菌種保藏的主要方法

1、菌種保藏（一）、菌種保藏的目的微生物在使用和傳代過程中容易發(fā)生污染、 變異甚至死亡， 因而常常造成菌種的衰退，并有可能使優(yōu)良菌種丟失。 菌種保藏的重要意義就在于盡可能保持其原有性狀和活力的穩(wěn)定，確保菌種不死亡、不變異、不被污染，以達到便于研究、交換和使用等諸方面的需要。（二）、菌種保藏的原理無論采用何種保藏方法， 首先應該挑選典型菌種的優(yōu)良純種來進行保藏， 最好保藏它們的休眠體，如分生孢子、芽孢等。其次，應根據(jù)微生物生理、生化特點，人為地創(chuàng)造環(huán)境條件， 使微生物長期處于代謝不活潑、 生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。這些人工造成的環(huán)境主要是干燥、低溫和缺氧，另外，避光、缺乏營養(yǎng)、添加保護劑或酸度中和劑

2、也能有效提高保藏效果。（三）、菌種保藏的方法1、斜面低溫保藏法將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，置于 4左右的冰箱中保藏，每隔一定時間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)不斷。 此法廣泛適用于細菌、 放線菌、酵母菌和霉菌等大多數(shù)微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍干燥保藏的菌種。 放線菌、霉菌和有芽孢的細菌一般可保存 6 個月左右，無芽孢的細菌可保存 1 個月左右，酵母菌可保存 3 個月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蠟封口，置于 4冰箱中保藏，不僅能防止水分揮發(fā)、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。這一改進可使菌種的保藏期延長。該法的優(yōu)點是簡便易行， 容易推

3、廣，存活率高，故科研和生產(chǎn)上對經(jīng)常使用的菌種大多采用這種保藏方法。 其缺點是菌株仍有一定程度的代謝活動能力， 保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易發(fā)生變異和被污染。2、石蠟油封藏法此法是在無菌條件下， 將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端lcm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4冰箱內(nèi)保藏。使用的液體石蠟要求優(yōu)質(zhì)無毒，化學純規(guī)格，其滅菌條件是：150 170烘箱內(nèi)滅菌 lh ；或 121高壓蒸汽滅菌6080min，再置于 80的烘箱內(nèi)烘干除去水分。由于液體石蠟阻隔了空氣， 使菌體處于缺氧狀態(tài)下， 而且又防止

4、了水分揮發(fā)， 使培養(yǎng)物不會干裂，因而能使保藏期達 1 2 年，或更長。這種方法操作簡單，它適于保藏霉菌、酵母菌、放線菌、好氧性細菌等，對霉菌和酵母菌的保藏效果較好，可保存幾年，甚至長達 10 年。但對很多厭氧性細菌的保藏效果較差，尤其不適用于某些能分解烴類的菌種。3、砂土管保藏法這是一種常用的長期保藏菌種的方法， 適用于產(chǎn)孢子的放線菌、 霉菌及形成芽孢的細菌，對于一些對干燥敏感的細菌如奈氏球菌、 弧菌和假單胞桿菌及酵母則不適用。其制作方法是，先將砂與土分別洗凈、烘干、過篩 ( 一般砂用 60 目篩，土用 120 目篩 ) ，按砂與土的比例為 (1 2) ：1 混勻，分裝于小試管中， 砂土的高度

5、約 1cm，以 121蒸汽滅菌 1 1.5h ，間歇滅菌 3 次。 50烘干后經(jīng)檢查無誤后備用。也有只用砂或土作載體進行保藏的。 需要保藏的菌株先用斜面培養(yǎng)基充分培養(yǎng)， 再以無菌水制成 108 1010 個/ml 菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中， 放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約 2 4h，用火焰熔封管口 ( 或用石蠟封口 ) ，置于干燥器中， 在室溫或 4冰箱內(nèi)保藏， 后者效果更好。砂土管法兼具低溫、 干燥、隔氧和無營養(yǎng)物等諸條件， 故保藏期較長、 效果較好，且微生物移接方便，經(jīng)濟簡便。它比石蠟油封藏法的保藏期長，約 110 年。中國科學院微生物研究所用砂土管保

