色譜學(xué)lecture實用教案

1、NORMAL PHASE 1980 2004 30% 5% Silica Gel 47% 44% Silica based bonded phases Diol Amino Cyano 3% 1% Alumina 20% 50% Chiral Bonded PhasesPrinciple:Principle: Adsorption of analytes on the polar, weakly acidic surface of silica gel.Stationary Phase.:Stationary Phase.: Silica (pH 2-8), Alumina (pH 2 - 1

2、2), Bonded Diol, and NH2, or CNMobile Phase:Mobile Phase: Non-polar solvents (Hexane, CHCl3)ApplicationsApplications: Non-polar and semi-polar samples; hexane soluble; positional isomers.第1頁/共60頁第一頁，共60頁。NP: SEPARATION PRINCIPLE Polar (specific but nonionic) interactions of analyte with polar adsorp

3、tion sites (SiOH, -NH2, -CN, Diol) cause its retention Different sorption affinities between analytes result in their separation More polar analytes retained longer Analytes with larger number of polar functional group are retained longer Structural isomers are often separated第2頁/共60頁第二頁，共60頁。外消旋體化合

4、物的色譜(s p)分離圖許志剛, 艾萍, 袁黎明,醋酸纖維素液相色譜固定相的制備與手性拆分化學(xué)(huxu)研究, 2006, 17, 83-85正己烷 異丙醇(體積比為9 1)作流動相流速為0. 5 mL/min,紫外檢測(jin c)波長為254 nm第3頁/共60頁第三頁，共60頁。纖維素及其衍生物作為高效液相色譜(s p)手性固定相的研究進(jìn)展孟磊，袁黎明(lmng)，化學(xué)試劑, 2001,23(4),220223第4頁/共60頁第四頁，共60頁。分離(fnl)機理普遍接受的是Dalgliesh的3點作用原理:a.對映體與固定相之間存在氫鍵(或-)作用;b.偶極-偶極相互作用;c.手性空腔

5、的立體作用。第5頁/共60頁第五頁，共60頁。海藻(hi zo)糖、龍膽二糖、蜜二糖鍵合硅膠手性固定相的制備和性能宋卿,李芙蓉,字敏,彭雅,袁黎明(lmng)，化學(xué)研究，2009，20， 95-97第6頁/共60頁第六頁，共60頁。手性分離能力(nngl)為海藻糖龍膽二糖蜜二糖第7頁/共60頁第七頁，共60頁。手性固定相: a. Chiralcel OD, b. Chiralpak AD-H;流動(lidng)相:V(正己烷)/V(異丙醇)=80 20;流速: 0.9 mL/min; 檢測波長: 254 nm手性柱:纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯) (Chiralcel OD)和直鏈

6、淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯) (Chiralpak AD-H)不銹鋼手性柱, 25.00.46 cm含磷手性化合物在多聚糖類手性固定(gdng)相上的手性分離李凌云(ln yn),王立新,葉勇,錢寶英,高如瑜，分析試驗室，2004，23，14-17第8頁/共60頁第八頁，共60頁。V(正己烷)/V(異丙醇): A 90 10, B 80 20, C 70 30, D 60 40;V(正己烷)/V(正丙醇): E 90 10, G 70 30;V(正己烷)/V(乙醇(y chn): F 90 10, H. 70 30. 0.9 mL/min, 254 nm表1不同(b tn)色譜條件

7、下化合物1 在OD和AD手性柱上的分離結(jié)果第9頁/共60頁第九頁，共60頁。正相色譜法同時測定(cdng)黃豆醬中的兩類防腐劑Allsphere Cyano(CN)柱(250 mm4.6 mm i.d.,5m)為分離柱,二氯甲烷-乙腈(92 8)為流動(lidng)相(乙酸調(diào)pH 5.5),流速:1.0 mL/min,檢測波長240 nm。方法(fngf)檢出限0.050.1g/g?；厥章试?0.61%98.36%之間標(biāo)準(zhǔn)品苯甲酸(BA)、山梨酸(SA)和對羥基苯甲酸甲酯(MP)、乙酯(EP)、丁酯(BP)各1.0 mg注:1為SA;2為BA周建科,劉瑞英,宋歌,張明翠,中國調(diào)味品, 2009

