雜草抗藥性檢測方法--崔海蘭

1、雜草抗藥性檢測方法崔海蘭中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所抗藥性雜草的形成ALS抑制劑：ACCase抑制劑：其他除草劑：1/100,000？1/1,000,000 ？1/10,000,000 ？激素類&草甘膦： 1/100,000,000 ？除草劑選擇壓Heap，2015大穗看麥娘標(biāo)本。此標(biāo)本于1876年5月在俄國的葡萄園內(nèi)采集而來，保存在日內(nèi)瓦的植物公園內(nèi)（瑞士）。這個標(biāo)本為Alopecurusagrestis，是A. myosuroides（大穗看麥娘）以前的名稱樣本：734個；DNA提取不成功：49個；成功的：685個在采集于1888年的一株大穗看麥娘內(nèi)檢測出除草劑抗性ACC酶Leu1

2、781等位基因（法國）。1781突變生長更旺盛？低劑量下 Lolium rigidum快速形成抗藥性Neve and Powles (2005) Theor Appl Genet抗藥性形成影響因素除草劑選擇壓（頻度，劑量）生態(tài)適合度基因流（花粉.）抗性基因型的初始頻度抗藥性機理研究靶標(biāo)抗性非靶標(biāo)抗性突變過量表達代謝吸收、傳導(dǎo)隔離靶標(biāo)突變除草劑靶標(biāo)酶除草劑靶標(biāo)酶靶標(biāo)過量表達除草劑靶標(biāo)酶靶標(biāo)抗性雜草 ALS抑制劑抗性 ACCase抑制劑抗性 草甘膦抗性 雜草對ALS抑制劑的抗性 約159種抗性雜草ALS 突變位點205376 377 574653654交互抗性？http:/www.weedscie

3、編碼區(qū)全長 2000bp標(biāo)準(zhǔn)參照：擬南芥內(nèi)含子、基因拷貝數(shù)？122 197雜草對ACCase抑制劑的抗性 約48種抗性雜草CTBCCBCTPBC: biotin carboxylase 生物素羧化酶BCC: biotin carboxyl carrier 生物素羧基載體蛋白CT: carboxyl transferase 羧基轉(zhuǎn)移酶質(zhì)體 ACCase:同質(zhì)型：敏感ACCase: 2000 aa異質(zhì)型：不敏感ACCase 基因突變位點標(biāo)準(zhǔn)參照：鼠尾看麥娘 A. myosuroidesPowles and Yu, 2010 Ann Rev Plant biologyShiv Shan

4、khar KaundunPest Manag Sci 2010; 66: 12491256Lolium multiflorum精噁唑禾草靈APP炔草酯APP烯草酮CHD唑啉草酯PPZ日本看麥娘對3類ACCase抑制劑的交互抗性模式S2027位突變1781位突變Cui et al., Weed Technology 2015 29:444450草甘膦抗性cDNA分析；基因拷貝數(shù)是敏感的8倍，拷貝數(shù)和表達量呈現(xiàn)正相關(guān)；Palmer amaranth (Amaranthus palmeri)Gains et al. 2010 PNASEPSPS gene amplification and glyp

5、hosateresistance草甘膦抗性一個多抗性案例：牛筋草同時抗glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicidesJALALUDINA, YU Q & POWLES SB (2015). Multiple resistance across glufosinate,glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population.Weed Research 55, 8289.抗藥性雜草檢測方法

6、 生物測定方法整株測定（盆栽）種子測定法花粉管萌發(fā)法瓊脂法 靶標(biāo)抗性的快速分子檢測測序PCRPCR+酶切LAMP。種子采集、整理、保存雜草抗藥性水平檢測l 整株植物測定法（劑量反應(yīng)曲線Dose response experiments）通過整株雜草生物量對除草劑系列濃度的反應(yīng)，建立劑量與生物量的關(guān)系，以地上部生物量受藥劑的抑制程度來評價其對除草劑抗性。生長抑制中量 使雜草地上部鮮重比不用藥處理降低50%的藥劑劑量計算抗性指數(shù)敏感抗性-1抗性-2抗性-3Shiv Shankhar Kaundun PestManag Sci 2010; 66: 12491256生物測定20g a.i./ha苯磺隆