6、藏法保藏放線菌。4、麩皮保藏法麩皮保藏法亦稱曲法保藏。 即以麩皮作載體， 吸附接入的孢子， 然后在低溫干燥條件下保存。其制作方法是按照不同菌種對水分要求的不同將麩皮與水以一定的比例 1：(0.8 1.5) 拌勻，裝量為試管體積 2/5 ，濕熱滅菌后經(jīng)冷卻，接入新鮮培養(yǎng)的菌種，適溫培養(yǎng)至孢子長成。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，于室溫下干燥數(shù)日后移入低溫下保藏；干燥后也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。此法適用于產(chǎn)孢子的霉菌和某些放線菌， 保藏期在 1 年以上。因操作簡單， 經(jīng)濟實惠，工廠較多采用。 中國科學院微生物研究所采用麩皮保藏法保藏曲霉， 如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等，其保

7、藏期可達數(shù)年至數(shù)十年。5、冷凍真空干燥保藏法冷凍真空干燥保藏法又稱冷凍干燥保藏法，簡稱凍干法。它通常是用保護劑制備擬保藏菌種的細胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空， 使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。 并在真空條件下立即融封，造成無氧真空環(huán)境， 最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長期保藏。 常用的保護劑有脫脂牛奶、 血清、淀粉、葡聚糖等高分子物質(zhì)。由于此法同時具備低溫、 干燥、缺氧的菌種保藏條件， 因此保藏期長，一般達 515 年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。除不產(chǎn)孢子的絲狀真菌不宜用此法外，其他大多數(shù)微

8、生物如病毒、細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等均可采用這種保藏方法。 但該法操作比較煩瑣， 技術(shù)要求較高，且需要凍干機等設備。保藏菌種需用時，可在無菌環(huán)境下開啟安瓿管，將無菌的培養(yǎng)基注入安瓿管中，固體菌塊溶解后， 搖勻復水，然后將其接種于適宜該菌種生長的斜面上適溫培養(yǎng)即可。6、液氮超低溫保藏法液氮超低溫保藏法簡稱液氮保藏法或液氮法。 它是以甘油、二甲基亞砜等作為保護劑，在液氮超低溫（ -196 ）下保藏的方法。其主要原理是菌種細胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前， 使細胞內(nèi)的自由水通過細胞膜外滲出來， 以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細胞損傷。美國 ATCC菌種保藏中心采用該法時，把菌懸液或帶菌

9、絲的瓊脂塊經(jīng)控制致冷速度， 以每分鐘下降 1/min 的速度從 0 直降到 -35 ，然后保藏在 -150 -196 液氮冷箱中。如果降溫速度過快，由于細胞內(nèi)自由水來不及滲出胞外， 形成冰晶就會損傷細胞。 據(jù)研究認為降溫的速度控制在 (1 10) /min ，細胞死亡率低；隨著速度加快，死亡率則相應提高。液氮低溫保藏的保護劑，一般是選擇甘油、二甲基亞砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊環(huán)、吐溫 80 等，但最常用的是甘油（ 10%20%）。不同微生物要選擇不同的保護劑，再通過試驗加以確定保護劑的濃度， 原則上是控制在不足以造成微生物致死的濃度。此法操作簡便、高效、保藏期一般可達到 15 年以上，是目前被公認的最有效的菌種長期保藏技術(shù)之一。 除了少數(shù)對低溫損傷敏感的微生物外， 該法適用于各種微生物菌種的保藏， 甚至連藻類、 原生動物、支原體等都能用此法獲得有效的保藏。此法的另一大優(yōu)點是可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進行保藏， 無論是孢子或菌體、液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物均可采用該保藏法。 其缺點是需購置超低溫液氮設備，且液氮消耗較多，操作費用較高。要使用菌種時，從液氮罐中取出安瓿瓶，并迅速放到 3540溫水