第10章 甾體激素類藥物的分析-2-2013

1、藥物分析學（第十五章）甾體激素類藥物的分析（甾體激素類藥物的分析（2）本節(jié)教師：本節(jié)教師： 韓海韓海 （博士（博士/副教授副教授 )暨南大學藥學院暨南大學藥學院Tel:-mail: QQ: 560118562013.11.11 第二節(jié)第二節(jié) 鑒別實驗鑒別實驗n1. 物理常數(shù)物理常數(shù)n2.化學鑒別化學鑒別:母核和各種官能團的反應(yīng)母核和各種官能團的反應(yīng)n呈色反應(yīng)、呈色反應(yīng)、n官能團反應(yīng)：沉淀反應(yīng)、鹵素反應(yīng)官能團反應(yīng)：沉淀反應(yīng)、鹵素反應(yīng)n3.制備衍生物測定熔點制備衍生物測定熔點n4. 紫外分光光度法紫外分光光度法n5. 紅外分光光度法紅外分光光度法n6.色譜法色譜法TLC、

2、HPLC物理常數(shù)物理常數(shù) 呈色反應(yīng)呈色反應(yīng)n （一）與強酸的呈色反應(yīng)（一）與強酸的呈色反應(yīng)（甾體母核）（甾體母核）n與硫酸、磷酸、高氯酸、鹽酸等呈色與硫酸、磷酸、高氯酸、鹽酸等呈色. .n硫酸呈色反應(yīng)硫酸呈色反應(yīng)應(yīng)用最廣應(yīng)用最廣n1)1)反應(yīng)顏色最豐富反應(yīng)顏色最豐富n2)2)靈敏度較高靈敏度較高n可能機制為濃硫酸與甾體的酮基質(zhì)子化反可能機制為濃硫酸與甾體的酮基質(zhì)子化反應(yīng)，形成正碳離子，然后與應(yīng)，形成正碳離子，然后與HSOHSO4 4- -作用。作用。與硫酸顯色反應(yīng)與硫酸顯色反應(yīng) 顯顯 色色 熒光熒光 加水稀釋加水稀釋潑尼松龍潑尼松龍 深紅深紅 絮狀絮狀灰灰潑尼松潑尼松 橙橙 黃黃藍綠藍綠炔雌醚

3、炔雌醚 橙紅橙紅 黃綠黃綠 紅色紅色 炔雌醇炔雌醇 橙紅橙紅 黃綠黃綠 絮狀絮狀玫紅玫紅醋酸可的松醋酸可的松 黃或微黃或微 褪色并澄褪色并澄 帶橙帶橙 清清n特點：操作簡便，反應(yīng)靈敏，通過形成的顏特點：操作簡便，反應(yīng)靈敏，通過形成的顏色或熒光的不同而互相區(qū)別，但操作條件不色或熒光的不同而互相區(qū)別，但操作條件不易掌握。易掌握。n某些甾體激素藥物與某些甾體激素藥物與硫酸硫酸乙醇或硫酸乙醇或硫酸甲甲醇醇作用而呈色。如甲睪酮作用而呈色。如甲睪酮.n雌性激素藥物常以硫酸雌性激素藥物常以硫酸乙醇的呈色反應(yīng)來乙醇的呈色反應(yīng)來鑒別鑒別. .n例例: : ChpChp中雌二醇鑒別中雌二醇鑒別n取本品約取本品約2

4、 2mlml，加硫酸加硫酸2 2mlml溶解，有黃綠色熒溶解，有黃綠色熒光，加三氯化鐵試液光，加三氯化鐵試液2 2滴呈草綠色，再加水稀滴呈草綠色，再加水稀釋，則變?yōu)榧t色。釋，則變?yōu)榧t色。 （二）官能團的呈色反應(yīng)（二）官能團的呈色反應(yīng)n利用官能團的呈色反應(yīng)可區(qū)別不同的藥物利用官能團的呈色反應(yīng)可區(qū)別不同的藥物n 1.C17-醇酮基的呈色反應(yīng)醇酮基的呈色反應(yīng)nC17-醇酮基有還原性，能與氧化劑醇酮基有還原性，能與氧化劑四氮四氮唑鹽唑鹽反應(yīng)顯色。反應(yīng)顯色。n例例:(ChpChp中中醋酸潑尼松鑒別醋酸潑尼松鑒別)n醋酸潑尼松在堿性條件下與醋酸潑尼松在堿性條件下與氯化三苯四氮氯化三苯四氮唑試液唑試液反應(yīng)生

5、成紅色。反應(yīng)生成紅色。n討論討論：n1).本反應(yīng)亦可用于本反應(yīng)亦可用于薄層色譜法鑒別薄層色譜法鑒別甾體激甾體激素類藥物的顯色反應(yīng)。素類藥物的顯色反應(yīng)。 （如醋酸潑尼松片及眼膏、醋酸氟氫可的（如醋酸潑尼松片及眼膏、醋酸氟氫可的松軟膏等）松軟膏等）n2).該呈色反應(yīng)不僅能用做皮質(zhì)激素類藥物該呈色反應(yīng)不僅能用做皮質(zhì)激素類藥物的的鑒別鑒別和和檢查檢查(“其他甾體其他甾體”的檢查的檢查)，也，也是該類藥物是該類藥物含量測定含量測定的依據(jù)。的依據(jù)。n3).C17-醇酮基還可以和醇酮基還可以和斐林試液、多倫斐林試液、多倫試液試液發(fā)生反應(yīng)。發(fā)生反應(yīng)。n 2.酮基的呈色反應(yīng)酮基的呈色反應(yīng)nC3-酮基酮基、C20

