引物設(shè)計(jì)原則最全匯總

1、引物設(shè)計(jì)原則（匯總）普通引物設(shè)計(jì)（適用于從載體上擴(kuò)增模板）：1 .普通引物長度一般在20-30bp之間，常用24-28bp左右以保證基因特異性；2 .下載基因序列到VectorNTI;3.找到所需安裝載體序列；4.將基因序列的CDS高亮標(biāo)記；5 .尋找載體序列中常用酶切位點(diǎn)，一般為EcoRI、BamHI、HindIII、XhoI等等，比對檢測基因序列中是否有這些位點(diǎn)，有的話舍棄，最后選擇兩個(gè)酶切位點(diǎn)，最好離得遠(yuǎn)一點(diǎn)，并且最好buffer用一樣的。酶切位點(diǎn)一般是6bp的回文序列；6 .從基因ATG開始往后選擇10-20bp均可（我的習(xí)慣是27bp-6bp酶切位點(diǎn)-2bp保護(hù)堿基-xbp補(bǔ)齊序列）

2、，但最好保證最后兩個(gè)是G或者C,以減少錯(cuò)配率；7 .將上游酶切位點(diǎn)序列補(bǔ)在ATG前方，并根據(jù)載體對框情況補(bǔ)足兩者之間的空缺，再根據(jù)序列的GC含量和TM值在酶切位點(diǎn)前補(bǔ)足保護(hù)堿基，以保證GC和AT的含量不能過高。注意，所有的補(bǔ)齊不能用到終止密碼子；8 .檢測上游序列的結(jié)構(gòu)情況，理論上不要太多二級結(jié)構(gòu)以及3'端匹配即可；不過重復(fù)的序列也不能太多，以免移碼；9 .從下游終止密碼子開始向前選擇10-20bp均可，但最好保證最后兩個(gè)是G或者C,以減少錯(cuò)配率；10 .選擇complementarysequence,在N端補(bǔ)齊下游酶切位點(diǎn)，如果tag在C端（即下游），則在第9點(diǎn)中應(yīng)該從終止密碼子前開

3、始選擇（即舍棄終止密碼子），并且下游引物也要對框，如果tag在N端，則下游引物不需要對框，只要在N端加上下游酶切位點(diǎn)，再根據(jù)情況加上2個(gè)保護(hù)堿基，然后檢測二級結(jié)構(gòu)，原則上3'端部匹配即可。不過重復(fù)的序列也不能太多，以免移碼；11 .將設(shè)計(jì)好的上下游引物放在一起檢測二級結(jié)構(gòu)，原則上3'端部匹配即可。不過重復(fù)的序列也不能太多，以免移碼；12 .最后在NCBI的primerBlast網(wǎng)站上比對引物序列，看是否基因特異性的。2011年10月18日左潔1 .引物的長度一般為15-30bp,常用的是18-27bp,但不應(yīng)大于38,因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74C,不適于TaqDNAK合酶

4、進(jìn)行反應(yīng)。2 .引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3'端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3'端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG£CCC也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。3 .引物3'端的末位堿基對Taq酶的DN給成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3'端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR5應(yīng)失敗。5'端序列對PCF®響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。4 .引物序列的GC含量一般為40-60%,過高或過低都不利于

5、引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的G*量不能相差太大。5 .引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72c左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）,在Oligo軟件中使用的是最鄰近法（thenearestneighbormethod）。6 .AG值是指DN/W鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3'端AG值較低（絕又t值不超過9）,而5'端和中間AG值相對較高的引物。引物的3'端的AG值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DN咪合反應(yīng)。7 .引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)

6、生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PC阪應(yīng)不能正常進(jìn)行。8 .對引物的修飾一般是在5'端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。引物序列應(yīng)該都是寫成5-3方向的，Tm之間的差異最好控制在1度之內(nèi)，另外我覺得擴(kuò)增長度大一些比較好，500bp左右。要設(shè)計(jì)引物首先要找到DNAff列的保守區(qū)。同時(shí)應(yīng)預(yù)測將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥壗Y(jié)構(gòu)。如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構(gòu)，就要避開它。如這一段不能形成二級結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物。引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。引物長度一般在1530堿基之間。G+*量在40%60無間。堿基

