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份凝膠成份;凝膠濃度與蛋白分別范圍凝膠濃度與蛋白分別范圍凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212;不同聚丙烯酰胺凝膠濃度對不同分子量的不同聚丙烯酰胺凝膠濃度對不同分子量的蛋白質(zhì)混合物分別才干的關(guān)系蛋白質(zhì)混合物分別才干的關(guān)系5 51010

27、1515292945456666979720020029294545666697972002002929454566669797200200;轉(zhuǎn)膜半干法半干法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間，電轉(zhuǎn)潤濾紙之間，電轉(zhuǎn)101030min30min。濕法濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min45min或過夜?；蜻^夜。 ;一抗、二抗孵育 把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培育皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量參與參與一抗溶液與濾膜溫育。37

28、一小時，4 過夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。 參與用封鎖液配制的二抗，搖床上緩慢搖動， 37一小時，4 過夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。;辣根過氧化物酶法HRP堿性磷酸酶法AP化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP);背景太高1.膜沒有均勻浸濕2.膜或者緩沖液污染3.封鎖不充分4.抗體與封鎖劑出現(xiàn)交叉反響5.抗體濃度過高 緣由緣由對對策策1.1.轉(zhuǎn)膜前用轉(zhuǎn)膜前用100%100%甲醇將膜完甲醇將膜完全浸濕全浸濕2.2.拿取膜與吸水紙時要戴手拿取膜與吸水紙時要戴手套，改換新穎轉(zhuǎn)膜緩沖液套，改換新穎轉(zhuǎn)膜緩沖液3.3.檢測一抗、二抗與封鎖劑檢測一抗、二抗與封

29、鎖劑能否有交叉反響能否有交叉反響4.4.雜交前檢測一抗、二抗的雜交前檢測一抗、二抗的任務(wù)濃度任務(wù)濃度; 雙向電泳技術(shù) 蛋白質(zhì)印跡法 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術(shù);雙向電泳技術(shù) 根據(jù)蛋白質(zhì)的兩個重要特性： 等電點 相對分子質(zhì)量;電泳設(shè)備電泳設(shè)備垂直電泳系統(tǒng)垂直電泳系統(tǒng);程度電泳系統(tǒng)程度電泳系統(tǒng);不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠中運動表示圖不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠中運動表示圖;原位分析;免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué) 免疫組織化學(xué)是指在組織細胞原位經(jīng)過抗原抗體反響和組織呈色反響，借助可見的標志物，對相應(yīng)的抗原或抗體進展定位、定性和定量檢測的一種免疫檢測方法。;免疫組化的全過程抗原的提取與純化免疫動物或細胞交融，制備特異

30、性抗體及純化標志物與抗體集合構(gòu)成標志抗體標本的處置抗原抗體反響和呈色反響顯微鏡下察看結(jié)果;組織抗原組織抗原抗體抗體標志物標志物 標志抗體標志抗體1 1 熒光熒光2 2 酶酶3 3 親和技術(shù)親和技術(shù)4 4 金標金標;組織抗原組織抗原 免疫細胞化學(xué)反響原理：免疫細胞化學(xué)反響原理：標志抗體標志抗體標志的抗原抗體復(fù)合物標志的抗原抗體復(fù)合物;間接法間接法 直接法直接法 兩種免疫細胞化學(xué)反響方法;標本的處置標本的處置 標本的主要來源：活體組織、各種體液、穿刺液、培育細胞 標本的固定與保管 酶消化處置 組織資料處置是獲得良好免疫細胞組織化學(xué)分析的保證，必需保證要檢測的細胞或組織取材新穎、固定即使及時、形狀保

31、管良好、抗原物質(zhì)的抗原性不被破壞。;標本的固定與保管 固定的目的：是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止胞內(nèi)酶活化反響，防止細胞自溶，堅持細胞固有形狀與構(gòu)造，防止細胞零落，去除干擾抗原抗體反響的類脂，最主要的是保管組織細胞的抗原性，在染色和反復(fù)清洗的過程中使抗原不致釋放。好的固定劑：1能快速固定抗原2防止抗原物質(zhì)分散3固定后的抗原能被抗體識別，不影響抗原抗體反響;標本的固定與保管抗原固定劑固定溫度與時間蛋白質(zhì)95乙醇室溫，315min免疫球蛋白丙酮4，30min酶四氯化磺4 ，30min激素1聚甲醛4 ，45h細菌丙酮、甲醇室溫，310min病毒丙酮，無水乙醇室溫，510min四氯化磺4 ，3060min類

