第九章DNA序列測定ppt課件

1、 即核酸即核酸DNA分子一級構(gòu)造的測定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)一項分子一級構(gòu)造的測定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)一項重要的技術(shù)。重要的技術(shù)。 1963年，年，Sanger和和Thompson等人第一次完成胰島素等人第一次完成胰島素51個個氨基酸的序列測定，這在當(dāng)時來說是一件了不起的大事。氨基酸的序列測定，這在當(dāng)時來說是一件了不起的大事。70年年代后期，代后期，Sanger和和Maxam-Gilbert等人又建立了核酸序列測等人又建立了核酸序列測定的方法，定的方法，Sanger雙脫氧末端終止法和雙脫氧末端終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)化學(xué)裂解法將核酸序列測定技術(shù)推進(jìn)到裂解法將核酸序列測定技術(shù)推進(jìn)到“直讀

2、階段，使核酸序列直讀階段，使核酸序列測定變得遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)氨基酸序列測定容易，這樣人們可以經(jīng)過測定變得遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)氨基酸序列測定容易，這樣人們可以經(jīng)過核酸序列和遺傳密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基酸的序列。核酸序列和遺傳密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基酸的序列。 在四種反響體系中，寡聚核苷酸分別終止于不同位置的A、T、G或C堿基，將待測DNA片段轉(zhuǎn)變成一系列放射性核素標(biāo)志的單鏈DNA片斷，并使其一端為一固定的末端，而另一端由于長度不同，成為一系列相差1個堿基的延續(xù)末端。經(jīng)電泳分別，放射自顯影，可直接讀出DNA的序列。 不論是上述哪一種方法，測序根本過程如下：不論是上述哪一種方法，測序根本過程如下： 1、制備待測、制備待測D

3、NA序列模板；序列模板； 2、酶促或化學(xué)反響將其轉(zhuǎn)變、酶促或化學(xué)反響將其轉(zhuǎn)變“等差數(shù)列等差數(shù)列n=1； 3、PAGE； 4、讀序。、讀序。P255,圖圖10-2 1、商品化測序試劑盒、商品化測序試劑盒 處理了質(zhì)粒問題，節(jié)省了時間，處理了質(zhì)粒問題，節(jié)省了時間，但缺乏靈敏性。但缺乏靈敏性。 2、自動化測序儀、自動化測序儀 以酶學(xué)測序反響或和放標(biāo)測序以酶學(xué)測序反響或和放標(biāo)測序產(chǎn)物為根底，微機處置。產(chǎn)物為根底，微機處置。 3、熱循環(huán)測序、熱循環(huán)測序 使極少數(shù)測序產(chǎn)物線性放大。使極少數(shù)測序產(chǎn)物線性放大。 4、測序商品化、測序商品化 60.-180.￥，搞定。￥，搞定。 在在DNA合成時，利用合成時，利用

4、ddNTP與與dNTP競爭摻入到競爭摻入到新生的新生的DNA鏈上使鏈終止的原理。即在鏈上使鏈終止的原理。即在A、C、G、T 4種反響體系中，分別參與不同的種反響體系中，分別參與不同的ddNTP，其他試劑一，其他試劑一樣，經(jīng)酶促合成反響，生成具有一樣的樣，經(jīng)酶促合成反響，生成具有一樣的5末端，而末端，而3不不同的同的DNA片段的混合物。經(jīng)電泳分別，放射自顯影，片段的混合物。經(jīng)電泳分別，放射自顯影，直接讀出直接讀出DNA的核苷酸序列。的核苷酸序列。的多克隆位點，但方向相反。同一待測的DNA片段分別克隆到這兩個載體中，用一通用引物進(jìn)展測序。對于數(shù)kb大片段DNA分子，那么有幾種戰(zhàn)略，如定向克隆，內(nèi)部

5、片段克隆，原位亞克隆，包含上述用2種限制酶消化DNA等。的模板構(gòu)本錢身二級構(gòu)造對測定的影響，將PCR與末端終止法測序結(jié)合進(jìn)展，只需少量模板。一制膠一制膠二模板變性雙鏈二模板變性雙鏈三測序反響三測序反響 1、模板引物退火、模板引物退火 2、鏈延伸、鏈標(biāo)志、鏈終止反響、鏈延伸、鏈標(biāo)志、鏈終止反響 3、上樣電泳、上樣電泳 4、讀片序、讀片序 分子克隆分子克隆P640 必需經(jīng)過實際才干獲得技巧必需經(jīng)過實際才干獲得技巧段的亞克隆擴增后進(jìn)展測序段的亞克隆擴增后進(jìn)展測序 1、將待測、將待測DNA與與M13mp載體相連，構(gòu)成重組體。載體相連，構(gòu)成重組體。 2、用兩種限制酶從待測、用兩種限制酶從待測DNA片段的