6、-酮基能與酮基能與2，4-二硝基苯肼、二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼等羰基試劑反應(yīng)形成黃異煙肼、硫酸苯肼等羰基試劑反應(yīng)形成黃色的腙。色的腙。n例如例如:氫化可的松，其乙醇溶液加新制的氫化可的松，其乙醇溶液加新制的硫酸苯肼試液，加熱即顯黃色。硫酸苯肼試液，加熱即顯黃色。n 3.甲酮基甲酮基以及以及活潑亞甲基活潑亞甲基能與亞硝鐵氰能與亞硝鐵氰化鈉、間二硝基酚、芳香醛類反應(yīng)呈色?；c、間二硝基酚、芳香醛類反應(yīng)呈色。n其中其中亞硝基鐵氰化鈉亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)是黃體酮的靈敏、反應(yīng)是黃體酮的靈敏、專屬的鑒別方法。專屬的鑒別方法。n在一定的條件下，黃體酮顯藍紫色，其他在一定的條件下，黃體酮顯藍紫色，其他常用甾

7、體激素均不顯藍紫色，而呈現(xiàn)淡橙常用甾體激素均不顯藍紫色，而呈現(xiàn)淡橙色或不顯色。色或不顯色。n 4. 4.酚羥基酚羥基的呈色反應(yīng)的呈色反應(yīng)nC C3 3為酚羥基的雌激素，能與為酚羥基的雌激素，能與重氮磺酸重氮磺酸反反 應(yīng)生成紅色偶氮染料。應(yīng)生成紅色偶氮染料。nJP(14)JP(14)收載的苯甲酸雌二醇利用該法進行收載的苯甲酸雌二醇利用該法進行鑒別。鑒別。含炔基的甾含炔基的甾體激素體激素（如炔雌醇、（如炔雌醇、炔諾酮等）炔諾酮等）白色炔銀鹽沉淀白色炔銀鹽沉淀硝酸銀硝酸銀5. 乙炔基沉淀反應(yīng)乙炔基沉淀反應(yīng)RCCHAgNO3RCCAgn 6. 有機鹵素反應(yīng)有機鹵素反應(yīng)有機氟有機氟F有機破壞有機破壞有機

8、氯有機氯Cl 茜素氟藍茜素氟藍 硝酸亞鈰硝酸亞鈰硝酸硝酸硝酸銀硝酸銀AgCl 呈色呈色 n鹵素在母核上：鹵素在母核上：氧瓶燃燒法破壞氧瓶燃燒法破壞n如地塞米松磷酸鈉如地塞米松磷酸鈉n鹵素在側(cè)鏈上：鹵素在側(cè)鏈上：加熱水解法破壞加熱水解法破壞n如丙酸倍氯他索如丙酸倍氯他索7.酯的反應(yīng)酯的反應(yīng) KOHOCOCHR醇制醇制 OCOCHCHCH SOHOHHC C17或或C21位羥基酯，應(yīng)先位羥基酯，應(yīng)先水解水解；再根據(jù)羧酸的性；再根據(jù)羧酸的性質(zhì)鑒別。質(zhì)鑒別。例：醋酸酯類藥物例：醋酸酯類藥物戊酸、己酸戊酸、己酸酯類藥物，有特臭。酯類藥物，有特臭。 制備衍生物測定其熔點制備衍生物測定其熔點n原理原理n1.

9、甾醇、甾酮類藥物可與一些試劑反應(yīng)生成甾醇、甾酮類藥物可與一些試劑反應(yīng)生成酯、酯、肟、縮氨脲肟、縮氨脲. 測定其熔點進行鑒別。測定其熔點進行鑒別。n2.利用醇制堿液水解甾體酯類生成相應(yīng)的母體，利用醇制堿液水解甾體酯類生成相應(yīng)的母體，測定其熔點進行鑒別。測定其熔點進行鑒別。n特點特點n繁瑣費時，但專屬性強繁瑣費時，但專屬性強.目前仍為一些國家藥典目前仍為一些國家藥典采用。采用。HO+COClKOHCOO+KCl+H2O炔雌醇炔雌醇m.p.201OCCH3O+2HONH2NCHOCH3NOH+2H2O黃體酮黃體酮雙肟m.p.238苯丙酸諾龍苯丙酸諾龍縮氨基脲縮氨基脲m.p.178185分解分解OCO

10、CH2CH2OC6H5+NH2CNHNH2OHClNCH2NOH+H2O+HAcOCOCH2CH2N+H2OOHO+CH3CH2COOHOCOCH2CH3OKOH丙酸睪丸素丙酸睪丸素m.p.150156紫外分光光度法紫外分光光度法n原理原理：n具有具有C=C-C=O共軛系統(tǒng)，共軛系統(tǒng)，n -3-3-酮酮 240240nmnmn和和C=C-C=C共軛系統(tǒng)，共軛系統(tǒng)，n苯環(huán)（苯環(huán)（B B帶：帶：280280nmnm，K K帶：帶：220220nm nm ）n1.可用規(guī)定波長處的吸收度鑒別可用規(guī)定波長處的吸收度鑒別n如如:曲安西龍曲安西龍n2. 吸收度的比值法。吸收度的比值法。n如如: 丙酸倍氯米松

11、丙酸倍氯米松-3-3-酮酮 240240nmnm 紅外分光光度法紅外分光光度法n必要性必要性n1.許多重要的甾體激許多重要的甾體激素藥物紫外光譜非常素藥物紫外光譜非常相似，紫外光譜鑒別相似，紫外光譜鑒別缺乏專屬性。缺乏專屬性。n2.甾體激素藥物化學甾體激素藥物化學結(jié)構(gòu)上僅有微小的差結(jié)構(gòu)上僅有微小的差異，也難以用化學鑒異，也難以用化學鑒別法來區(qū)分。別法來區(qū)分。紅外分光光度法的優(yōu)勢紅外分光光度法的優(yōu)勢n1.對樣品無破壞對樣品無破壞, 樣品用量較少樣品用量較少 n2.特征性特征性極強、極強、 信息量豐富信息量豐富: n每種化合物每種化合物都有紅外吸收，從紅外光譜可以得都有紅外吸收，從紅外光譜可以得到