7、要隨機(jī)分布。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物5'端可以修飾。引物3'端不可修飾。引物3'端要避開密碼子的第3位。1.引物的特異性引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%£有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。2 .避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū)某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNAC級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測估計(jì)mRNA勺穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（G°）小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2'-

8、脫氧GTPtdGTP寸擴(kuò)增的成功是有幫助的。3 .長度寡核甘酸引物長度為1530bp,一月殳為2027mes引物的有效長度：Ln=2（G+C+（A+T）,Ln值不能大于38,因?yàn)?8時(shí)，最適延伸溫度會(huì)超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74C）,不能保證產(chǎn)物的特異性。4 .G+C含量G+C含量一般為40%60%其Tm值是寡核甘酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%S核甘酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值510Co若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580C,其Tm值最好接近72c以使復(fù)性條件最佳。5 .堿基礎(chǔ)隨機(jī)分布引物中四種堿基的分布最好

9、是隨機(jī)的，不要有聚喋吟或聚喀噬的存在。尤其3'端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C,因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。6 .引物自身引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。7.引物之間兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3'端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。8.引物的3'端引物的延伸是從3'端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3'端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCRAS-PCR

10、反應(yīng)中，引物3'端不能發(fā)生錯(cuò)配。在標(biāo)準(zhǔn)PCR5應(yīng)體系中，用2UTaqDN咪合酶和800mol/LdNTP（四種dNTP各200仙mol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95C,25s；55C,25s；72C,1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1gag基因區(qū)的條件下，引物3'端錯(cuò)配對擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。A：A錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20,A：G和C：C錯(cuò)七下降至1/100。引物A:模板G與引物G模板A錯(cuò)配對PCF®響是等同的。9.引物的5'端引物的5'端限定著PCFT物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5

11、9;端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3將；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNAff列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。10.密碼子的簡并如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。Hairpin發(fā)卡結(jié)構(gòu)如果自由能值大于0則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會(huì)干擾反應(yīng)如果自由能值小于0則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向。引物之間形成如果配對區(qū)域在3末端問題會(huì)更為嚴(yán)重3末端配對很容易引起引物二聚體擴(kuò)增使PairRating匹配度評分匹配度低的引物對常常不太有效是因?yàn)樵谕瑯油嘶饻囟认耇M氐的引物決

12、定擴(kuò)增的特異性而Tm高的引物更易于形成非特異性結(jié)合而造成錯(cuò)誤的起始11引物的長度以15-30bp為宜，否則會(huì)影響擴(kuò)增的特異性。2堿基盡可能隨機(jī)分布，避免相同的堿基成串排列，引物的G+輸量在40%60%之間，若G+若量太低,可在5"端加上一些G或C,若G+C含量太高，可在5"端加上一些A或T。【3】應(yīng)避免每條引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)及兩條引物的3"端互補(bǔ)形成引物二聚體，避免在引物的3"端有3個(gè)G或3個(gè)C成串排列，3"端的末位堿基最好選T、C、G,而不選A,也有建議在引物的兩端用12個(gè)喋吟堿基。4盡可能使用兩條引物的Tm值相同（最好相差不要超過5C）,

13、退火溫度根據(jù)較低的Tm值選定，也可以通過改變引物的長度來平衡兩條引物的退火溫度。Tm值可以根據(jù)Tm=4（G+C）+2（A+T計(jì)算。而對于較長的引物，Tm值需要考慮動(dòng)力學(xué)參數(shù)、從“最近鄰位”的計(jì)算方式得到，現(xiàn)有的PCFSI物設(shè)計(jì)軟件大多數(shù)都采用這種方式。（注：對于Tm值的計(jì)算有爭議的地方是附加序列應(yīng)不應(yīng)該計(jì)算在內(nèi)，我覺得有值得商討的地方。因?yàn)閺睦碚撋现挥凶铋_始的循環(huán)引物的附加序列是不與模板鏈結(jié)合的，而在后來的PCFK應(yīng)中，引物的附加序列是和模板鏈結(jié)合了的。）【5】引物的3'端要與模板嚴(yán)格配對，而5'端堿基沒有嚴(yán)格的限制，只要與模板DN閣合的部分足夠長，其5'端堿基可不與模

