人類細胞質(zhì)RTPCR的原理方法瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用

1、人類細胞質(zhì)、RT-PCR的原理、方法、瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用分析不同發(fā)育時期基因的表達狀況分析不同發(fā)育時期基因的表達狀況獲得新基因獲得新基因研究基因的拼接研究基因的拼接分析相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物分析相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物RNARNA提取的原理提取的原理在哺乳動物中，rRNA占總量的80%-85%，tRNA和核內(nèi)小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等幾類組成，這些RNA分子根據(jù)密度和分子大小，通過密度梯度離心、凝膠電泳、離子交換層析進行分離mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一，在細胞中含量少，絕大多數(shù)mRNA分子（除血紅蛋白、有些組蛋白mRNA以外）在3端

2、存在20-250個多聚腺苷酸(polyA)。利用此特點，用oligo(dT)親和層析柱分離mRNA。RNA分離的最關(guān)鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細胞內(nèi)源性RNA酶外，環(huán)境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA時，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通過RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和強力的蛋白質(zhì)變性劑如異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶。1、異硫氰酸胍法： GuSCN 是一種強的蛋白質(zhì)變性劑，能夠裂解細胞的同時，還能有效地抑制內(nèi)源性 Rnase的活性，通過有機

3、溶劑的分步抽提，可獲得純度較高的細胞總RNA。 特點：需低溫操作，但價格經(jīng)濟。2、Trizol 試劑（商品化產(chǎn)品） 特點：在室溫下可以提取細胞總RNA， 具有簡單、快速、提取量大、純度高的優(yōu)點。3、mRNA提取試劑盒 真核細胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纖維素結(jié)合mRNA，將其從細胞總RNA中分離出來。RNARNA提取的方法提取的方法TrizolTrizol法法 Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細胞或組織中提取總RNA。其含有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細胞并抑制細胞釋放出的核酸酶。在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性，因此對純化RNA及標準化R

4、NA的生產(chǎn)十分有用。TrizolTrizol法法 Trizol的主要成分是異硫氰酸胍和酚。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。酚雖可有效的變性蛋白質(zhì)，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中還加入了8羥基喹啉、-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機相，RNA選擇性地進入無DNA和蛋白質(zhì)的水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機相可回收蛋白質(zhì)。TrizolTrizol法法Trizol試劑可用于小量樣品（50100mg組織

5、、5106細胞）也適用于大量樣品（1g組織、107細胞）。對人，動物，植物組織，細菌均適用，整個提取過程在一小時內(nèi)即可完成。分離的總RNA無蛋白質(zhì)和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA篩選，體外翻譯，RNase保護分析和分子克隆。RNARNA提取的一般步驟提取的一般步驟破碎組織分離RNA沉淀RNA洗滌RNA融解RNA保存RNA1 1、破碎組織和滅活、破碎組織和滅活RNARNA酶可以同步進行酶可以同步進行可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40NP-40、SDSSDS、蛋白、蛋白酶酶K K等破碎組織等破碎組織 加入加入-ME-ME可以抑制可

6、以抑制RNARNA酶活性酶活性2 2、分離、分離RNARNA一半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNARNA一般分布于上一般分布于上層，與蛋白層分開層，與蛋白層分開。3 3、沉淀沉淀RNARNA一般用乙醇、一般用乙醇、3M NaAc3M NaAc（pH-5.2pH-5.2）或異丙醇）或異丙醇。4 4、洗滌洗滌RNARNA使用使用7070乙醇洗滌，有時，為避免乙醇洗滌，有時，為避免RNARNA被洗掉，被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解

7、。乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。5 5、融解融解RNARNA一般使用一般使用TETE( (緩沖液）緩沖液）。6 6、保存、保存RNARNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNaseRNase的污染，從的污染，從富含富含RNaseRNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNARNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNARNA，對于，對于長期貯存也應(yīng)該如此。長期貯存也應(yīng)該如此。瓊脂糖凝膠電泳的原理瓊脂糖凝膠電泳的原理瓊脂糖凝膠電泳主要是應(yīng)用瓊脂糖凝膠作為支持物的電泳法，借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用核酸片段因其分

8、子量或者分子形狀的不同，電泳度有差異而分離，這種技術(shù)是基因操作中常用的種方法。瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用分離不同片段大小和不同構(gòu)象的DNA、RNA分子鑒定DNA的片段，如PCR產(chǎn)物的鑒定純化DNA分子2022-5-19瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳凝膠準備膠床準備鋪膠靜置膠床置于電泳槽中加電泳緩沖液拔梳子上樣電泳取出凝膠拍照2022-5-19人類細胞質(zhì)人類細胞質(zhì)RNARNA提取提取完整的完整的RNA的電泳可明顯地觀察到的電泳可明顯地觀察到28S和和18S兩條帶，并且兩條帶，并且28S大約是大約是18S的兩倍寬。的兩倍寬。若兩條帶不明顯若兩條帶不明顯, 則說明則說明RNA部分降解部分

9、降解,可能的原因是可能的原因是RNase。 RNA電泳結(jié)果電泳結(jié)果 rRNA可以作為內(nèi)部可以作為內(nèi)部Marker分分子，通過觀察子，通過觀察rRNA的兩條帶的兩條帶（28S和和18S）的比例，可以判）的比例，可以判斷所提取斷所提取mRNA是否存在降解。是否存在降解。 RNA電泳并不能判斷電泳并不能判斷mRNA是否提取成功，也不作為鑒定是否提取成功，也不作為鑒定RNA提取質(zhì)量的常規(guī)方法，因提取質(zhì)量的常規(guī)方法，因為為在電泳過程中在電泳過程中RNA可能發(fā)生可能發(fā)生降解降解。RT-PCRRT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)

10、，是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。是一快速、簡便、敏感性極高的檢測RNA的方法。RT-PCR的原理的原理提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR的應(yīng)用的應(yīng)用分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物獲取目的基因合成cDNA探針構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)2022-5-19RT-PCR的步驟的步驟提取原理提取原理、方法、方法逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物引物原理體系原理體系引物選擇引物選擇電泳原理電泳原理電泳步驟電泳步驟 逆轉(zhuǎn)錄酶：逆轉(zhuǎn)錄酶： 存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)。

11、 常見有哺乳動物型37oC，禽類型42oC 。 以mRNA為模板的DNA聚合酶，形成與RNA堿基相互補DNA鏈，后者稱為互補DNAcDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) (RT)AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC, annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-42oC, RTase mRNAmRNAcDNA10min1-2h RTRT-PCR的逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RN

12、A為模板合成cDNA第一條鏈；2、Rnase水解活性：水解RNA雜合體中的RNA；3、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA. 常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種：鳥類成髓細胞性白血病病毒（AMV)反轉(zhuǎn)錄酶 莫羅尼鼠類白血病病毒（MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶 合成合成cDNA引物的選擇引物的選擇1隨機六聚體引物：當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRN

13、A。合成合成cDNA引物的選擇引物的選擇2Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。合成合成cDNA引物的選擇引物的選擇3異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA3端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴增。PCRPCR技術(shù)(olymerase chain reaction)：即聚合酶鏈式反應(yīng)。在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，其特異性由兩個人工合成的引物序列決定。反應(yīng)分三步：A、變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；B、退火：將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結(jié)合。C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2存在