8、,34, 93-98第10頁/共60頁第十頁，共60頁。Reversed-Phase HPLC Principle: Partition of analytes between mobile phase and stagnant phase inside the pore space + adsorption on the surface of bonded phase. Stationary Phase: Hydrophobic surfaces of moieties bonded on silica (C18, C8, C5, Phenyl, CN) Mobile phase: Meth

9、anol or Acetonitrile and Water. Applications: 80% of all separations performed with RP HPLC.第11頁/共60頁第十一頁，共60頁。REVERSED PHASE SEPARATION PRINCIPLE Nonpolar (nonspecific) interactions of analyte with hydrophobic adsorbent surface (-C18, C8, Phenyl, C4) Different sorption affinities between analytes r

10、esults in their separation More polar analytes retained less Analytes with larger hydrophobic part are retained longer structural isomers maybe more challenging in this mode第12頁/共60頁第十二頁，共60頁。反相色譜的保留機理(j l)疏溶劑理論雙保留機理(j l)分離對象：同系物：烷烴數(shù)tR 直鏈tR支鏈tR化合物極性 tR固定相對組分保留的影響：碳鏈長度：碳鏈 tR烷基覆蓋量：覆蓋量 tR第13頁/共60頁第十三頁，

11、共60頁。HPLC Effect of Carbon Chain Length on Separation第14頁/共60頁第十四頁，共60頁。反相色譜中流動(lidng)相選擇水有機改善劑常用：甲醇( ji chn)、乙腈、四氫呋喃、二氧六環(huán)極性：有機改善劑水洗脫能力：有機改善劑水極性順序：甲醇( ji chn)乙腈二氧六環(huán)四氫呋喃洗脫順序：水甲醇( ji chn)乙腈二氧六環(huán)四氫 呋喃第15頁/共60頁第十五頁，共60頁。HPLC Solvents Polarity for Reverse Phase第16頁/共60頁第十六頁，共60頁。HPLC Solvent Effect第17頁/共6

12、0頁第十七頁，共60頁。HPLC Effect of Modifier60:4050:5040:60Acetonitrile : Water第18頁/共60頁第十八頁，共60頁。Reversed-Phase vs. Normal PhaseSeparation of 2-Me-Phenol and 4-Me-Phenol in RP and NPSeparation of 2-Me-Phenol and 4-Me-Phenol in RP and NPReversed-PhaseMeOH/Water, Luna-C18Normal PhaseHexane/IPA, Luna-Si90/1060

13、/4095/598/2第19頁/共60頁第十九頁，共60頁。反相鍵合相色譜的優(yōu)點(yudin)流動相可選用水溶性 .樣品的溶解度范圍提高 .流動相可變性大 .柱重現(xiàn)(zhn xin)性好固定相表面化學(xué)能低 .平衡容易 .梯度洗脫固定相選擇多固定相耐溶劑沖洗 熱穩(wěn)定性好第20頁/共60頁第二十頁，共60頁。缺點(qudin)：流動相PH范圍要控制（PH28） PH太低：Si-C鍵易斷裂(dun li) PH太高：硅膠基質(zhì)易溶解游離的硅羥殘基影響分離 第21頁/共60頁第二十一頁，共60頁。 5 5 反相色譜法具有反相色譜法具有(jyu)(jyu)以下特以下特點點 （1）柱子使用壽命較長 （2）流

14、動相可靈活選擇（3）應(yīng)用范圍特別(tbi)廣泛 第22頁/共60頁第二十二頁，共60頁。6 6 反相液相色譜反相液相色譜(s p)(s p)的應(yīng)用的應(yīng)用占液相色譜占液相色譜(s p)(s p)的的70-80%70-80%小分子有機物、農(nóng)藥、氨基酸、低聚核苷酸、肽小分子有機物、農(nóng)藥、氨基酸、低聚核苷酸、肽生物大分子核酸、蛋白質(zhì)等（生物大分子核酸、蛋白質(zhì)等（50KD50KD）第23頁/共60頁第二十三頁，共60頁。HPLC - Applications第24頁/共60頁第二十四頁，共60頁。第25頁/共60頁第二十五頁，共60頁。稠環(huán)芳烴的分析稠環(huán)芳烴的分析(fnx)(fnx) 稠環(huán)芳烴多為致癌物

