血紅蛋白的提取和分離(適合公開課)

1、請核對導(dǎo)學(xué)案答案請核對導(dǎo)學(xué)案答案緒緒 1.差異性 2.來源和性質(zhì) 3. 20 、 、4、2個 、2個、亞鐵、一分子 氧、 一分子二氧化碳 4.血紅蛋白含量豐富，容易獲取。（一）樣品處理及粗提取（一）樣品處理及粗提取1.樣品處理 、粗分離、純化 和純度鑒定。2.血漿、雜蛋白、檸檬酸鈉、五、生理鹽 水、緩慢、低速短時、上清液沒有黃色3.紅細胞、等、蒸餾水、甲苯、磁力攪拌器4.血紅蛋白、高速離心、無 、甲苯、白、脂溶 性沉淀、紅 、血紅蛋白溶液、暗紅、破碎物沉 淀、濾紙、脂溶性沉淀、分液漏斗、血紅蛋白 溶液5.無機鹽離子、有機小分子、透析袋、磷酸緩沖 液（二）凝膠色譜操作（二）凝膠色譜操作 2.交聯(lián)

2、程度、膨脹程度和分離范圍、得水值、 7.5、蒸餾水、均勻 、氣泡、磷酸緩沖液 、 緊密 。 3.管壁、凝膠面、色譜柱底部、5（三）操作提示（三）操作提示 1.白細胞 2.洗脫液、沸水浴、微生物、空氣 3.擾亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序請請拿出拿出課本、雙色筆、導(dǎo)學(xué)案課本、雙色筆、導(dǎo)學(xué)案 讓我們準備好進行思維的碰撞讓我們準備好進行思維的碰撞回顧：回顧：1.1.凝膠色譜法和電泳的基本原理？凝膠色譜法和電泳的基本原理？2.2.緩沖溶液的作用？緩沖溶液的作用？請請3組組A1闡述闡述請請5組組A2闡述闡述 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理（根據(jù)分子量的大小分子量的大?。?相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部

3、通道，路程較長移動速度較慢； 相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部通道，路程較短移動速度較快； 相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。 凝膠電泳的原理 帶電粒子在電場的作用下發(fā)生定向遷移，在加入SDS排除電荷多少的影響后，使電泳遷移率完全取決于分子大小，從而達到分離的目的。課題3 血紅蛋白的提取和分離 實驗操作要領(lǐng) 知識目標：知識目標：（1）描述描述凝膠色譜分離蛋白質(zhì)的步驟步驟；（2）理解進行樣品的預(yù)處理的目的預(yù)處理的目的；（3）運用凝膠色譜法對血紅蛋白進行分離純化。 重、難點：重、難點：（1）描述描述凝膠色譜分離蛋白質(zhì)步驟步驟；（2）運用凝膠色譜法對血紅蛋白進行分離純化。 全班同學(xué)一起朗

4、讀全班同學(xué)一起朗讀蛋白質(zhì)提取和分離步驟蛋白質(zhì)提取和分離步驟具具體體操操作作步步驟驟（一）（一）（二）（二）（三）（三）（四）（四）哺哺乳乳血血液液血血 漿漿水水 分分固體物質(zhì)固體物質(zhì)血漿蛋白血漿蛋白無機鹽無機鹽磷磷 脂脂葡萄糖等葡萄糖等血細胞血細胞白細胞白細胞血小板血小板紅細胞紅細胞（最多最多）血紅蛋白血紅蛋白 （ ）9090有沒有，多不多，易不易有沒有，多不多，易不易1.洗滌紅細胞洗滌紅細胞1.1 洗滌的目的：洗滌的目的：洗去血液中血漿及血小板等中的洗去血液中血漿及血小板等中的雜蛋白雜蛋白1.2 洗滌過程：洗滌過程：血液血液100mL3g檸檬酸鈉檸檬酸鈉低速離心低速離心2 min紅細胞紅細胞