6、一端與載體序列之片段的一端與載體序列之間將間將DNA切斷，產(chǎn)生線性切斷，產(chǎn)生線性DNA，使近待測，使近待測DNA片段的一端片段的一端為為5突出末端，近載體一端為突出末端，近載體一端為3突出末端。突出末端。 3、外切核酸酶、外切核酸酶從從5突出末端消化待測突出末端消化待測DNA，37C時，每分鐘水解時，每分鐘水解250個核苷酸個核苷酸 4、核酸酶、核酸酶SI去除剩余單鏈，自我環(huán)化，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿去除剩余單鏈，自我環(huán)化，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主菌得到次級克隆。主菌得到次級克隆。 5、將各克隆用于測序。、將各克隆用于測序。三引物延伸法三引物延伸法 是一種定向測序法，從是一種定向測序法，從DNA的的3依賴特定引依

7、賴特定引物延伸測定一段物延伸測定一段DNA序列，再根據(jù)測得序列設(shè)計序列，再根據(jù)測得序列設(shè)計新的引物，作下一延伸反響的引物，如此向前推新的引物，作下一延伸反響的引物，如此向前推進(jìn)，最終測得進(jìn)，最終測得DNA的全長序列。的全長序列。 化學(xué)裂解直讀，化學(xué)裂解直讀，Sanger雙脫氧末端法也是直讀法雙脫氧末端法也是直讀法法是法是Maxam和和Gilbert等人等人1977年創(chuàng)建的，用來測定年創(chuàng)建的，用來測定DNA序序列?；瘜W(xué)法是用化學(xué)試劑在列?；瘜W(xué)法是用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定地裂解處特定地裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈等差數(shù)列片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈等差數(shù)列 n=1，經(jīng)過，經(jīng)過PA

8、GE和放射自顯影后，可以直接讀出和放射自顯影后，可以直接讀出DNA的順序。的順序。 某些試劑能修飾或破壞某些試劑能修飾或破壞DNA鏈上特定核苷酸的堿基進(jìn)而鏈上特定核苷酸的堿基進(jìn)而使使N-糖苷鍵斷裂，暴顯露的糖環(huán)以糖苷鍵斷裂，暴顯露的糖環(huán)以-消除反響，在消除反響，在3和和5位上斷裂磷酸二酯鍵。使戊糖零落，用于嘌呤環(huán)的試劑是硫位上斷裂磷酸二酯鍵。使戊糖零落，用于嘌呤環(huán)的試劑是硫酸二甲酯，而聯(lián)氨可用于肼解嘧啶環(huán)。酸二甲酯，而聯(lián)氨可用于肼解嘧啶環(huán)。4種核苷酸的特異裂種核苷酸的特異裂解和鑒別方法如下：解和鑒別方法如下： 化學(xué)法沒有末端終止法運用廣泛，但有一個明化學(xué)法沒有末端終止法運用廣泛，但有一個明顯的

9、優(yōu)點，即所測序列來自原顯的優(yōu)點，即所測序列來自原DNA分子而不是酶促分子而不是酶促合成反響所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化學(xué)法可以對合合成反響所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化學(xué)法可以對合成的寡核苷酸進(jìn)展測序，可以分析諸如甲基化等成的寡核苷酸進(jìn)展測序，可以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，不能經(jīng)過化學(xué)維護及修飾干擾實修飾的情況，不能經(jīng)過化學(xué)維護及修飾干擾實驗來研討驗來研討DNA二級構(gòu)造及蛋白質(zhì)與二級構(gòu)造及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。的相互作用。 化學(xué)法測序放射自顯影圖譜的識讀，較末端法更復(fù)雜一些，這是由化學(xué)法測序放射自顯影圖譜的識讀，較末端法更復(fù)雜一些，這是由于化學(xué)裂解反響并不完全是堿基特異性的，每組測序圖譜為于

10、化學(xué)裂解反響并不完全是堿基特異性的，每組測序圖譜為4或或5條垂直條垂直的階梯帶，的階梯帶，AC反響可以不做。該片從膠底部一個個向頂部讀，反響可以不做。該片從膠底部一個個向頂部讀，G+A和和C+T兩列中含有一切相差一個堿基的兩列中含有一切相差一個堿基的DNA片段。假設(shè)片段。假設(shè)G+A中出現(xiàn)中出現(xiàn)1條帶就條帶就看看G列中能否有同樣大小的帶，假設(shè)有即為列中能否有同樣大小的帶，假設(shè)有即為G堿基，無那么為堿基，無那么為A堿基；同堿基；同理，理，C+T中那么檢查中那么檢查C列中有無同樣大小條帶，有即為列中有無同樣大小條帶，有即為C，無那么為，無那么為T。在做了在做了AC反響時，出現(xiàn)較深的帶時，可以協(xié)助確定為反響時，出現(xiàn)較深的帶時，可以協(xié)助確定為A堿基?；瘜W(xué)法必堿基?；瘜W(xué)法必需需4或或5個反響管一致閱讀，個反響管一致閱讀，DNA中中4個堿基每個位置都有個堿基每個位置都有1個相應(yīng)的片段，個相應(yīng)的片段，待測的待測的DNA全部序列可直接讀出。專業(yè)技術(shù)人員全部序列可直接讀出。專業(yè)技術(shù)人員 化學(xué)法測序采用化學(xué)法測序采用32P標(biāo)志