15、質(zhì)。 固定相：十八烷基(wn j)硅烷化鍵合相 流動相：20%甲醇-水 100%甲醇 線性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 溫：50 C 柱 壓：70 104 Pa 檢測器：紫外檢測器第26頁/共60頁第二十六頁，共60頁。服衍生物型手性固定(gdng)相分離a一氨基酸對映體的研究第27頁/共60頁第二十七頁，共60頁。呂海濤(hi to)，云自厚, 色譜，1995，13，8-11第28頁/共60頁第二十八頁，共60頁。R1CH3R2OHOCH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3TocopherolsTocopherolsOCH3CH3CH3CH3CH3OHCH3R1R2T

16、ocopherolsTocopherolsTocotrienolsTocotrienolsR R1 1R R2 2a-Tocopherol (a-T)a-Tocotrienol (a-3)_MeMeb-Tocopherol (b-T)b-Tocotrienol (b-3)MeHg-Tocopherol (g-T)g-Tocotrienol (g-3)HMed-Tocopherol (d-T)d-Tocotrienol (d-3)HHTocotrienolsGenesis silica column (250 x 4.6 mm, 4 m). Mobile phase: Hexane-1,4-di

17、oxane (96:4). . J. Chromatogr. A, 881 (2000) 217-227Separation of synthetic tocopherols by reversed phase HPLC (280 nm) :1) d-tocopherol, 2) g-tocopherol, 3) b-tocopherol, 4) a-tocopherol, 5)a-tocopheryl acetateFood Chemistry, 76 (2002) 357 362. Experimental Comparison of NP and RP HPLC第29頁/共60頁第二十九

18、頁，共60頁。 液液色譜法的固定相 由載體(zit)與固定液構(gòu)成 載體(zit): 全多孔型或薄殼型 涂漬適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?化學(xué)鍵合固定相液-液分配(fnpi)色譜法固定相第30頁/共60頁第三十頁，共60頁。第31頁/共60頁第三十一頁，共60頁。利用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵把各種不同(b tn)的有機分子（固定液）鍵合到載體表面，這樣制得的填料稱化學(xué)鍵合相，簡稱鍵合相。其優(yōu)點是：使用過程中固定液不遺失；化學(xué)性能穩(wěn)定，在pH28的溶液中不變質(zhì)；熱穩(wěn)定性好，一般在70以下穩(wěn)定；選擇性好；利于梯度洗脫。化學(xué)鍵合固定(gdng)相第32頁/共60頁第三十二頁，共60頁。 這類鍵合相表面鍵合的是極性很小

19、的烴基，如十八烷基(C18）、辛烷基（C8）、甲基與苯基(bn j)等。其中以十八烷基硅烷鍵合硅膠（或稱ODS）應(yīng)用最為廣泛，在化學(xué)鍵合相中約占 80。它適合分離非極性或極性小的試樣。在應(yīng)用中可選用極性較強的溶劑，如水。甲醇、乙醇或無機鹽的緩沖液作流動相。 十八烷基鍵合相（ODS鍵合相）是將十八烷基氯硅烷試劑與硅膠表面的硅羥基，經(jīng)多步反應(yīng)生成ODS鍵合相。 非極性鍵合相第33頁/共60頁第三十三頁，共60頁。晶體電陣計算(j sun):(j sun):硅膠表面的硅羥基密度為8 8個/nm2/nm2?；瘜W(xué)法測定:5:5個/nm2/nm2， 第34頁/共60頁第三十四頁，共60頁。 Si-OH +