12、大量信息。到大量信息。官能團區(qū)官能團區(qū)的吸收反映了化合物中的吸收反映了化合物中官能團的特征，而官能團的特征，而指紋區(qū)指紋區(qū)的吸收對于指認分子的吸收對于指認分子提供了可靠的依據(jù)。提供了可靠的依據(jù)。紅外分光光度法的應(yīng)用紅外分光光度法的應(yīng)用n各國藥典幾乎均采用紅外分光光度法鑒各國藥典幾乎均采用紅外分光光度法鑒別甾體激素原料藥物，中國藥典中別甾體激素原料藥物，中國藥典中36種種甾體激素原料藥物，其中甾體激素原料藥物，其中33種采用該方種采用該方法鑒別！法鑒別！鑒別方法鑒別方法:按規(guī)定錄制紅外光按規(guī)定錄制紅外光譜圖，要求供試品譜圖，要求供試品光譜圖與對照品光光譜圖與對照品光譜圖一致。譜圖一致。甾體激素藥

13、物的紅外光譜特征甾體激素藥物的紅外光譜特征n紅外光譜主要反映了化合物中官能團的紅外光譜主要反映了化合物中官能團的特征特征.n甾體藥物中有那些紅外活性基團甾體藥物中有那些紅外活性基團?n1.基本骨架：基本骨架：n大量的大量的CHCH3 3、CHCH2 2、CHCH基團基團n.n. C-H 15001300 cm-1CH3 2962 cm-1，反對稱伸縮振動反對稱伸縮振動 2872 cm-1 ，對稱伸縮振動對稱伸縮振動 CH2 2926 cm-1，反對稱伸縮振動反對稱伸縮振動 2853 cm-1 ，對稱伸縮振動對稱伸縮振動 HC 29702850cm-11375 cm-1處的吸收分叉，等高處的吸收

14、分叉，等高CHH3CH3CCH31460，1375 cm-1同時有吸收同時有吸收伸縮伸縮振動振動彎曲彎曲振動振動n2.此類藥物大部分含有此類藥物大部分含有C=C雙鍵雙鍵a. CH伸縮振動頻率大于伸縮振動頻率大于3000cm-1（峰尖、弱）大約峰尖、弱）大約3040 3010cm-1 b. CC伸縮振動頻率在伸縮振動頻率在16201585cm-1, （峰尖、中等）峰尖、中等）c.CH（面外彎曲振動頻率）與雙鍵上氫面外彎曲振動頻率）與雙鍵上氫的數(shù)目，即取代情況有關(guān)。的數(shù)目，即取代情況有關(guān)。n3.此類藥物大部分含有羰基此類藥物大部分含有羰基n羰基峰極強羰基峰極強, 鑒別價值大鑒別價值大.n C=O

15、六員環(huán)六員環(huán) 17201705cm-1n C=O 五員環(huán)五員環(huán) 17491742cm-1n C=O C20 17101706cm-1n C=O 4 3 酮酮16841620cm-1n4.此類藥物還可能含有羥基、醚鍵等特此類藥物還可能含有羥基、醚鍵等特征結(jié)構(gòu)。征結(jié)構(gòu)。甾體激素藥物某些基團的紅外特征頻率甾體激素藥物某些基團的紅外特征頻率n見書見書292-293頁表頁表10-3n炔雌醇的紅外吸收光譜炔雌醇的紅外吸收光譜CHOHHHOHCH結(jié)構(gòu)特征：結(jié)構(gòu)特征：苯環(huán)、酚羥基、苯環(huán)、酚羥基、C17 OH C17 乙炔基乙炔基1505cm-1OH 3505cm -13300cm-1CH CC 1590cm-

16、13610cm-1OH 酚羥基酚羥基醇羥基醇羥基1616cm-1苯環(huán)的骨苯環(huán)的骨架振動架振動CHOHHHOHCH亞甲基、角甲基亞甲基、角甲基吸收帶吸收帶CH苯環(huán)指紋區(qū)苯環(huán)指紋區(qū)COHHHCH3O黃體酮黃體酮薄層色譜法薄層色譜法n特點特點：n簡便、快速、分離效能高。簡便、快速、分離效能高。n主要用于甾體激素類藥物主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別制劑的鑒別nChPChP很多甾體激素制劑均用該法鑒別。很多甾體激素制劑均用該法鑒別。n應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍：n甾體激素制劑的鑒別、純度檢查以及含甾體激素制劑的鑒別、純度檢查以及含量測定前的分離和制劑穩(wěn)定性的研究。量測定前的分離和制劑穩(wěn)定性的研究。 方法方法：對

17、照品法對照品法 1.供試品點樣通常需做供試品點樣通常需做前處理前處理（如有機溶劑提（如有機溶劑提?。⑸湟?、片劑及軟膏劑等輔料的干擾。?。?，消除注射液、片劑及軟膏劑等輔料的干擾。 2.要求供試品溶液所顯主斑點的要求供試品溶液所顯主斑點的顏色顏色和和位置位置與對與對照品溶液的主斑點相同。照品溶液的主斑點相同。顯色方法顯色方法：多用：多用熒光顯色法或熒光淬滅法熒光顯色法或熒光淬滅法熒光顯色熒光顯色高效液相色譜法高效液相色譜法n主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別 方法：方法：對照品法對照品法 一般在含量測定的同時進行鑒別一般在含量測定的同時進行鑒別. 要求在含量測

