實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)概要

1、 實(shí)驗(yàn)室常用檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)要介紹主要內(nèi)容主要內(nèi)容概述概述 疾病鑒別診斷過(guò)程疾病鑒別診斷過(guò)程n臨床癥狀和大體病變檢 病料的采集及處理 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)病料中細(xì)菌的檢測(cè)病料中細(xì)菌的檢測(cè)病料中病毒的檢測(cè)病料中病毒的檢測(cè)一 、疾病鑒別診斷過(guò)程u臨床標(biāo)本的采集及處理 原則n合理的采樣時(shí)機(jī)n正確的采樣方法n適宜的采樣部位一 、標(biāo)本采集 盡量在病程的早期采集；標(biāo)本應(yīng)放置無(wú)菌容器中；標(biāo)本應(yīng)做適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，如動(dòng)物、地點(diǎn)、時(shí)間、暫定的診斷等。1 唾液在生理理鹽水中常加0.5%明膠或BSA，以保護(hù)不穩(wěn)定病毒。 2 鼻、咽及肛門(mén)拭子 3 糞便標(biāo)本4 腦脊髓液、心包液、尿液等 5 尸體材料 死后應(yīng)盡早獲取，無(wú)菌采取，不使用防腐劑。

2、 不同病毒所取材料不同，如NDV，取腦、氣管，F(xiàn)MV取肺、PRRS取肺、SFV取淋巴結(jié)等。二 標(biāo)本的保存和運(yùn)送 盡量活體送檢，大部分病毒不穩(wěn)定，必須盡快送實(shí)驗(yàn)室；如有延誤，則標(biāo)本必須冷藏，到實(shí)驗(yàn)室立即處理和接種，延誤時(shí)間短的，可置4；時(shí)間延誤較長(zhǎng)，置-70。 如郵寄標(biāo)本則需放置有干冰的保溫箱內(nèi)。三 標(biāo)本處理1 體液 可以直接接種、檢測(cè)2血標(biāo)本 凝固血離心后的血清即可用于檢測(cè)3各種拭子 4糞便標(biāo)本 5 組織材料u病原學(xué)檢測(cè)常用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)n分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) （“金標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)準(zhǔn)”）n形態(tài)學(xué)檢查形態(tài)學(xué)檢查 （病毒（病毒 電鏡鏡檢）電鏡鏡檢）n細(xì)菌的生化試驗(yàn)細(xì)菌的生化試驗(yàn)n動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)n免疫學(xué)診斷技

3、術(shù)免疫學(xué)診斷技術(shù) ELISA IFA 免疫組化免疫組化n分子生物學(xué)診斷技術(shù)分子生物學(xué)診斷技術(shù) PCR 熒光定量熒光定量PCR二、病料中細(xì)菌的檢測(cè)方法n細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查n細(xì)菌的分離培養(yǎng)n細(xì)菌的生化試驗(yàn)n動(dòng)物試驗(yàn)n血清學(xué)試驗(yàn)n分子生物學(xué)方法光學(xué)顯微鏡下細(xì)菌的形態(tài)細(xì)菌的形態(tài)觀察光鏡和電鏡的比較大腸桿菌葡萄球菌電鏡鏡檢光學(xué)顯微鏡鏡檢培養(yǎng)結(jié)果初次分離純培養(yǎng)鑒別培養(yǎng)不乳糖發(fā)酵乳糖麥康凱平板麥康凱平板 不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌大腸桿菌，呈現(xiàn)黑色金屬光澤EMB平板平板 SS平板平板 大腸桿菌或者別的發(fā)酵乳糖的腸桿菌 有黑色中心的是沙門(mén)氏菌。如果沒(méi)有黑色中心，就很可能是志賀氏菌了。不發(fā)酵乳糖的腸道菌，可能就是志賀氏菌。

4、 不發(fā)酵乳糖的某種腸道菌，而且產(chǎn)生硫化氫，可能是沙門(mén)氏菌 發(fā)酵乳糖的某種腸桿菌。 HE（蘇木素伊紅（蘇木素伊紅)瓊脂平板瓊脂平板 本培養(yǎng)基傾注平皿待冷卻后呈草綠色，質(zhì)控菌株接種后。361培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果 。大腸桿菌部分被抑制，橙黃色-橙紅色。葡萄球菌生長(zhǎng)被抑制。革蘭氏染色革蘭氏陽(yáng)性革蘭氏陰性n染色原理及過(guò)程：染色原理及過(guò)程：初染初染（結(jié)晶紫）媒染媒染（碘液）脫色脫色（ 95酒精）復(fù)染復(fù)染（復(fù)紅）細(xì)菌的生化試驗(yàn)硫化氫試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)MR試驗(yàn)VP試驗(yàn)靛基質(zhì)試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)示意圖藥敏試驗(yàn)示意圖測(cè)量抑菌圈測(cè)量抑菌圈 涂布細(xì)菌涂布細(xì)菌貼上藥敏紙片貼上藥敏紙片12溫箱培養(yǎng)溫箱培養(yǎng)34以大腸桿菌為例：1.