20、 HO-R Si-OR + H2O 它的反應(yīng)條件是在150-250度下反應(yīng)3-8小時(xiosh)HPLC早期的一種正相鍵合填料Si-O-Si鍵型（硅膠與醇類物質(zhì)(wzh)反應(yīng)）第35頁/共60頁第三十五頁，共60頁。 Si-OH + SOCl2 Si-Cl + SO2 + HCl Si-Cl +R-NH2 Si-NHR +HClSi-N鍵型（硅膠(u jio)與胺類物質(zhì)反應(yīng)）第36頁/共60頁第三十六頁，共60頁。 利用格里亞反應(yīng)合成固定(gdng)相。 Si-Cl +RXMg Si-R +MgXCl 穩(wěn)定性相當(dāng)好! Si-C鍵型（硅膠(u jio)與鹵代烷反應(yīng)）第37頁/共60頁第三十七頁

21、，共60頁。 Si-OH +X-Si(R)(R1)(R2) Si-O- Si(R)(R1)(R2) +HX反應(yīng)式中，X為Cl、CH3O或C2H5O，R1、R2可以與X相同，也可以是甲基。主導(dǎo)鍵合類型，具有(jyu)良好熱、化學(xué)穩(wěn)定性，pH 2-9Si-O-Si-C鍵型（硅膠與有機(yuj)硅烷反應(yīng)）第38頁/共60頁第三十八頁，共60頁。第39頁/共60頁第三十九頁，共60頁。第40頁/共60頁第四十頁，共60頁。第41頁/共60頁第四十一頁，共60頁。30m15m5mInfluence of Particle Size on the Separation effect第42頁/共60頁第四十

22、二頁，共60頁。HPLC Effect of Particles Size第43頁/共60頁第四十三頁，共60頁。HPLC Particles Size第44頁/共60頁第四十四頁，共60頁。HPLC Column Diameter and Separation第45頁/共60頁第四十五頁，共60頁。Solvent properties affecting detectionSolvent properties affecting separationSolvent properties affecting flowViscosityMiscibility第46頁/共60頁第四十六頁，共60頁

23、。UV Cutoff -Solvent may interfere with detectionFor peptide analysis UV = 215 nm. Solvents thatabsorb UV at this wavelength would not be goodcandidates for the mobile phase.Refractive Index of Solvent vs Sample forRefractive Index detection (Carbohydrates)Volatility needed for HPLC Mass Spectrometry

24、(trifluoroacetic acid is a typical volatile buffer)Solvent Properties Affecting Detection第47頁/共60頁第四十七頁，共60頁。BUFFERS1)Buffers are needed to control the pH differences caused bythe sample matrix.2)Buffers are used to control the ionization of compoundsand therefore their retention by the column.第48頁/

25、共60頁第四十八頁，共60頁。Retention Time and pH in Reversed Phase3456789pHRelative Retention TimepKapartially chargedfully chargednot chargedWhen an acid or a base is ionized it becomes much less hydrophobic and will elute much earlier. Acids lose a proton and become ionized (negative charge) as pH increases.

26、Bases on the other hand, gain a proton and acquire a positive charge as pH decreases.BasicCompound第49頁/共60頁第四十九頁，共60頁。SOLVENT SELECTIVITYThe less time a compound spends in the stationary phase, the faster it will move through the column (less retention time).If two compounds are added to the column,

27、 the ratio of theirretention times is called the selectivity.The higher the selectivity, the better the separation.Selectivity can be increased by adjustment of the mobile and stationary phases.第50頁/共60頁第五十頁，共60頁。Solvent Selectivity TriangleRepresenting 3 “Polarity” factors1) Each dot in the triangl

28、erepresent a different solvent2) Solvents can be groupedbased on their type of polarity3) Solvents and solvent mixturesare available for just about anyseparation you may desire.第51頁/共60頁第五十一頁，共60頁。Viscosity - resistance to flowDifficult to force high viscosity solvents throughthe column.Mixing solve

29、nts can drastically change viscosity第52頁/共60頁第五十二頁，共60頁。Viscosity of Water-Organic Solvent Mixtures第53頁/共60頁第五十三頁，共60頁。Viscosity vs. PressureThe higher the solvent viscosity, the harder it is for thesolvent to move through a column, and the more pressure inrequired to move the solvent at a specific velocity. The pressurerequired to move a solvent through a column can be estimated bythe following formula:P = 250 L F / Dp2 Dc2Where P = pressure drop in psi.F = flow rate (mL/min)L = column length (cm)Dp = particle diameter (m)= solvent viscosity (cP)Dc = column