18、定項下記錄的色譜圖中，要求在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品峰的供試品峰的t tR R與對照品峰的與對照品峰的t tR R一致。一致。第三節(jié)、特殊雜質(zhì)檢查第三節(jié)、特殊雜質(zhì)檢查n 必要性必要性 ：甾體激素藥物多由結(jié)構(gòu)改造來，甾體激素藥物多由結(jié)構(gòu)改造來，可能帶來可能帶來原料、中間體、異構(gòu)體、降解產(chǎn)原料、中間體、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物物以及以及試劑、溶劑試劑、溶劑等。等。n藥典規(guī)定檢查的重要項目有：藥典規(guī)定檢查的重要項目有： n（一）其他甾體（一）其他甾體n（二）硒（二）硒n（三）有機溶劑殘留量（三）有機溶劑殘留量 n（四）游離磷酸鹽（四）游離磷酸鹽 n此外，有些甾體藥物還規(guī)定其他檢查項目。此外，有些甾

19、體藥物還規(guī)定其他檢查項目。OHH3COOHH3COOHOLi/NH3 C2H5OH（可能殘留）可能殘留）弱酸弱酸雌二醇雌二醇3甲醚甲醚（可能殘留）可能殘留）苯丙酸諾龍苯丙酸諾龍的合成路線的合成路線I（可能殘留）可能殘留）II（可能殘留）可能殘留）OHOOCO(CH2)2-C6H5O強酸強酸（可能殘留）可能殘留）苯丙酰氯苯丙酰氯（可能殘留）可能殘留）HClIII（可能殘留）可能殘留）OHO苯丙酸諾龍苯丙酸諾龍的合成路線的合成路線II（一）其他甾體（一）其他甾體 定義定義：藥物中存在的：藥物中存在的具有甾體結(jié)構(gòu)且與具有甾體結(jié)構(gòu)且與標示藥物結(jié)構(gòu)不同標示藥物結(jié)構(gòu)不同的其他化合物都稱為的其他化合物都稱為

20、 “其他甾體其他甾體”。 具有互相不同的藥理作用！具有互相不同的藥理作用！ 有必要檢查有必要檢查來源來源：原料、中間體、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物：原料、中間體、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物特點特點：（1）可能存在）可能存在多個多個甾體雜質(zhì)甾體雜質(zhì) （2）結(jié)構(gòu)）結(jié)構(gòu)類似類似，多數(shù)為，多數(shù)為未知物質(zhì)未知物質(zhì)分析方法必須分析方法必須具有一定具有一定分離分離能力能力其他甾體檢查法其他甾體檢查法n （一）一）TLC檢查法（高低濃度對比法）檢查法（高低濃度對比法）n使用使用最為普遍最為普遍的甾體特殊雜質(zhì)檢查法的甾體特殊雜質(zhì)檢查法n采用采用供試品的稀釋溶液供試品的稀釋溶液做對照，以做對照，以對照溶液斑對照溶液斑點顏色點顏色為參

21、比來控制雜質(zhì)限量。為參比來控制雜質(zhì)限量。n中國藥典中國藥典2002005 5版版3636種甾體激素原料藥物，其中種甾體激素原料藥物，其中3333種采用該方法檢查特殊雜質(zhì)！種采用該方法檢查特殊雜質(zhì)！n例：教材例：教材2 29494頁醋酸潑尼松、炔雌醇的雜質(zhì)檢查頁醋酸潑尼松、炔雌醇的雜質(zhì)檢查 3333種甾體激素藥物種甾體激素藥物TLCTLC色譜條件的特點總結(jié)色譜條件的特點總結(jié) ： 1. 1.薄層板：大多采用薄層板：大多采用硅膠硅膠G G板板，少數(shù)采用硅膠，少數(shù)采用硅膠GFGF254254或硅膠或硅膠HFHF254254。 2. 2.溶劑溶劑: : 氯仿氯仿- -甲醇甲醇/ /甲醇甲醇/ /氯仿氯仿

22、/ /丙酮丙酮 3. 3.展開劑系統(tǒng)：首選不同比例的展開劑系統(tǒng)：首選不同比例的二氯甲烷二氯甲烷- -乙醚乙醚- -甲甲醇醇- -水水混合溶劑。（其他：苯混合溶劑。（其他：苯/ /無水乙醇無水乙醇/ /二氯甲烷二氯甲烷- -甲醇甲醇- -水水/ /氯仿氯仿- -甲醇等）甲醇等） 4. 4.顯色劑：首選顯色劑：首選堿性四氮唑藍試液堿性四氮唑藍試液。 （其他：硫酸（其他：硫酸- -乙醇乙醇/ /濃硫酸濃硫酸/10%/10%磷鉬酸磷鉬酸- -乙醇）乙醇） 5. 5.檢測法：紫外燈檢測法：紫外燈(254(254nm/365nm)nm/365nm)/ /日光檢視日光檢視。TLC判定方法判定方法v 規(guī)定雜質(zhì)

23、斑點規(guī)定雜質(zhì)斑點數(shù)目數(shù)目v 規(guī)定雜質(zhì)斑點規(guī)定雜質(zhì)斑點顏色顏色 供試品溶液如顯雜供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點，不得多于質(zhì)斑點，不得多于XX個，其顏色與對個，其顏色與對照液的主斑點比較，照液的主斑點比較，不得更深。不得更深。 高低濃度對比法高低濃度對比法雌二醇雜質(zhì)檢查雌二醇雜質(zhì)檢查TLCTLC圖圖特點：特點： （1 1）簡便易行，不需）簡便易行，不需特殊的儀器；特殊的儀器； （2 2）不需對照品不需對照品；（3 3）要求雜質(zhì)斑點與主）要求雜質(zhì)斑點與主成分斑點的顏色相近成分斑點的顏色相近且顯色靈敏度也接近。且顯色靈敏度也接近。（4 4）不能控制全部雜質(zhì)不能控制全部雜質(zhì)的限量；也不能控制的限量；也不能控制雜

