課堂報告：生物強化技術(shù)及應(yīng)用(趙翠)

1、生物強化技術(shù)及應(yīng)用環(huán)境科學(xué)與工程環(huán)境科學(xué)與工程趙翠趙翠1072704210727042主要內(nèi)容生物強化的概況高效菌種的制備工藝的調(diào)控生物強化主要的技術(shù)方法生物強化的工程應(yīng)用討論與展望生物強化的基本原理生物強化技術(shù)（Bioaugmentation，BA技術(shù)），是向污染物處理系統(tǒng)中投加特殊的菌種，去除某一種或某一類有毒有害、難降解的有機物，以保持和提高系統(tǒng)的處理效率。傳統(tǒng)分離、純化、富集及發(fā)酵生產(chǎn)利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)設(shè)計與生產(chǎn)的工程菌投菌法：向處理系統(tǒng)投加具有特異降解性的高效菌劑固定化技術(shù)：將高效菌或酶固定于載體，再投入處理系統(tǒng)菌劑的研發(fā)菌劑的研發(fā)工藝的調(diào)控工藝的調(diào)控生物強化技術(shù)菌劑的研發(fā)異形生物

2、質(zhì)條件下優(yōu)勢菌種的篩選 外部的選擇壓力(異形生物質(zhì)) 馴化培養(yǎng) 分離（稀釋涂平板法、倒平板法等） 純化（平板劃線法） 富集培養(yǎng)（發(fā)酵）分子遺傳育種（原生質(zhì)體、基因工程） 將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細胞內(nèi)使這個基因能在受體細胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達的操作改變物種的遺傳特性基因工程原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體融合，跨越不同種屬的遺傳障礙，使菌株具有兩套以上親本的遺傳基因。對數(shù)生長早期菌株溶菌酶原生質(zhì)體融合物理激光融合超聲融合電融合化學(xué)pH誘導(dǎo)生物紫外滅活病毒膜片融合質(zhì)體篩選抗性互補篩選熒光染色篩選目的融合質(zhì)體應(yīng)用：l黑曲霉M70（酸性蛋白酶）與米曲霉 M4（中、堿性蛋白酶和淀粉酶）融合 提高了降解淀

3、粉、蛋白的能力（王建華 ，2007）l酵母菌與降解蘋果酸裂殖酵母屬間融合 提高了其發(fā)酵能力（丁朋曉 ，2007）基因工程育種轉(zhuǎn)化游離的DNA分子適應(yīng)環(huán)境轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒噬菌體廣泛性、特異性接合可移動遺傳因子（質(zhì)粒、 轉(zhuǎn)座子） 革蘭氏陰性菌較多見，陽性菌有鏈酶菌、放線菌、分枝桿菌應(yīng)用：lBurkholderiacepacia G4，芳香族化合物的存在共代謝三氯乙烯（TCE） 插入Tn5，直接表達降解TCE的鄰甲苯單氧化酶（Winker J ，1995）l將Alicaligenes eutrophus JMP134菌，含有質(zhì)粒 pJP4，攜帶降解2,4- 二氯苯氧基乙酸(2,4-D)基因產(chǎn)生抗汞性能 轉(zhuǎn)入

4、土壤，產(chǎn)生接合子，含有質(zhì)粒 pJP4 ，攜帶降解2,4- 二氯苯氧基乙酸(2,4-D)基因產(chǎn)生抗汞性能（Digiovanni GD，1996） 目前應(yīng)用廣泛的商品化菌劑生產(chǎn)廠家產(chǎn)品應(yīng)用領(lǐng)域愛爾蘭生化試劑有限公司 Biolyte 系列有機廢水、肉類及乳品加工廢水、紙漿、工業(yè)廢水處理 美國俄亥俄州環(huán)境科學(xué)總公司 IMO 城市污水處理 美國艾爾克蒙公司 Alken Clear - Flo動物糞便中的纖維、蛋白、脂肪和剩余的碳水化合物處理美國普羅生物技術(shù)有限公司Probiotic Solution、Huma Gro系列工業(yè)廢水處理、河道及湖泊景觀水生態(tài)治理、土壤修復(fù)及農(nóng)業(yè)、園藝Zebec System