7、用藥后21天MP11-3#敏感MP11-6#抗MP11-7#抗2（河北）/16（河北、山東、河南、陜西）吡嘧磺隆20g a.i./ha為1倍劑量01/641/321/161/81/41/2124816倍生物測定生物測定雜草抗藥性檢測l 種子生物測定法通過種子在一定濃度梯度除草劑中的萌發(fā)率或胚根（胚芽）長度，建立劑量與雜草發(fā)芽（長度）的關(guān)系。種子測定法檢測不同日本看麥娘種群對高效氟吡甲禾靈的抗性水平 (A-F種群)楊彩宏，等. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007,40（12）：2759-2765.lRISQ （Resistance in Season Quick ）快速檢測法2011，在當(dāng)季對田間疑似抗性

8、植株進行早期診斷，根據(jù)診斷結(jié)果給出合理用藥方案與一定體積的水混合吸干表面水分加熱溶解植株分開，洗凈根部泥土溫度降至60度，加除草劑混勻后倒入培養(yǎng)皿等容器稱取瓊脂粉移栽到培養(yǎng)基lRISQ （Resistance in Season Quick ）快速檢測法培養(yǎng)容器發(fā)芽盒培養(yǎng)皿三角瓶組培專用容器精噁唑禾草靈的檢測濃度為0.4uM精噁唑禾草靈劑量為：0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0菵草用花粉檢測看麥娘對ACCase類除草劑的靶標(biāo)抗性隨著芳氧苯氧丙酸類除草劑的濃度的增加，三個種群的花粉萌發(fā)情況受到顯著影響。A為精惡唑禾草靈；B炔草酸；S為敏感種群；Rm為中度抗性或非抗性；Rh1和R

9、h1為分別對芳氧苯氧丙酸類和環(huán)己烯酮類具有高抗性的種群；Weed Research， 2000，40, 151162培養(yǎng)基中預(yù)先添加了120微摩爾/升的fenoxaprop，對芳氧苯氧丙酸類除草劑具有高抗種群的花粉仍能萌發(fā)。靶標(biāo)抗性的快速分子檢測測序方法：準(zhǔn)確，多位點很好的選擇基于酶切方法：CAPS(dCAPS)基于PCR的方法：PASA微測序方法：SNaPshotLAMP。l 靶標(biāo)酶基因突變位點測定-適用于靶標(biāo)酶基因突變引起的抗性Genbank：/查詢序列設(shè)計引物：（Primer、DNAMAN、DNAstar、Oligo）PCR擴增：（溫度

10、梯度PCR）模板：DNA、RNA序列分析：直接測序、克隆測序兩端序列獲得：RACE、 Genome Walking.拼接和完整序列擴增明確突變位點l 靶標(biāo)酶基因突變位點測定-適用于靶標(biāo)基因突變引起的抗性測序法122197205376 377 574653654播娘蒿、薺菜、雨久花、野慈姑、日本看麥娘、菵草等大部分雜草中已證實突變是其產(chǎn)生抗性主要原因編碼區(qū)全長 2000bp標(biāo)準(zhǔn)參照：擬南芥ALS基因抗藥性突變位點Cui et al.,Pesticide Biochemistry and Physiology ，2012， 102 ：229-232

11、.ABCDALS 197位ALS 574位EF不同基因型的峰圖A、E：敏感基因型C、D、F：抗性基因型B：雜合基因型R:S=1:1R:S=1:3R:S=1:5抗性和敏感性基因以一定比例混合后檢測結(jié)果dCAPS:(cleaved amplified polymorphicsequence，CAPS)或dCAPS (derived CAPS)PCR與限制性酶切相結(jié)合DE LYE C & BOUCANSAUD K (2008). A molecular assay for the proactivedetection of target site-based resistance to herbicides inhibiting acetolactatesynthase in Alopecurus yosuroides. Weed Research 48, 97101.dCAPS:PASA:等位基因特異性PCR技術(shù)（allele-specific amplification,PASA）(bidirectional PCR amplification of specific alleles,Bi-PASA)也稱為AS-PCR ,Allele Specific PCR關(guān)鍵：PCR引物設(shè)計，錯配