24、質(zhì)的總量雜質(zhì)的總量自身對照自身對照（二）二）HPLC法法n方法方法：n1.自身對照法（加自身對照法（加/不加校正因子）不加校正因子）n采用采用供試品的稀釋溶液供試品的稀釋溶液做對照，以做對照，以對照對照溶液主峰面積溶液主峰面積為參比來控制雜質(zhì)限量。為參比來控制雜質(zhì)限量。n例：教材例：教材2 29595頁黃體酮雜質(zhì)檢查為頁黃體酮雜質(zhì)檢查為不加不加校正因子的自身對照法。校正因子的自身對照法。n 2.主成分歸一化法（主成分歸一化法（HPLC-UV法檢測法檢測靈敏度較低時）靈敏度較低時）對照溶液0.02mg/ml供試液1 mg/ml黃體酮黃體酮中中有關(guān)物質(zhì)有關(guān)物質(zhì)檢查檢查供試品溶液的雜質(zhì)峰供試品溶液的

25、雜質(zhì)峰數(shù)不得超過數(shù)不得超過1 1個，其面?zhèn)€，其面積不得大于對照液的積不得大于對照液的主峰面積的主峰面積的3/43/4n 甾體激素藥物甾體激素藥物HPLCHPLC色譜條件的色譜條件的特點總結(jié)特點總結(jié) ：n1.1.色譜柱：色譜柱：十八烷基硅烷鍵和硅膠十八烷基硅烷鍵和硅膠。 2. 2.流動相：各種不同比例的流動相：各種不同比例的甲醇甲醇- -水水混合混合溶劑。溶劑。 3. 3.檢測器：紫外（檢測器：紫外（214214nm/254nm/281nmnm/254nm/281nm，230nm/288nm230nm/288nm） 4. 4.判定方法判定方法: :規(guī)定雜質(zhì)峰規(guī)定雜質(zhì)峰數(shù)目數(shù)目 規(guī)定雜質(zhì)峰規(guī)定雜質(zhì)

26、峰面積面積HPLC法進行藥物特殊雜質(zhì)檢查的法進行藥物特殊雜質(zhì)檢查的特點特點 （1）需特殊的儀器；）需特殊的儀器； （2）不需對照品；）不需對照品； （3）可以控制雜質(zhì)的總量可以控制雜質(zhì)的總量； （4）雜質(zhì)與主成分測定的靈敏度雜質(zhì)與主成分測定的靈敏度可可以不同以不同。（用校正因子消除）。（用校正因子消除）（二）硒的檢查（二）硒的檢查來源來源 合成中用二氧化硒合成中用二氧化硒( (SeOSeO2 2) )脫氫脫氫原理原理nmA 環(huán)環(huán)己己烷烷苯苯并并苯苯硒硒二二唑唑二二氨氨基基萘萘 ,Se, .pH SeSe鹽酸羥胺鹽酸羥胺氧瓶燃燒氧瓶燃燒方法方法劇毒劇毒含硒物質(zhì)含硒物質(zhì)限量限量0.01%0.01%

27、（三）有機殘留溶劑的檢查（三）有機殘留溶劑的檢查n 必要性必要性 ：甾體激素藥物在生產(chǎn)工藝中使：甾體激素藥物在生產(chǎn)工藝中使用大量用大量有機溶劑有機溶劑。（特別是甲醇和丙酮）。（特別是甲醇和丙酮）n測定法：測定法：GCGC法法n示例示例 ：地塞米松磷酸鈉有機殘留溶劑的：地塞米松磷酸鈉有機殘留溶劑的檢查方法。（教材檢查方法。（教材396396頁）頁）判定標準判定標準1.甲醇甲醇 不得超過不得超過0.3%（g/g） 2.丙酮丙酮 不得超過不得超過0.5%（g/g） 內(nèi)標法內(nèi)標法 + 校正因子定量校正因子定量!限量確定的原則限量確定的原則藥品注冊的國際技術(shù)要求（藥品注冊的國際技術(shù)要求（ICHICH）規(guī)

28、定規(guī)定 甲醇甲醇第二類毒性溶劑第二類毒性溶劑限量限量0.3% 100） UV法法含量測定含量測定n與羰基試劑（異煙肼）反應(yīng)與羰基試劑（異煙肼）反應(yīng) 異煙肼比色法異煙肼比色法n2. C C1717 醇酮基（皮質(zhì)激素）醇酮基（皮質(zhì)激素）n還原性還原性 與氧化劑四氮唑鹽反應(yīng)顯色與氧化劑四氮唑鹽反應(yīng)顯色 四氮唑比色法四氮唑比色法n3.甾體母核（特別是雌激素母核）甾體母核（特別是雌激素母核）n可以以強酸的呈色可以以強酸的呈色 Kober反應(yīng)比色法反應(yīng)比色法n甾類藥物含量測定方法有：甾類藥物含量測定方法有：n1.反應(yīng)比色法反應(yīng)比色法（異煙肼比色法（異煙肼比色法、四氮唑比四氮唑比色法色法、Kober反應(yīng)比色

29、法）反應(yīng)比色法）n2.紫外分光光度法紫外分光光度法n3.高效液相色譜法高效液相色譜法n4.柱前衍生化柱前衍生化氣相色譜法、氣相色譜法、GC-MS法法n5.放射免疫分析法（放射免疫分析法（FIA），），ELISA技術(shù)技術(shù)一、一、高效液相色譜法高效液相色譜法n必要性必要性：甾體激素類藥物常含有結(jié)構(gòu)甾體激素類藥物常含有結(jié)構(gòu)相似的其他甾體雜質(zhì)，對利用結(jié)構(gòu)特相似的其他甾體雜質(zhì)，對利用結(jié)構(gòu)特征設(shè)計的比色法有干擾。征設(shè)計的比色法有干擾。n優(yōu)點優(yōu)點：用樣量少，靈敏度高，用樣量少，靈敏度高，分離效分離效果好，專屬性強果好，專屬性強 ChP中：中：89種種甾體激素原料和制劑甾體激素原料和制劑，有，有43種采種采用