5、s公司Z - BIO 系列農(nóng)業(yè)污水、水產(chǎn)業(yè)污水、工業(yè)廢水、市政污水、石化廢水處理休斯頓生物環(huán)境技術(shù)有限公司優(yōu)質(zhì)的細菌合成產(chǎn)品除臭、清潔陰溝、處理油脂和石油污染日本琉球大學(xué)EM農(nóng)牧、養(yǎng)殖、工業(yè)、環(huán)保、醫(yī)療、日常生活廢水處理香港以諾集團Enochem 系列環(huán)保、生態(tài)農(nóng)業(yè)、畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)廢水處理上海英普環(huán)保技術(shù)有限公司BiNutrix - ww工業(yè)廢水處理微生物與基質(zhì)間的作用優(yōu)勢菌種直接作用共代謝基質(zhì)協(xié)同作用基質(zhì)酶高效微生物基質(zhì)高效微生物酶生長基質(zhì)酶高效微生物酶微生物在水處理系統(tǒng)中的存在形態(tài)游離懸浮狀態(tài)-競爭生存，易流失接觸固著生長-固定在膜表面的生物更穩(wěn)定、增加了細胞膜的接觸時間質(zhì)粒結(jié)合的最佳環(huán)境

6、象是瓊脂平板和濾膜表面（Angles ML, 1993）固定化方法 吸附法(載體結(jié)合法)、包埋法、交聯(lián)法(架橋法)、無載體固定化技術(shù) 固定化技術(shù)吸附法 包埋法交聯(lián)法 無載體固定化非水溶性載體物理吸附，化學(xué)或離子結(jié)合高分子微小網(wǎng)格物理截留交聯(lián)劑官能團與細胞表面氨基、羥基共價鍵結(jié)合碎石、卵石、煤渣、焦碳、硅藻土、多孔磚、石英砂、硅膠、沸石、活性炭聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酰氨(ACAM)、聚乙烯乙二醇(PEG)、瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠等凝膠幾丁質(zhì)、N,N/-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA ）微生物自絮凝幾種微生物固定化載體的性能指標瓊脂海藻酸鈣角叉膠聚丙烯酰銨（ACAM）聚乙烯醇（PVA）壓力強度（

7、Kg/cm2）0.50.80.81.42.8耐曝氣強度差一般一般好好耐生物分解差較差較差好好對生物毒性無無無較強一般固定化難易程度易易易較難較易成本一般較低較高高一般分子生物學(xué)的檢測技術(shù)特異微生物檢測及定量化技術(shù)l生物標記基因l基于PCR的技術(shù)微生物群落結(jié)構(gòu)組成和動態(tài)演替規(guī)律研究l基因指紋技術(shù)l熒光原位雜交（FISH）生物標記基因外源DNA序列插入微生物體內(nèi)，使其具備一定基因型或表現(xiàn)型可用于跟蹤環(huán)境中特定微生物的檢測方法用于跟蹤環(huán)境中特定微生物的生物標記生物標記檢測表現(xiàn)型檢測方法抗生素抗性基因npt具有抗生素抗性（如抗卡那霉素）用含抗生素的選擇培養(yǎng)基篩選重金屬抗性基因mer 抗重金屬（如抗汞）

8、用含抗生素的選擇培養(yǎng)基篩選產(chǎn)色素標記基因lacZY分解底物產(chǎn)生帶顏色的產(chǎn)物（如半乳糖苷酶分解X-gal形成藍色產(chǎn)物）用產(chǎn)色素培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)色素標記基因xyIE當鄰苯二酚存在時產(chǎn)生黃色代謝產(chǎn)物用產(chǎn)色素培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌熒光素酶基因luxAB在含n-癸醛的基質(zhì)中產(chǎn)生生物熒光用光度計測定光輸出對產(chǎn)熒光素菌落進行平板計數(shù)真核生物熒光素酶基因luc含熒光色素的基質(zhì)中產(chǎn)生生物熒光用光度計測定光輸出對產(chǎn)熒光素菌落進行平板計數(shù)綠色熒光蛋白基因gfp在藍光激發(fā)下會產(chǎn)生綠色熒光選擇性培養(yǎng)流式細胞儀或表面熒光顯微鏡計數(shù)基于PCR的技術(shù)PCR是一種在體外擴增核酸序列，從而得到多個核酸拷貝的技術(shù)。PCR與DNA技術(shù)相結(jié)合,實