5、剖檢（采集病料）2.纖維素滲出物的涂片染色3.分離培養(yǎng)（普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板或伊紅美蘭瓊脂平板）4.培養(yǎng)物涂片G染色5.生化試驗(yàn)6.動(dòng)物試驗(yàn)7.血清學(xué)實(shí)驗(yàn) 玻板凝集鑒定血清型三、病料中病毒的檢測(cè)電鏡技術(shù)電鏡技術(shù)血清學(xué)試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn)分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)病毒的分離鑒定病毒的分離鑒定標(biāo)本采集與送檢標(biāo)本采集與送檢病毒分離和鑒定的一般程序病毒分離和鑒定的一般程序 常用檢測(cè)方法n分離培養(yǎng)n血清學(xué) 中和試驗(yàn) 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 血凝及血凝抑制試驗(yàn) 免疫擴(kuò)散試驗(yàn) n免疫學(xué)診斷技術(shù) ELISA IFA 免疫組化n分子生物學(xué)檢測(cè) PCR 分子雜交技術(shù) 病毒分離病毒分離標(biāo)本采集標(biāo)本采集殺滅雜菌殺滅雜菌

6、（青鏈霉素青鏈霉素）接種接種鑒定病毒種型鑒定病毒種型易感動(dòng)物易感動(dòng)物出現(xiàn)病狀出現(xiàn)病狀雞胚雞胚病變或死亡病變或死亡細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞病變細(xì)胞病變?nèi)蠓椒ㄈ蠓椒?1 1動(dòng)物接種動(dòng)物接種病毒的分離與鑒定病毒的分離與鑒定 2雞胚培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)3 3組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)病毒中和試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)極為特異和敏感，是病毒學(xué)中重要的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。主要用于病毒感染的血清學(xué)診斷、病毒分離株的鑒定、不同病毒株的抗原關(guān)系研究、疫苗免疫原性的評(píng)價(jià)、免疫血清質(zhì)量的評(píng)價(jià)以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中是否存在相應(yīng)的抗體等。virus補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng) AgAb紅細(xì)胞紅細(xì)胞溶血素溶血素補(bǔ)體補(bǔ)體AbAg紅細(xì)胞紅細(xì)胞補(bǔ)體補(bǔ)體溶血素溶血素溶血溶血 （-）不溶血不溶

7、血 （+）免疫擴(kuò)散 電鏡技術(shù)雞痘病毒（超薄切片）雞痘病毒（超薄切片）狂犬病毒包涵體狂犬病毒包涵體（Negri body）ELISA分類ELISA Procedures分子生物學(xué)方法nPCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng)) n熒光實(shí)時(shí)定量PCR （real time PCR）nNASBA （依賴核酸序列的擴(kuò)增）PCRPCR原理原理: :實(shí)質(zhì)就是實(shí)質(zhì)就是體外基因體外基因復(fù)制復(fù)制技術(shù)技術(shù)Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA聚合酶聚合酶 AmpErasePrimer靶序列靶序列加熱變性加熱變性95 C靶序列引物退火靶序列引物退火55 C引物延伸引物

8、延伸72 C原理圖示一二三 完成一個(gè)循環(huán)3030次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon 特異性熒特異性熒光雙標(biāo)記光雙標(biāo)記探針探針 Taq

9、酶酶 5353外切酶活外切酶活性性染料法的優(yōu)點(diǎn)染料法的優(yōu)點(diǎn)：成本低不需要探針；適合初步篩查先用SYBR篩查，再用TaqMan精確定量部分關(guān)鍵樣品；融解曲線鑒定PCR有無(wú)雜帶、引物二聚體；染料法的缺點(diǎn)染料法的缺點(diǎn)：無(wú)模板特異性 不能分辨主帶與雜帶，給出的是總信號(hào)；不能做多重檢測(cè) 每孔只能檢測(cè)一個(gè)目標(biāo)基因；靈敏度低適合于5000 拷貝以上的基因定量。與DNA結(jié)合時(shí)發(fā)光游離時(shí)不發(fā)光SYBR Green I染料法染料法舉例：舉例：基于結(jié)核分枝桿菌插入序列IS1081，建立SYBR Green熒光定量PCR方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖2.3：標(biāo)準(zhǔn)曲線引物二聚體1copy圖2.4 融解曲線10copies/uL1copy/ul陰性對(duì)照105copies/ullL107copies/