30、用RP-HPLC法（一般用內(nèi)標法）含量測定，法（一般用內(nèi)標法）含量測定，占該類藥物含量測定方法的占該類藥物含量測定方法的48%，居首位，居首位。n實例實例：教材：教材397頁頁n特點總結(jié)特點總結(jié)：n1.分離模式分離模式: 反相分配反相分配色譜色譜n2.固定相固定相: 十八烷基硅烷鍵合硅膠十八烷基硅烷鍵合硅膠(ODS)n3.流動相流動相: 甲醇和水的混合液甲醇和水的混合液 ( (個別采用甲醇個別采用甲醇水水乙醚、乙腈乙醚、乙腈- -水水- -乙丙醇、乙丙醇、甲醇甲醇- -四氫呋喃四氫呋喃- -水等溶劑系統(tǒng)，有時在流動相水等溶劑系統(tǒng)，有時在流動相中加入中加入醋酸鹽緩沖液醋酸鹽緩沖液或或磷酸鹽緩沖液

31、磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH值）值）n4.紫外直接檢測紫外直接檢測: (240nm或或280nm附近附近)n4 43 3酮基和苯環(huán)酮基和苯環(huán)二、紫外分光光度法二、紫外分光光度法n1.皮質(zhì)激素、雄性激素、孕激素皮質(zhì)激素、雄性激素、孕激素n4-3-酮基（酮基（C=C-C=O）共軛系統(tǒng)共軛系統(tǒng)nmax=240nmn 2. 雌激素（具有苯環(huán)）雌激素（具有苯環(huán)）n苯環(huán)（苯環(huán)（C=C-C=C）共軛系統(tǒng)，共軛系統(tǒng)，nmax=280nm（此吸收較弱）此吸收較弱）UV化合物結(jié)構(gòu)max(nm)腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素孕激素雌激素2804-3-酮240醋酸地塞米松n優(yōu)點優(yōu)點：準確準確、簡便，被廣泛用于原料、簡便，被廣

32、泛用于原料和制劑的分析。和制劑的分析。n原料、注射液稀釋成原料、注射液稀釋成一定濃度一定濃度后即可直后即可直接測定。接測定。n但在但在片劑分析時需要預處理排除干擾。片劑分析時需要預處理排除干擾。 （賦形劑在（賦形劑在240240nmnm附近有吸收，需先用一附近有吸收，需先用一定溶劑提取、濾過。）定溶劑提取、濾過。）nChpChp中收載的中收載的89種甾體激素原料和制劑種甾體激素原料和制劑2525種用該法測定含量，占本類藥物分析種用該法測定含量，占本類藥物分析的的28%28%，僅次于，僅次于HPLCHPLC，居居第二位第二位。但現(xiàn)但現(xiàn)在正在被在正在被HPLCHPLC取代中！取代中！實例實例n1.

33、原料藥原料藥:n教材教材398頁頁: 炔雌醚炔雌醚n2.片劑片劑:n教材教材398頁頁: 醋酸潑尼松龍片醋酸潑尼松龍片n賦形劑在賦形劑在240240nmnm附近有吸收，需先用乙附近有吸收，需先用乙醇提取、濾過。醇提取、濾過。n計算計算 三、反應(yīng)比色法三、反應(yīng)比色法n方法介紹方法介紹:n比色法比色法: : 直接比色法直接比色法光度活性藥物光度活性藥物 反應(yīng)比色法反應(yīng)比色法非光度活性藥物非光度活性藥物弱、非光度活弱、非光度活性藥物性藥物強光度活性強光度活性藥物藥物化學反應(yīng)化學反應(yīng)優(yōu)點優(yōu)點：1. 適用于非光度活性藥物適用于非光度活性藥物2. 使待測組光譜位移，避免干擾，使待測組光譜位移，避免干擾，增

34、加選擇性增加選擇性3. 增加測定靈敏度增加測定靈敏度甾體激素的反應(yīng)比色法甾體激素的反應(yīng)比色法n異煙肼比色法異煙肼比色法、四氮唑比色法四氮唑比色法、Kober反反應(yīng)比色法應(yīng)比色法n（一）、異煙肼比色法（一）、異煙肼比色法n原理原理：異異煙煙腙腙（黃黃）異異煙煙肼肼酮酮基基（或或其其它它）3CHCl（縮合）（縮合）在一定波長下在一定波長下具有最大吸收具有最大吸收 四氮唑比色法四氮唑比色法 n基本原理：腎上腺皮質(zhì)激素類基本原理：腎上腺皮質(zhì)激素類C17-醇酮醇酮基具有還原性，在強堿性溶液中能將四基具有還原性，在強堿性溶液中能將四氮唑鹽氮唑鹽定量地還原定量地還原為有色甲為有色甲 n多為紅色或藍色。多為紅

35、色或藍色。n formazan在一定波長處進行比色測定。在一定波長處進行比色測定。 有有色色甲甲瓚瓚四四氮氮唑唑鹽鹽醇醇酮酮基基 COH -還原還原反應(yīng)機理反應(yīng)機理nC17-醇酮基失去醇酮基失去2個電子氧化為個電子氧化為20-酮基酮基-21醛基，在堿催化下，分子內(nèi)部重排。醛基，在堿催化下，分子內(nèi)部重排。n而四氮唑鹽得到而四氮唑鹽得到2個電子，開環(huán)形成甲個電子，開環(huán)形成甲而顯色。而顯色。四氮唑鹽的種類四氮唑鹽的種類n1.氯化三苯四氮唑氯化三苯四氮唑n2，3，5-三苯基氯化四氮唑三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chlorid，TTC）n其還原產(chǎn)物為不溶于水的