9、現(xiàn)了環(huán)境樣品中微量特異片斷的檢測?；赑CR方法的微生物定量化技術(shù)在生物強化系統(tǒng)中的應(yīng)用細菌目標基因定量化方法文獻Mycobacteriumchlorophenolicum(五氯酚降解菌)16S rDNAMPN-PCRElsas JD, 1997Desulfitobacteriumfrappieri (五氯酚降解菌)16S rDNA嵌套PCRLevesque MJ, 1997PseudomonasabietaniphilaBKME-9(樹脂酸降解菌)16S rDNA競爭PCR和競爭T-PCRKa JO, 2001Pseudomonasputida(甲苯降解菌)xyIE競爭PCRHallier

10、SS, 1996Pseudomonasputida11172(苯酚降解菌)dmPNPCR和RT-PCRSelvaratnam S, 1997Pseudomonas.51(三氯苯降解菌)tbcB競爭RT-PCRTchelet R, 1999Pseudomonasresinovorans10(咔唑和二苯基2對2二惡英降解菌)carAa實時競爭PCRWidada J, 1999基因指紋技術(shù)基因指紋技術(shù)可提供微生物菌群基因的多態(tài)性譜圖。環(huán)境樣品中不同微生物的混合物中序列的多樣性和不同序列的豐度反映原始樣品中微生物種群的多樣性和不同物種的豐度。生物強化系統(tǒng)微生物菌群結(jié)構(gòu)分析的基因指紋技術(shù)l限制性長度多態(tài)

11、性（restriction fragment length polymorphism, PFLP）l變性梯度凝膠電泳（danaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）l溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis, TGGE）lPCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformational polymorphism, SSCP）熒光原位雜交（FISH）微生物細胞在固定材料上脫水后，與帶有熒光染料標記的寡核糖探針在一定溫度下混合。與探針堿基對完全互補序列的隨即與探針發(fā)生雜交，從而使

12、該菌體在熒光顯微鏡下發(fā)出熒光。原位雜交技術(shù)結(jié)合了分子生物學(xué)的精確性和顯微鏡的可視性，能夠在自然的微生境中快速監(jiān)測和鑒定不同微生物個體，同時對微生物群落進行評價。應(yīng)用應(yīng)用的領(lǐng)的領(lǐng)域域應(yīng)用方向應(yīng)用方向污染物污染物Pollutants菌劑菌劑參考文獻參考文獻Reference土壤土壤修復(fù)氯酚紅球菌趙璇，2006石油污染的土壤鹽堿化、板結(jié)化嗜鹽真細菌、好氧的嗜鹽古生菌、厭氧的極端嗜鹽產(chǎn)甲烷古生菌楊玉楠，2007生物泥漿反應(yīng)器多環(huán)芳烴鐮刀菌、毛著霉等真菌鞏宗強，2001水體垃圾滲濾液纖維素、木質(zhì)素、腐殖酸EM制劑（光合細菌、乳酸菌、酵母菌、放線菌）毛媛媛，2007紙漿廢水纖維素、木質(zhì)素和其他纖維材料Bi

13、olyte C70菌劑馬放，2004焦化廢水吡啶類污染物類產(chǎn)堿假單胞菌、普通變形桿菌屬假單胞菌屬Padoley KV，2006白曉平，2004Kim MK2006石油廢水脂肪烴、芳香烴多環(huán)芳烴假單胞菌Friello DA，1976農(nóng)業(yè)廢水除草劑放射土壤桿菌Vikova J，1995印染廢水聯(lián)苯胺、乙萘胺假單胞菌屬、紅螺菌屬曾麗璇，1999制革廢水有機物、硫化物芽胞桿菌、光合細菌、乳酸菌、酵母菌劉達偉，2005生物強化在工程上的應(yīng)用討論與展望生物強化的意義l提高了對目標污染物的去除率；l改善污泥性能和減少污泥總量；l增強系統(tǒng)的抗沖擊負荷能力和穩(wěn)定性；l加快系統(tǒng)啟動速度。展望l如何定性定量地分析微