5、血血 漿漿吸出血漿吸出血漿紅細胞紅細胞5倍體積倍體積生理鹽水生理鹽水緩慢攪拌緩慢攪拌10min重復(fù)洗滌重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有次，直至上清液沒有防止破壞紅防止破壞紅細胞，使血細胞，使血紅蛋白流失紅蛋白流失（一）樣品處理（一）樣品處理黃色黃色2. 血紅蛋白的釋放血紅蛋白的釋放原理：紅細胞滲透作用吸水漲破，釋放血紅蛋白原理：紅細胞滲透作用吸水漲破，釋放血紅蛋白3.分離血紅蛋白溶液分離血紅蛋白溶液分離過程：分離過程：紅細胞紅細胞混合液混合液離心管離心管甲苯層甲苯層脂類物質(zhì)脂類物質(zhì)血紅蛋白層血紅蛋白層破碎物沉淀層破碎物沉淀層高速離心高速離心10min 濾紙濾紙過濾過濾脂類物質(zhì)脂類物質(zhì)沉淀物沉淀物燒

6、杯燒杯分液分液漏斗漏斗20mmol/L磷酸緩沖液磷酸緩沖液透析的目的是什么？透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血紅蛋白中的小分子雜質(zhì)去除血紅蛋白中的小分子雜質(zhì)（二）粗分離（二）粗分離透析血紅蛋白透析血紅蛋白注意事項注意事項（1）生理鹽水作用？）生理鹽水作用？（3）兩次離心的差異？）兩次離心的差異？（4）透析袋的作用機理？）透析袋的作用機理？模擬紅細胞生存環(huán)境，模擬紅細胞生存環(huán)境，保持紅細胞結(jié)構(gòu)完整。保持紅細胞結(jié)構(gòu)完整。破碎紅細胞；溶解細胞膜破碎紅細胞；溶解細胞膜釋放血紅蛋白。釋放血紅蛋白。前慢后快，前短后長。前慢后快，前短后長。滲透作用滲透作用（2）蒸餾水和甲苯的作用？）蒸餾水和甲苯的作

7、用？（三）純化（三）純化1.凝膠色譜柱的制作凝膠色譜柱的制作（2）規(guī)格：玻璃管）規(guī)格：玻璃管長長40cm，內(nèi)徑，內(nèi)徑1.6cm，兩端磨平；，兩端磨平； 橡皮塞橡皮塞能塞入玻璃管，上平小凹；能塞入玻璃管，上平小凹； 移液管移液管0.5mL，長，長5cm； 尼龍網(wǎng)尼龍網(wǎng)100目；目； 打孔器打孔器移液管能塞入。移液管能塞入。（1）材料：玻璃管，橡皮塞、移液管、尼龍網(wǎng)）材料：玻璃管，橡皮塞、移液管、尼龍網(wǎng) 尼龍管、打孔器、小刀、螺旋夾尼龍管、打孔器、小刀、螺旋夾2.凝膠色譜柱的填裝凝膠色譜柱的填裝（1）認識凝膠）認識凝膠Sephadex G75 G :交聯(lián)程度、膨脹程度、分離范圍交聯(lián)程度、膨脹程度、

8、分離范圍 75：凝膠得水值，即每克凝膠膨脹得水：凝膠得水值，即每克凝膠膨脹得水7.5克克（3 3）填裝：緩慢一次填裝，均勻，緊密、不能有氣泡，迅速）填裝：緩慢一次填裝，均勻，緊密、不能有氣泡，迅速 連接緩沖液連接緩沖液（2）認識緩沖液：）認識緩沖液：300mL、20mmol/L、PH=7.0磷酸緩沖液磷酸緩沖液3.樣品的加入和洗脫樣品的加入和洗脫開下端開下端 關(guān)下端關(guān)下端開下端開下端加樣加樣樣品完全滲入樣品完全滲入緩沖液面緩沖液面=凝膠面凝膠面關(guān)下端關(guān)下端加緩沖液加緩沖液接洗脫瓶接洗脫瓶開下端開下端注意：待紅色的蛋白質(zhì)接近柱底是，開始收集，注意：待紅色的蛋白質(zhì)接近柱底是，開始收集， 連續(xù)收集，