14、板DNA!己對而呈游離狀態(tài)，這樣，我們可以在引物的5末端加上酶切位點(diǎn)（引入酶切位點(diǎn)時(shí)，要考慮到進(jìn)行雙酶切的共用緩沖液，否則給下游工作帶來困難）、啟動(dòng)子，方便下游操作?！?】不要在擴(kuò)增序列的二級結(jié)構(gòu)區(qū)設(shè)計(jì)引物，以免退火困難。也要考慮引物設(shè)計(jì)處模板的特異性。引物設(shè)計(jì)原則1 .引物的長度一般為15-30bp,常用的是18-27bp,但不應(yīng)大于38,因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74C,不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。2 .引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3'端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3'端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC,也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。3

15、.引物3'端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3'端使用堿基Ao另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5'端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。4 .引物序列的GC含量一般為40-60%,過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。5 .引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72c左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(

16、thenearestneighbormethod)6 .是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3'端AG值較低(絕對值不超過9),而5'端和中間AG值相對較高的引物。引物的3'端的AG值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。7 .引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高(超過4.5kcal/mol)易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。8 .對引物的修飾一般是在5'端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。引物序列應(yīng)該都是寫成5-3方向的，Tm之間

17、的差異最好控制在1度之內(nèi)，另外我覺得擴(kuò)增長度大一些比較好，500bp左右。要設(shè)計(jì)引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時(shí)應(yīng)預(yù)測將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥壗Y(jié)構(gòu)。如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構(gòu)，就要避開它。如這一段不能形成二級結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物。引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。引物長度一般在1530堿基之間。G+C含量在40%60%之間。堿基要隨機(jī)分布。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物5端可以修飾。引物3端不可修飾。引物3端要避開密碼子的第3位。1 .引物的特異性引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)

18、8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。2 .避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū)某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能(G°)小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza2-脫氧GTP取彳tdGTP對擴(kuò)增的成功是有幫助的。3 .長度寡核甘酸引物長度為1530bp,一般為2027mer。引物的有效長度：Ln=2(G+C)+(A+T),Ln值不能大于38,因?yàn)?8時(shí)，最適延伸溫度會(huì)超過TaqDNA聚合酶的最適溫度(74C),不能保證產(chǎn)物的

19、特異性。4 .G+C含量G+C含量一般為40%60%。其Tm值是寡核甘酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核甘酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值510C。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為55-80C,其Tm值最好接近72c以使復(fù)性條件最佳。5 .堿基礎(chǔ)隨機(jī)分布引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚喋吟或聚喀噬的存在。尤其3'端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C,因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。6 .引物自身引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的

20、復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。7 .引物之間兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。8 .引物的3端引物的延伸是從3端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應(yīng)中，引物3'端不能發(fā)生錯(cuò)配。在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，用2UTaqDNA聚合酶和800仙mol/LdNTP（四種dNTP各200仙mol/D以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95C,25s；55C,25s；72C,1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1gag基因區(qū)的條件下，引物3端錯(cuò)

21、配對擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。A：A錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20,A：G和C：C錯(cuò)七下降至1/1000引物A:模板G與引物G:模板A錯(cuò)配對PCR影響是等同的。9.引物的5端引物的5'端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。10.密碼子的簡并如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。Hairpin發(fā)卡結(jié)構(gòu)如果自由能值

22、大于0則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會(huì)干擾反應(yīng)如果自由能值小于0則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向。引物之間形成如果配對區(qū)域在3末端問題會(huì)更為嚴(yán)重3末端配對很容易引起引物二聚體擴(kuò)增使PairRating匹配度評分匹配度低的引物對常常不太有效是因?yàn)樵谕瑯油嘶饻囟认耇m低的引物決定擴(kuò)增的特異性而Tm高的引物更易于形成非特異性結(jié)合而造成錯(cuò)誤的起始11引物的長度以15-30bp為宜，否則會(huì)影響擴(kuò)增的特異性。2堿基盡可能隨機(jī)分布，避免相同的堿基成串排列，引物的G+C含量在40%60%之間，若G+C含量太低，可在5'端加上一些G或C,若G+C含量太高，可在5'端加上一些A或T