36、其還原產(chǎn)物為不溶于水的深深紅色紅色三苯甲三苯甲(max:480490nm) 紅四氮紅四氮唑（唑（red tetrazoline，RT）。n2.藍四氮唑藍四氮唑（blue tetrazoline，BT），），即即3，3-二甲氧苯基二甲氧苯基-雙雙-4，4-（3，5-二二苯基）氯化四氮唑苯基）氯化四氮唑3，3-dianisole-bis4，4-（3，5-diphenyl）tetrazolium chloriden其還原產(chǎn)物為其還原產(chǎn)物為暗藍色暗藍色的雙甲的雙甲 ，max525nm。測定方法測定方法對照品法對照品法ChP TTC（RT） BP TTC（RT）USP BT 氫氫氧氧化化四四甲甲基基銨銨

37、對對照照液液供供試試液液ATTC4045暗暗A(chǔ)nm測定測定485實例：醋酸地塞米松磷酸鈉含量測定實例：醋酸地塞米松磷酸鈉含量測定nChP方法方法供試液：供試液：精密量取本品精密量取本品5 mL （約醋酸地塞米約醋酸地塞米松松25 mg），），置置100mL量瓶中，加無水乙醇量瓶中，加無水乙醇振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。濾過，振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。濾過，取續(xù)濾液為供試品溶液。取續(xù)濾液為供試品溶液。 對照液：對照液：精密稱取醋酸地塞米松磷酸鈉標準品精密稱取醋酸地塞米松磷酸鈉標準品25 mg，置置100mL量瓶中，加無水乙醇振搖量瓶中，加無水乙醇振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。使溶解，

38、并稀釋至刻度，搖勻。測定法：測定法：精密量取上述溶液各精密量取上述溶液各1 mL，分別分別置置干燥具塞試管干燥具塞試管中，各中，各精密加無水乙醇精密加無水乙醇9 mL與氯化三苯四氮唑試液與氯化三苯四氮唑試液1 mL，搖搖勻，再各勻，再各精密加氫氧化四甲基銨試液精密加氫氧化四甲基銨試液1 mL，搖勻，在搖勻，在25暗處放置暗處放置4050分分鐘，照分光光度法，在鐘，照分光光度法，在485 nm的波長處的波長處分別測定吸收度，計算。分別測定吸收度，計算。操作應(yīng)避光。操作應(yīng)避光。水分影響水分影響反應(yīng)速度反應(yīng)速度制造強堿制造強堿性環(huán)境性環(huán)境反應(yīng)過程、反應(yīng)產(chǎn)反應(yīng)過程、反應(yīng)產(chǎn)物怕光物怕光討論討論各種因素的

39、影響各種因素的影響n1.1.基團的影響基團的影響：C11= O C11OHC21OH C21-酯酯C16無論何種取代基無論何種取代基2. 2. 溶劑、水分的影響溶劑、水分的影響含水量含水量5%含水含水10%A10%含水含水30%幾無反應(yīng)幾無反應(yīng) 無水乙醇無水乙醇醛醛 A 無醛無水乙醇無醛無水乙醇C20C21ABCD12345678910111213141516171819n3.3.堿的種類和加入順序的影響堿的種類和加入順序的影響：反應(yīng)應(yīng)在反應(yīng)應(yīng)在強堿性強堿性（pH13.75）條件下進行條件下進行以以氫氧化四甲基銨氫氧化四甲基銨的結(jié)果最佳的結(jié)果最佳. 皮質(zhì)激素和氫氧化四甲基銨長時間（皮質(zhì)激素和氫

40、氧化四甲基銨長時間（2424h h）接觸后，部分分解接觸后，部分分解. .加入順序：加入順序：氫氫氧氧化化四四甲甲基基銨銨試試液液四四氮氮唑唑鹽鹽皮皮質(zhì)質(zhì)激激素素溶溶液液4. 4. O O2 2與光線的影響與光線的影響反應(yīng)過程反應(yīng)過程反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)物怕光怕光避光、快速避光、快速O O2 2影響影響顏色強顏色強度和穩(wěn)度和穩(wěn)定性定性隔絕空氣、隔絕空氣、 快速、充快速、充N2N2n5. 5. 溫度與時間溫度與時間ntn但但t 甲甲 分解分解%n一般以室溫或一般以室溫或30恒溫條件下顯色，恒溫條件下顯色，易得重現(xiàn)性較好的結(jié)果。易得重現(xiàn)性較好的結(jié)果。ChP 25 4045BP 30 1h特點：特點：缺點

41、缺點 影響因素太多，操作不易掌握。影響因素太多，操作不易掌握。優(yōu)點優(yōu)點 專屬性很好專屬性很好。意義：測定結(jié)果能指示藥品的穩(wěn)定性（氧意義：測定結(jié)果能指示藥品的穩(wěn)定性（氧化及降解產(chǎn)物無此反應(yīng)）化及降解產(chǎn)物無此反應(yīng)） 廣泛應(yīng)用于皮質(zhì)激素的穩(wěn)定性研究。廣泛應(yīng)用于皮質(zhì)激素的穩(wěn)定性研究。OOHCH3NCONHN H2OHCH3CONHNN+_H2O異煙肼比色法異煙肼比色法n反應(yīng)式反應(yīng)式：具有兩個酮基的甾體激素具有兩個酮基的甾體激素黃體酮、氫化可的松黃體酮、氫化可的松可可形成形成雙腙雙腙。 方法方法 ：對照品法：對照品法： 異異煙煙肼肼?lián)]揮去去乙乙醇醇對對照照液液供供試試液液A CHCl暗暗45實例：實例：