9、每管連續(xù)收集，每管5ml疑問：疑問：連續(xù)收集得到的連續(xù)收集得到的每一管每一管中是否為中是否為同一分子質(zhì)量同一分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)？的蛋白質(zhì)？（四）純度鑒定（四）純度鑒定電泳電泳1.原理：帶電粒子在電場中發(fā)生定向遷移，從而把不同質(zhì)量原理：帶電粒子在電場中發(fā)生定向遷移，從而把不同質(zhì)量和電量的粒子分離開。加入電量遠大于比粒子自身帶電量的和電量的粒子分離開。加入電量遠大于比粒子自身帶電量的SDS，排除電荷對粒子遷移大小的影響，據(jù)此將，排除電荷對粒子遷移大小的影響，據(jù)此將不同分子質(zhì)不同分子質(zhì)量量的粒子分開。的粒子分開。2.電泳結(jié)果分析電泳結(jié)果分析如果出現(xiàn)一個條帶：樣品中含有如果出現(xiàn)一個條帶：樣品中含有一個分

10、子質(zhì)量級別一個分子質(zhì)量級別多肽；多肽； 如果出現(xiàn)兩個條帶：樣品中含有如果出現(xiàn)兩個條帶：樣品中含有兩個分子質(zhì)量級別兩個分子質(zhì)量級別多肽。多肽。 題目：題目：（1）探究探究問題問題1、2、3（2）自己存在的其他疑問）自己存在的其他疑問要求：要求：（1）小組長搞好組織調(diào)控：先）小組長搞好組織調(diào)控：先一對一一對一討論，再組內(nèi)跨層討論，再組內(nèi)跨層 交流；重點討論答案交流；重點討論答案的的科學(xué)性；科學(xué)性；（2）討論形成的答案要條）討論形成的答案要條理清晰、要點化、序號化理清晰、要點化、序號化。幫。幫 助展示同學(xué)做好展示準備。助展示同學(xué)做好展示準備。 A層層 解決全部疑難，并幫助解決全部疑難，并幫助B層完善

11、答案層完善答案, 幫助其他同學(xué)解決疑難點。幫助其他同學(xué)解決疑難點。 B層層 解決疑難后，負責展示。解決疑難后，負責展示。 C層層 解決疑難解決疑難，狂記狂記導(dǎo)導(dǎo)學(xué)案自主學(xué)習(xí)部分學(xué)案自主學(xué)習(xí)部分。展展示點評示點評安排安排題目題目 展示小組展示小組點評小組點評小組 非展示同學(xué)非展示同學(xué)探究探究1 1討論完后討論完后B B、C C層層落實落實基本原理的理解和記基本原理的理解和記憶憶（3 3分鐘記分鐘記?。┳。〢 A層層及時補充點評及時補充點評探究探究2 2探究探究3 3 點評、拓展、升華點評、拓展、升華 約約1010分鐘分鐘點評答題規(guī)范、答案的正誤或全面否，進行答案的補充修正，點評答題規(guī)范、答案的正

12、誤或全面否，進行答案的補充修正，或知識拓展，或規(guī)律方法的總結(jié)?；蛑R拓展，或規(guī)律方法的總結(jié)。其他同學(xué)注意傾聽、積極思考其他同學(xué)注意傾聽、積極思考,重點內(nèi)容記好筆記。有不明白或重點內(nèi)容記好筆記。有不明白或有補充的同學(xué)要大膽提出。有補充的同學(xué)要大膽提出。其它小組可進行補充點評或拓展其它小組可進行補充點評或拓展1B21B24B24B2、5B15B12B12B1、3B13B16B16B17B27B28B28B2要求：要求：展示人及時到位，規(guī)范快速、脫稿展示人及時到位，規(guī)范快速、脫稿。答案要答案要序號化、要點化序號化、要點化。組長搞好調(diào)控，可分工展示。組長搞好調(diào)控，可分工展示。準備準備質(zhì)疑、補充質(zhì)疑、補

13、充，高效科研小組成員發(fā)揮帶頭作用，高效科研小組成員發(fā)揮帶頭作用。要求：要求：1.B1.B層、層、C C層結(jié)合學(xué)習(xí)目標，鞏固落實本課的基層結(jié)合學(xué)習(xí)目標，鞏固落實本課的基礎(chǔ)知礎(chǔ)知 識識；A A層達成目標后層達成目標后，整理合作探究答案。，整理合作探究答案。2.2.組長抽查本組基礎(chǔ)知識的掌握組長抽查本組基礎(chǔ)知識的掌握情況。情況。（1）記憶凝膠色譜分離蛋白質(zhì)的步驟；（2）理解進行樣品的預(yù)處理的目的；本節(jié)內(nèi)容目標：獲取血紅蛋白溶液本節(jié)內(nèi)容目標：獲取血紅蛋白溶液獲獲 取取紅細胞紅細胞（離心）（離心）破碎紅細胞，破碎紅細胞，釋放血紅蛋白釋放血紅蛋白從各從各紅細胞紅細胞的成分的成分中獲中獲取血紅蛋白取血紅蛋白