23、。【3】應(yīng)避免每條引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)及兩條引物的3'端互補(bǔ)形成引物二聚體，避免在引物的3'端有3個(gè)G或3個(gè)C成串排列，3'端的末位堿基最好選T、C、G,而不選A,也有建議在引物的兩端用12個(gè)喋吟堿基。4盡可能使用兩條引物的Tm值相同（最好相差不要超過5C）,退火溫度根據(jù)較低的Tm值選定，也可以通過改變引物的長度來平衡兩條引物的退火溫度。Tm值可以根據(jù)Tm=4（G+C）+2（A+T）計(jì)算。而對于較長的引物，Tm值需要考慮動(dòng)力學(xué)參數(shù)、從最近鄰位”的計(jì)算方式得到，現(xiàn)有的PCR引物設(shè)計(jì)軟件大多數(shù)都采用這種方式。（注：對于Tm值的計(jì)算有爭議的地方是附加序列應(yīng)不應(yīng)該計(jì)算在內(nèi)，我覺

24、得有值得商討的地方。因?yàn)閺睦碚撋现挥凶铋_始的循環(huán)引物的附加序列是不與模板鏈結(jié)合的，而在后來的PCR反應(yīng)中，引物的附加序列是和模板鏈結(jié)合了的。）【5】引物的3'端要與模板嚴(yán)格配對，而5'端堿基沒有嚴(yán)格的限制，只要與模板DNA結(jié)合的部分足夠長，其5'端堿基可不與模板DNA配對而呈游離狀態(tài)，這樣，我們可以在引物的5末端加上酶切位點(diǎn)（引入酶切位點(diǎn)時(shí)，要考慮到進(jìn)行雙酶切的共用緩沖液，否則給下游工作帶來困難）、啟動(dòng)子，方便下游操作?！?】不要在擴(kuò)增序列的二級結(jié)構(gòu)區(qū)設(shè)計(jì)引物，以免退火困難。也要考慮引物設(shè)計(jì)處模板的特異性。PCR引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對合適的核甘酸片段，使其能有效地

25、擴(kuò)增模板DNA序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。要設(shè)計(jì)引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時(shí)應(yīng)預(yù)測將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥壗Y(jié)構(gòu)。如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構(gòu)，就要避開它。如這一段不能形成二級結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物?，F(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計(jì)一對引物。一般引物長度為1530堿基，擴(kuò)增片段長度為100600堿基對。讓我們先看看P1引物。一般引物序列中GC含量一般為40%60%。而且四種堿基的分布最好隨機(jī)。不要有聚喋吟或聚喀呢存在。否則P1引物設(shè)計(jì)的就不合理。應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計(jì)引物。同時(shí)引物之間也不能有互補(bǔ)性，一般一對引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的互補(bǔ)。引物確

26、定以后，可以對引物進(jìn)行必要的修飾，例如可以在引物的5端加酶切位點(diǎn)序列；標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等，這對擴(kuò)增的特異性影響不大。但3'端絕對不能進(jìn)行任何修飾，因?yàn)橐锏难由焓菑?端開始的。這里還需提醒的是3'端不要終止于密碼子的第3位，因?yàn)槊艽a子第3位易發(fā)生簡并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設(shè)計(jì)原則:引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。引物長度一般在1530堿基之間。GC含量在40%60%問。堿基要隨機(jī)分布。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物5'端可以修飾。引物3'

27、端不可修飾。引物3'端要避開密碼子的第3位。PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對合適的核甘酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。如前述，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計(jì)。1 .引物的特異性引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。2 .避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū)某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（G0）小于58.6lkJ

28、/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza2'-脫氧GTP取彳tdGTP對擴(kuò)增的成功是有幫助的。3 .長度寡核甘酸引物長度為1530bp,一般為2027mer。引物的有效長度：Ln=2（GC）（AT,Ln值不能大于38,因?yàn)?8時(shí)，最適延伸溫度會(huì)超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74C）,不能保證產(chǎn)物的特異性。4 .GC含量GC含量一般為40%60%。其Tm值是寡核甘酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核甘酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值510c若按公式Tm=4(GC)2(AT)估計(jì)引物的Tm值,則有效引物的Tm為5580C,其Tm值最好