14、生物與污染物降解的相關(guān)性;l確定生物強化技術(shù)工藝工程設(shè)計的關(guān)鍵參數(shù),l研究快速高效的投加菌方式及生物強化的安全檢測技術(shù)l建立投菌量、活性檢測、菌株或復(fù)合菌群等參數(shù)的模型，充分發(fā)揮其在環(huán)境治理中的作用。ReferencesAngles ML , Marshall KC, Goodman AE. Plasmid transfer between marine bacteria in the aqueous phase and biofilm in reactor microcosms. Appl Environ Microbiol,1993,59(3):843-850Digiovanni GD,

15、Neilson JW, Pepper IL. Gene-transfer of alcaligenes-eutrophus JMP134 plasmid pTP4 to indigenous soil recipients. Appl Environ Microbiol, 1996,62(7):2521Elsas J D van, Mantynen V , Wolters A C. Soil DNA extraction and assessment of the fate of M ycobacterium chlorophenolicum strain PCP-1 in different

16、 soils by 16S ribosomal RNA gene sequence based most-p robable-number PCR and immunofluorescence. Biol. Fertil. Soil, 1997,24: 188-195Friello D A, Mylrie I R, Chakrabary A M, Use of genetically engineered multiplasmid Microorganisms for the rapid degradation of fuel hydrocarbons in Sharply Kaplan (e

17、ds). Biodeterioration of Materials 1976,3:205-214Hallier Soulier S, Ducrocq V, Mazure N, et al. Detection and quantification of degradative genes in soils contaminated by toluene. FEMS Microbiol Ecol.,1996, 20 (2) : 121-133Ka JO, Yu Z and Mohn WW. Monitoring the size and metabolic activity of the ba

18、cterial community during biostimulation of fuel-contaminated soil using competitive PCR and RT-PCR. Microbiol Ecology. 2001, 42 (3) : 267-273Kim MK，Singleton I，Yin CR，Quan ZX，Lee M，Lee ST.Influence of phenol on the biodegradation of pyridine by freely suspended and immobilized Pseudomonas putida MK1

19、J. Letters in Applied Microbiology，2006，42（5）：495-500.Levesque MJ, La-Boissiere S, Thomas JC, et al. Rapid method for detecting Desulf itobacterium frappiristrain PCP-1 in soil by the polymerase chain reaction. App l. Microbiol.Biotechnol. , 1997, 47: 719-725Padoley KV，Rajvaidya AS，Subbarao TV，Pande

20、y RA.Biodegradation of pyridine in a completely mixed activated sludge processJ. Bioresource Technology，2006，97（10）：1225-1236.Selvaratnam S, Schoedel BA, McFarland BL, et al. Application of the polymerase chain reaction ( PCR) and reverse transcriptase /PCR for determining the fate of phenol-degradi

21、ng Pseudom onas putida ATCC 11172 in a bioaugmented sequence batch reactor. Appl. Environ. Microbiol., 1997, 63 (12) : 4708-4716Tchelet R, Meckenstock R, Steinle P, et al. Population dynamics of an introduced bacterium degrading chlorinated benzenes in a soil column and in sewage sludge. Biodegradat

22、ion, 1999, 10 (2) : 113-125ReferencesVekovaJ.DegradationofbromoxylilbyristingandimmobilizecellsofAgraobacteriumradiobacterstrainJ.BiotechnolLett 1995,17(4):449452.Widada J, Nojiri H, Kasuga K, et al. Quantification of carbazole, 9a-dioxygenase gene by realtime compectitive PCR combined with co-extraction of internal standards. FEMS Microbio. Lett. 2001, 202 (1) : 51-57 Winker J, Timmis KN. Tracking the response of burkholderiacepacia G4-5223 Prilinaquifer microcosms. Appl Environ Microbiol, 1995,61(2):448白曉平.一組優(yōu)勢菌對焦化廢水中吲哚、吡啶的降解條件的實驗研究J.微生