14、 （離心）（離心）初步純化初步純化血紅蛋白血紅蛋白（透析）（透析）1.下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白的程度敘述正確的是（下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白的程度敘述正確的是（ ）多選多選 A.樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液 B.通過透析可以去除樣品中分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取通過透析可以去除樣品中分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取 C.可通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化可通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化 D.可通過可通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒

15、定血紅蛋白的純度ACD2.下列是有關(guān)血紅蛋白提取和分離的相關(guān)操作，其中正確的是（下列是有關(guān)血紅蛋白提取和分離的相關(guān)操作，其中正確的是（ ） A.可采集豬血作為實驗材料可采集豬血作為實驗材料 B.用蒸餾水重復(fù)洗滌紅細胞用蒸餾水重復(fù)洗滌紅細胞 C.血紅蛋白釋放后應(yīng)低速短時間離心血紅蛋白釋放后應(yīng)低速短時間離心 D.洗脫液接近色譜柱底端時開始收集流出液洗脫液接近色譜柱底端時開始收集流出液A 2組組A11組組A23.樣品的加入和洗脫的操作不正確的是（樣品的加入和洗脫的操作不正確的是（ ）A.加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩 沖液緩慢下降

16、到凝膠面的下面沖液緩慢下降到凝膠面的下面B.加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)C.等樣品完全進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口等樣品完全進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口D.用吸管小心的將用吸管小心的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要 破壞凝膠面破壞凝膠面4.在裝填凝膠柱時，不能有氣泡存在的原因是（在裝填凝膠柱時，不能有氣泡存在的原因是（ ）A.氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果B.氣泡阻礙蛋白質(zhì)的運動氣泡阻礙蛋白質(zhì)的運動C.氣泡與蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)氣泡與蛋白質(zhì)

17、發(fā)生化學(xué)反應(yīng)D.氣泡在裝填凝膠的時候，使凝膠不緊密氣泡在裝填凝膠的時候，使凝膠不緊密A A 5組組A23組組A16.下列操作正確的是（下列操作正確的是（ ）A.分離紅細胞時采用低速長時間離心分離紅細胞時采用低速長時間離心 B.紅細胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可紅細胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可C.分離血紅蛋白溶液是低速短時間離心分離血紅蛋白溶液是低速短時間離心 D.透析時要用透析時要用20mmol/l的磷酸緩沖液，透析的磷酸緩沖液，透析12h5.選用紅細胞作分離蛋白質(zhì)的實驗材料，下列是其優(yōu)點的是選用紅細胞作分離蛋白質(zhì)的實驗材料，下列是其優(yōu)點的是 ( )多多A.血紅蛋白是有色蛋白血紅

18、蛋白是有色蛋白 B.紅細胞無細胞核紅細胞無細胞核C.紅細胞蛋白質(zhì)含量高紅細胞蛋白質(zhì)含量高 D.紅細胞紅細胞DNA含量高含量高ABC D 4組組A16組組A27.下面關(guān)于對血紅蛋白提取和分離的樣品的處理措施中，正確下面關(guān)于對血紅蛋白提取和分離的樣品的處理措施中，正確的是的是 ( )多多A.采集血樣后要高速短時問離心獲得血細胞采集血樣后要高速短時問離心獲得血細胞B.洗滌三次后如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)，否則血洗滌三次后如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)，否則血 漿蛋白無法除凈。漿蛋白無法除凈。C.在蒸餾水和甲苯的作用下，細胞破裂，釋放出血紅蛋白在蒸餾水和甲苯的作用下，細胞破裂，釋放出血紅蛋白D.釋放血紅蛋白后再經(jīng)過離心，就可以使血紅蛋白和其他雜釋放血紅蛋白后再經(jīng)過離心，就可以使血紅蛋白和其他雜 質(zhì)分離開來質(zhì)分離開來 BCD8組組A28.在蛋白質(zhì)的提取和分離中，關(guān)于對樣品處理過程中，分析