29、接近72C以使復(fù)性條件最佳。5 .堿基礎(chǔ)隨機(jī)分布引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚喋吟或聚喀呢的存在。尤其3'端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C,因這樣會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。6 .引物自身引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。7 .引物之間兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3'端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。8 .引物的3端引物的延伸是從3'端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3端也不

30、能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR(AS-PCR)反應(yīng)中，引物3'端不能發(fā)生錯(cuò)配。在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，用2UTaqDNA聚合酶和800mol/LdNTP(四種dNTP各200仙mol/D以質(zhì)粒(103拷貝)為模板，按95C,25s；55C,25s；72C,1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1gag基因區(qū)的條件下，引物3端錯(cuò)配對擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。A:A錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20,A：G和C：C錯(cuò)七下降至1/1000引物A:模板G與引物G:模板A錯(cuò)配對PCR影響是等同的。9 .引物的5端引物的5'端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而

31、不影響擴(kuò)增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。10 .密碼子的簡并如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。特殊目的的引物設(shè)計(jì)將在有關(guān)章節(jié)討論。隨著人們對引物的認(rèn)識(shí)，一些引物的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)程序也應(yīng)運(yùn)而生，下面將討論有關(guān)引物計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)方法引物設(shè)計(jì)重點(diǎn)考慮因素、設(shè)計(jì)技巧及引物設(shè)計(jì)軟件推薦urbest發(fā)表于2007-07-1416:35我最近合成了幾十對引物，在實(shí)戰(zhàn)中多多少少有些心得，拿出來給大家分享。我感覺想把引

32、物合成的比較好，除了前引物和后引物的Tm不能相差太大，我們還要重點(diǎn)考慮以下因素：一、GC%GC含量對于PCR反應(yīng)來說GC含量在40%60%,一般50%左右比較合適；而對于測序引物和雜交探針來說GC含量至少應(yīng)為50%。產(chǎn)物中GC含量最好大于引物中的GC含量。二、Degeneracy多義性當(dāng)設(shè)計(jì)多義引物時(shí)應(yīng)盡量減少引物多義性，這樣會(huì)帶來更好的特異性，應(yīng)盡量避免3末端的多義性，因?yàn)檫@里即使一個(gè)堿基的錯(cuò)配都能阻止引物延伸。三、3'EndStability3末端穩(wěn)定性引物穩(wěn)定性影響它的錯(cuò)配效率，一條理想的引物應(yīng)該有一個(gè)穩(wěn)定性較強(qiáng)的5末端和相對穩(wěn)定性較弱的3末端。如果引物3穩(wěn)定性強(qiáng)，有可能在即使5

33、末端不配對的情況下造成錯(cuò)配，形成非特異性擴(kuò)增條帶(secondarybands)。而3末端穩(wěn)定性低的引物較好的原因是在引物發(fā)生錯(cuò)配時(shí)，由于3末端不太穩(wěn)定引物結(jié)合不穩(wěn)定而難以延伸。四、GCClampGC鉗引物與目的位點(diǎn)的有效結(jié)合需要有穩(wěn)定的5末端。這一段有較強(qiáng)穩(wěn)定性的5末端稱為GC鉗。它保證引物與模板的穩(wěn)定結(jié)合。選擇有合適穩(wěn)定性的引物能在確保不產(chǎn)生非特異性條帶的前提下盡量降低退火溫度。五、SecondaryStructures二級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)是引物設(shè)計(jì)中必須考慮的一個(gè)重要因素。二級結(jié)構(gòu)能顯著影響反應(yīng)中能與模板正確結(jié)合的引物數(shù)量，發(fā)卡結(jié)構(gòu)的存在能限制引物與目的位點(diǎn)的結(jié)合能力，從而降低擴(kuò)增效率，形成