32、脂質(zhì)10甲醛室溫，310min細胞懸液1聚甲醛室溫，2min各種抗原的固定標本的固定與保管 冰凍切片和石蠟切片時免疫組化中最常用的制片方法。 冰凍切片制片方法簡單，可防止石蠟切片因固定、脫水、浸蠟等步驟呵斥的抗原損失。迅速冷凍可防止冰晶的構(gòu)成，防止組織細胞構(gòu)造的破壞。 石蠟切片是察看組織細胞構(gòu)造的理想方法，可用于陳舊石蠟包埋資料的回想性免疫組化研討，切片薄，有延續(xù)性，蠟塊可長期保管，但是抗原的保管量不如冰凍切片。;酶消化處置 石蠟包埋資料大都用甲醛固定保管，固定過程中由于醛鍵構(gòu)成致使某些抗原決議簇被封鎖，染色不理想，甚至出現(xiàn)假陰性，因此在進展免疫組化反響之前，需求酶消化處置切片，可使抗原決議簇

33、重新裸露。常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。;抗體處置與保管抗體是免疫組化技術(shù)的首要試劑，通常選用的高特異性、高效價的第一抗體為多克隆抗體?？贵w稀釋的原那么是陽性抗原物質(zhì)著色應(yīng)鮮明，背景應(yīng)錢或不著色。抗體效價越高，孵育時間越長，方法越敏感抗體稀釋度應(yīng)越高。;免疫染色 標志抗體與標本中抗原反響并構(gòu)成抗原抗體復(fù)合物； 用緩沖液沖洗去未結(jié)合的成分； 直接在顯微鏡下察看結(jié)果免疫熒光直接法，或待標本顯色后再用顯微鏡察看結(jié)果免疫酶直接法免疫染色是免疫組化技術(shù)的關(guān)鍵步驟。;免疫染色 對一些特殊的標本需進一步進展處置來添加檢測的敏感性和特異性，減少非特異性干擾。1.蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的

34、是暴露抗原，添加細胞和組織的通透性，以利于抗體與抗原最大限制的結(jié)合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶等。2.非特異吸附法免疫組化技術(shù)中非抗原抗體反響出現(xiàn)的陽性染色成為非特異性染色。防止非特異性染色的有效方法是采用與第二抗體一樣的動物源血清非免疫血清吸附封鎖底物煮至上的帶電荷物質(zhì)，然后再進展抗原抗體結(jié)合反響，必要時也可采用2%左右的?；蛉税椎鞍追馄?，減少非特異性染色。;免疫組化染色中標識物的選擇 用量微小，容易在光鏡或電鏡下識別 機體內(nèi)無同一物質(zhì)或類似物質(zhì) 物理或化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可與抗原或抗體結(jié)合，其結(jié)合物也穩(wěn)定 目前常用標識物質(zhì)有熒光色素、放射性同位素、重金屬、微粒子、酶等;設(shè)立對照實

35、驗 為確定結(jié)果的可靠性，在實驗中必需設(shè)置對照。通常是針對第一抗體設(shè)立對照，包括陽性對照、陰性對照、替代對照、空白對照、本身對照和吸收實驗等。1陽性對照用不斷抗原陽性的切片與待測標本同時進展免疫細胞化學(xué)染色，陽性對照應(yīng)呈陽性結(jié)果，即為陽性對照。2陰性對照用不含不斷抗原的標本作對照，實驗結(jié)果為陰性，即為陰性對照。陰性對照中還包括空白對照、替代對照、吸收和抑制對照等，用以排除假陽性結(jié)果。;免疫組化的結(jié)果判別染色特異性染色非特異性染色顯色部位特定細胞或間質(zhì)細胞和間質(zhì)均勻染色或更強顯色定位特定，具有結(jié)構(gòu)性無特定部位，無結(jié)構(gòu)性顯色程度同一部位呈不同程度顯色無分布規(guī)律，某一片均勻著色 免疫組織化學(xué)的結(jié)果判別應(yīng)非常嚴謹，陽性細胞的染色分布有三種類型：胞漿型、細胞核型和細胞膜外表型。陽性細胞顯色深淺可反映出抗原的濃度，并以此作為定性、定量和定位的根據(jù)。 陽性細胞的染色常定位于細胞，并于陰性細胞間有明顯間隔，而非特異性染色常不限于單個細胞，而是累及一片細胞，兩者可由顯著區(qū)別。;幾種常用的免疫組化檢測技術(shù) 熒光免疫組織化學(xué)技術(shù) 酶免疫組織化學(xué)技術(shù) 免疫金銀組織化學(xué)技術(shù) 免疫標志電鏡技術(shù) ; 免疫熒光技術(shù)將免疫熒光技術(shù)將 熒光素作為標志物熒光素作為標志物使組織細胞