42、nChP：倍他倍他米松米松倍他米松磷酸鈉倍他米松磷酸鈉倍他米松倍他米松討論討論n1.1.溶劑選擇：溶劑選擇：無水乙醇和無水甲醇無水乙醇和無水甲醇好，好，其他溶劑受異煙肼鹽酸鹽溶解度影響不其他溶劑受異煙肼鹽酸鹽溶解度影響不宜采用。宜采用。n甲醇穩(wěn)定性較好，呈色強度較高。但對甲醇穩(wěn)定性較好，呈色強度較高。但對植物油溶解度小。一般采用無水乙醇作植物油溶解度小。一般采用無水乙醇作為整個反應(yīng)的介質(zhì)。（為整個反應(yīng)的介質(zhì)。（倍他米松、倍他米倍他米松、倍他米松磷酸鈉等）松磷酸鈉等）n2.2.酸的種類和濃度以及異煙肼的濃度：酸的種類和濃度以及異煙肼的濃度：n酸與異煙肼試劑的摩爾比為酸與異煙肼試劑的摩爾比為2:1

43、2:1時可獲得時可獲得最大吸收度。最大吸收度。n酸度酸度異煙肼鹽異煙肼鹽n酸度酸度 AAn試液配制試液配制:n取異煙肼取異煙肼75mg75mg，加鹽酸加鹽酸0.0.1m11m1加甲醇使加甲醇使溶解成溶解成1 10000mlml。鹽酸：鹽酸：0.00740.0074mol/Lmol/L（硫酸：（硫酸：0.00370.0037mol/Lmol/L 醋酸：醋酸：4.44.4mol/Lmol/L）異煙肼：異煙肼：0.003650.00365mol/Lmol/L n3.3.水分、水分、O O2 2與光線的影響與光線的影響n(1)(1)水分增高吸收度降低，縮合物水解；水分增高吸收度降低，縮合物水解；n可逆

44、反應(yīng)可逆反應(yīng):n含水量含水量腙水解腙水解A%n故儀器及試劑應(yīng)盡量避免水分故儀器及試劑應(yīng)盡量避免水分n(2)(2)溫度升高，反應(yīng)加速。溫度升高，反應(yīng)加速。n(3)(3)在不揮發(fā)溶劑、不吸收水分時，光與在不揮發(fā)溶劑、不吸收水分時，光與氧不影響反應(yīng)。氧不影響反應(yīng)。（具塞容器）（具塞容器）n4.4.反應(yīng)的專屬性：反應(yīng)的專屬性：n反應(yīng)速度反應(yīng)速度C3 = O C17= O 、 C20= O C11= O 不反應(yīng)不反應(yīng)室溫不到室溫不到1 1h h即可定量即可定量地與酸性異煙肼反應(yīng)地與酸性異煙肼反應(yīng)長時間放置或加熱長時間放置或加熱后方可反應(yīng)完全后方可反應(yīng)完全本法對本法對4 4-3-3-酮基甾體酮基甾體具有一

45、定的專屬性。具有一定的專屬性。C20C21ABCD12345678910111213141516171819KOBER反應(yīng)比色法反應(yīng)比色法n定義定義：指：指雌激素雌激素與硫酸與硫酸-乙醇共熱呈色，乙醇共熱呈色，用水或稀硫酸稀釋后重新加熱發(fā)生顏色用水或稀硫酸稀釋后重新加熱發(fā)生顏色改變，并在改變，并在515nm附近有最大吸收。附近有最大吸收。n原理：（兩步反應(yīng)）原理：（兩步反應(yīng)）max=465max=515桃桃紅紅黃黃色色雌雌激激素素乙乙醇醇 OHSOHOHCH3O SOHCH3CH3O SOHCH3CH3O實線實線第一步反應(yīng)第一步反應(yīng)虛線虛線第二步反應(yīng)第二步反應(yīng)n可能原理可能原理（了解）（了解）

46、n通過通過去羥基、重排及甲基由去羥基、重排及甲基由C13移到移到C17；然后被硫酸氧化形成具有較長共軛雙鍵發(fā)然后被硫酸氧化形成具有較長共軛雙鍵發(fā)色團的產(chǎn)物色團的產(chǎn)物 又進一步生成具有吸收光又進一步生成具有吸收光譜紅移發(fā)色團的產(chǎn)物。譜紅移發(fā)色團的產(chǎn)物。max=515nm實例實例nChP 復方炔諾酮滴丸中炔雌醇片的含量復方炔諾酮滴丸中炔雌醇片的含量測定方法測定方法n教材教材402頁頁缺點：缺點：1.第二步反應(yīng)難以徹底第二步反應(yīng)難以徹底進行，會出現(xiàn)雙色。進行，會出現(xiàn)雙色。 2. 輔料，賦形劑干擾測定輔料，賦形劑干擾測定改進鐵酚試劑法鐵酚試劑法五、體內(nèi)甾體激素類藥物分析（了解）五、體內(nèi)甾體激素類藥物分

47、析（了解）四、非水滴定四、非水滴定米非司酮米非司酮Doping control濫用藥物檢測刺激劑刺激劑麻醉劑麻醉劑-阻斷劑阻斷劑利尿劑利尿劑遮蔽劑遮蔽劑合成類固醇及合成類固醇及22激動劑激動劑肽類激素肽類激素外源性內(nèi)源性1、甾體激素類藥物的結(jié)構(gòu)中能和四、甾體激素類藥物的結(jié)構(gòu)中能和四氮唑鹽發(fā)生顯色反應(yīng)的基團氮唑鹽發(fā)生顯色反應(yīng)的基團 A. 酚羥基酚羥基 B. 活潑次甲基活潑次甲基 C. 甲酮基甲酮基 D. C17 -醇酮基醇酮基 E. 酮基酮基2、用異煙肼比色法測定甾體激素藥物含、用異煙肼比色法測定甾體激素藥物含量時，其溶液的環(huán)境是量時，其溶液的環(huán)境是 A酸性酸性 B中性中性 C強堿性強堿性 D弱