新基因功能研究的策略與方法

1、新基因功能研究的策略與方法目 錄 生物信息學(xué)預(yù)測 研究基因的時空表達(dá)模式 細(xì)胞及動物水平驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測 序列相似性分析 DNA序列的開放閱讀框查找 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析相似性(similarity)：是指一種很直接的數(shù)量關(guān)系同源性(homology)：指從一些數(shù)據(jù)中推斷出的兩個基因或蛋白質(zhì)序列具而共同祖先的結(jié)論，屬于質(zhì)的判斷序列間的相似性越高，是同源序列可能性就更高序列相似性分析核苷酸序列相似性分析BLASTn 用查詢序列逐一搜索核酸數(shù)據(jù)庫中的序列氨基酸序列相似性分析BLASTx 核酸序列翻譯成蛋白質(zhì)之后逐一搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列序列決定結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)決定功能http:/www.ncbi.nl

2、/BLASTScore：使用打分矩陣對匹配的片段進(jìn)行打分，這是對各對氨基酸殘基（或堿基）打分求和的結(jié)果，一般來說，匹配片段越長、 相似性越高則Score值越大。E value:隨機(jī)匹配的可能性Identities:匹配上的堿基數(shù)占查詢到的序列長度的百分比1112DNA序列的開放閱讀框查找預(yù)測其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列/orffinder/ 限制性核酸內(nèi)切酶切位點(diǎn) 外顯子、內(nèi)含子剪切位點(diǎn)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析/protparam 氨基酸組成、分子質(zhì)量、預(yù)測等電點(diǎn)、疏水性、親水性、極性、電荷分布等基

3、本理化特性疏水性分析ExPASy的ProtScale程序/cgi-bin/protscale.pl蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等為疏水性氨基酸，對蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)有重要影響可用來計算蛋白質(zhì)的疏水性圖譜 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析 www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 信號肽預(yù)測與識別 www.cbs.dtu.dk/services/signalP 蛋白質(zhì)卷曲螺旋預(yù)測 /software/COLIS_form.html 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測與識別 研究基因的時空表達(dá)模式基因表達(dá)的時空

4、性是指基因的表達(dá)在個體發(fā)育的不同階段以及在個體的不同組織和細(xì)胞類型中均不相同，是有機(jī)體發(fā)育、分化、衰老等生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)?；虮磉_(dá)的時空性特征為基因功能的研究提供了重要的信息：如果基因在某一特定的正常組織細(xì)胞中的表達(dá)水平較高，則往往表示其在維持正常生理狀態(tài)中發(fā)揮著重要的作用；而如果基因在相應(yīng)的病態(tài)組織細(xì)胞中表達(dá)異常，則提示其可能與該病理過程的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。研究基因的時空表達(dá)模式 mRNA水平的表達(dá)譜分析 蛋白水平的表達(dá)譜分析mRNA水平的表達(dá)譜分析 Northern Blotting 原位雜交 RT-PCR cDNA微陣列蛋白水平的表達(dá)譜分析 Western Bloting 免疫組化技術(shù)

5、雙向凝膠電泳 生物質(zhì)譜技術(shù)細(xì)胞及動物水平驗(yàn)證 基因過表達(dá)細(xì)胞模型 基因沉默細(xì)胞模型基因過表達(dá)細(xì)胞模型定義：通過載體將目的基因轉(zhuǎn)入某一特定細(xì)胞中，使其過表達(dá)，觀察該細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，從而了解該基因的功能。應(yīng)用：1）化學(xué)法 細(xì)胞感染 2）物理法 電穿孔法，效率高 3）生物法 應(yīng)用病毒基因載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，復(fù)制產(chǎn)生病毒蛋白導(dǎo)致機(jī)體免疫反應(yīng)，從而影響目的基因表達(dá)。擬南芥中鑒定到一個F-box蛋白AtPP2-B11，在延長鹽處理時間時，其轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均出現(xiàn)顯著誘導(dǎo)表達(dá)。過表達(dá)AtPP2-B11的轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出明顯的高鹽耐受性，而相應(yīng)的RNA干擾株比野生株對鹽脅迫更敏感。iTRAQ定量分析顯示

6、，在鹽脅迫下有4311個差異表達(dá)蛋白受到AtPP2-B11調(diào)控?；虺聊?xì)胞模型 原理：采用反義核酸分子抑制、封閉或破壞靶基因組 反義寡核苷酸、核酶及RNA干擾基因沉默在人細(xì)胞作用模式 第一種為RNA-RNA 模型其主要特征是RNA 引導(dǎo)鏈與RNAPII 合成的低拷貝轉(zhuǎn)錄子結(jié)合, 從而導(dǎo)致沉默。 第二種為RNA-DNA 模型其主要特征是在轉(zhuǎn)錄過程中, RNA 引導(dǎo)鏈與靶標(biāo)的一條DNA 形成二聚體, 從而導(dǎo)致沉默。反義技術(shù)原理：指通過堿基互補(bǔ)配對原理，利用人工或生物合成的特異互補(bǔ)性DNA或RNA片段（或其修飾產(chǎn)物），干擾基因的解旋、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、mRNA剪接加工與輸出、翻譯等各個環(huán)節(jié)，抑制或封閉靶

7、基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長分化等。分類：反義寡核苷酸技術(shù)（ASON） 核酶技術(shù) 小干擾RNAASON技術(shù)（反義寡核苷酸技術(shù)）是指人工合成能與DNA或RNA互補(bǔ)結(jié)合的特異性寡核苷酸鏈，使其專一性地抑制基因表達(dá)，以達(dá)到調(diào)控表達(dá)基因的目的。ASON一般設(shè)計在編碼區(qū)或3非編碼區(qū)，長度以1520nt較為合適。ASON包括反義DNA和反義RNA。RNAi技術(shù) 通過人為地引入與靶基因具有同源序列的dsRNA，誘導(dǎo)靶基因的mRNA降解，從而達(dá)到阻止基因表達(dá)、產(chǎn)生“功能失活”的目的。 優(yōu)勢（與ASON比較）：操作簡單、投入少、周期短；用于研究特定基因在特定組織細(xì)胞的特定發(fā)育階段中的功能。細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的長dsRNA或外源性長dsRNA在Dicer酶的作用下降解成小RNA；小RNA的雙鏈解開，其中一條鏈被優(yōu)先裝載入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）中； 裝載了小RNA