34、發(fā)卡環(huán)的引物則不能在PCR擴(kuò)增中發(fā)揮作用。六、Hairpin發(fā)卡結(jié)構(gòu)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是由于引物自身的互補(bǔ)堿基分子內(nèi)配對造成引物折疊形成的二級結(jié)構(gòu)，并由于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是分子內(nèi)的反應(yīng)，僅僅需要三個(gè)連續(xù)堿基配對就可以形成。發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可以用自由能衡量。自由能大小取決于堿基配對釋放的能量以及折疊DNA形成發(fā)卡環(huán)所需要的能量，如果自由能值大于0則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會(huì)干擾反應(yīng)，如果自由能值小于0則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)。七、Dimer二聚體引物之間的配對區(qū)域能形成引物二聚體，它是相同或不同的兩條引物之間形成的二級結(jié)構(gòu)。它造成引物二聚體擴(kuò)增并減少目的擴(kuò)增產(chǎn)物，二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向引物之間形

35、成，如果配對區(qū)域在3末端問題會(huì)更為嚴(yán)重，3末端配對很容易引起引物二聚體擴(kuò)增。八、FalsePriming錯(cuò)配如果引物可以結(jié)合除目的位點(diǎn)外的其他區(qū)域，擴(kuò)增效率將明顯降低目的產(chǎn)物帶將減少或出現(xiàn)涂布(smear)。3末端連續(xù)幾個(gè)堿基配對形成錯(cuò)配的傾向要高于引物上游區(qū)域同樣數(shù)量的堿基配對，在使用引物設(shè)計(jì)軟件時(shí)，您可以分別設(shè)定確認(rèn)為錯(cuò)配的3末端或引物全長形成連續(xù)堿基配對的數(shù)量。順便說一下，如果是新手，剛開始接觸引物設(shè)計(jì)，推薦使用PrimerPremier5.0,因?yàn)樗缑婧唵危讓W(xué)易用；如果你想把引物設(shè)計(jì)得盡善盡美，公認(rèn)的首選軟件是Oligo,其次我認(rèn)為是DNAstar。Oligo功能強(qiáng)大，所以使用起來

36、就沒有PrimerPremier5.0那么簡便。先用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)，然后把設(shè)計(jì)好的引物拿到Oligo里去檢測這對引物的優(yōu)劣，我想這對大多數(shù)引物設(shè)計(jì)者是一個(gè)不錯(cuò)的選擇！本實(shí)驗(yàn)心得來自丁香園論壇，查看原帖分享到網(wǎng)友評論補(bǔ)充一：具體說一下引物中GC含量問題引物的GC含量一般為40-60%,以45-55%為宜，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不能在上述范圍內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。如果G-C比例超出，則在引物的5'端增加As或Ts；而

37、如果A-T比例過高，則同樣在5'端增加Gs或Cs。但也有認(rèn)為：原來普遍認(rèn)為PCR引物應(yīng)當(dāng)有50%的GC/AT比率的觀點(diǎn)其實(shí)是不對的，以人基因組DNA為模板，用81%AT的引物可以產(chǎn)生單一的、專一的、長250bp,含有70%AT的產(chǎn)物。完全沒有必要復(fù)雜地去計(jì)算產(chǎn)物和引物的解鏈溫度，PCR引物的GC/AT比率應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓腉C/AT比。發(fā)表于2014-12-18您無權(quán)限看這個(gè)帖子，您的積分需要大于5如何獲得積分?發(fā)表于2014-12-18補(bǔ)充二：b關(guān)于自由能問題（如何根據(jù)自由能判斷引物質(zhì)量）/b1、AG值（自由能）反映了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度。一般情況下，引物的AG值最好

38、呈正弦曲線形狀，即5'端和中間AG值較高，而3'端AG值相對較低，且不要超過9（AG值為負(fù)值，這里取絕對值），如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯(cuò)誤引發(fā)。3'末端雙鏈的AG是02kcal/mol時(shí)，PCR產(chǎn)量幾乎達(dá)到百分之百，隨著其絕對值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在-6時(shí)只有40%、到8時(shí)少于20%、而10時(shí)接近于0。2、引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過4.5,否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶而且會(huì)降低引物濃度從而導(dǎo)致PCR正常反應(yīng)不能進(jìn)行，與二聚體相關(guān)的一個(gè)參數(shù)是堿基的分布，3'端的連續(xù)GGG或CCC會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。二聚體形成的能值越高越穩(wěn)定，越不符合要求。與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。雖然有些帶有發(fā)夾環(huán)，其