怎樣用好液相色譜

1、怎樣用好高效液相色譜Leo.xureserviorinjectorpumpcolumndetectorData system液 相 色 譜 儀 的 使 用液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接常見的液相色譜儀問題色譜峰加寬分辨率低裂峰柱壓比預(yù)期值高液 相 色 譜 儀 的 使 用正確連接液相色譜儀系統(tǒng)可使用戶受益，原因如下： 相對比較便宜不需要花費(fèi)大量的時(shí)間系統(tǒng)中大多數(shù)流體連接均易于檢修通常有助于避免不必要的硬件替換 接頭對正確連接至關(guān)重要，因此知道接頭的 一些基本特點(diǎn)也很重要。液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接液 相 色 譜 儀 的 使 用液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接接頭的

2、普通特征螺紋（10-32， -28， M6x1）管道外徑（1/16”、1/32”、1/8”）端口幾何形狀（錐形、平底）管套直徑 接頭要素液 相 色 譜 儀 的 使 用液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接 套圈固定管道，并且始終以相同方式固定用力按入圓錐形端口，如下圖所示套圈錐度（或角度）端口錐度（或角度）接頭要素液 相 色 譜 儀 的 使 用液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接然后在套圈接觸內(nèi)套處壓緊管壁。接頭要素液 相 色 譜 儀 的 使 用液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接通用端口有以下特征：螺紋管道尺寸內(nèi)部幾何形狀但并非所有的接頭都是通用的!接頭要素液 相 色 譜 儀 的

3、使 用液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接接頭要素管套的深度并非通用!即使是最好的接頭，如果不正確使用也會產(chǎn)生許多問題。為什么會出現(xiàn)問題？液 相 色 譜 儀 的 使 用液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接接頭要素 以下示例解釋了不匹配的接頭導(dǎo)致多種色譜法問題的原因：液 相 色 譜 儀 的 使 用接頭要素液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接連接出現(xiàn)泄漏后將會引發(fā)以下問題：系統(tǒng)壓力損失注射假象（鬼峰） 出現(xiàn)混合室（死體積）將會引發(fā)以下問題：色譜峰加寬分辨率減低顯著殘留裂峰引發(fā)色譜法問題的原因很多時(shí)，接頭不匹配或使用不當(dāng)將引發(fā)色譜法問題的原因很多時(shí)，接頭不匹配或使用不當(dāng)將可能導(dǎo)致液相色譜

4、儀的所有主要問題發(fā)生可能導(dǎo)致液相色譜儀的所有主要問題發(fā)生! !液 相 色 譜 儀 的 使 用接頭要素液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接選擇匹配的接頭時(shí)，應(yīng)首先清楚以下問題：使用的端口螺紋類型（例如， 10-32、 -28 等。）使用的端口幾何尺寸 （例如，錐形或平底）所需連接的管道外徑（例如， 1/16”， 1/8”）是否可以手動緊固連接接頭應(yīng)與哪些化學(xué)藥品兼容接頭應(yīng)該承受多大壓力液 相 色 譜 儀 的 使 用管道要素液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接關(guān)于液相色譜儀中的管道，以下三個(gè)要素必須考慮：管道的正確型號管道的最有效尺寸切割管道的合適工具如果想獲取最好的色譜法效果，必須考慮這

5、三個(gè)方面！液 相 色 譜 儀 的 使 用管道要素液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接如果您想選擇適合應(yīng)用需要的管道類型，請考慮以下問題：管道在系統(tǒng)中的使用位置哪種管道材料能夠?qū)崿F(xiàn)最好的兼容性產(chǎn)生多少壓力可提供多種不同類型的管道高壓管道：不銹鋼、PEEK、Radel R、 PEEKsil等。低壓管道: Teflon FEP、 Teflon PFA、Tefzel等。液 相 色 譜 儀 的 使 用管道要素液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接選擇合適的管道尺寸時(shí)，請考慮以下問題： 接受端口需要什么尺寸的管道？流速多少？管道將會產(chǎn)生多大壓力？接頭提供的管道尺寸是多少？請始終注意 -高壓管道最常見

6、的尺寸為：1/16” OD x .010” ID-低壓管道最常見的尺寸為： 1/8” OD x 1/16” ID液 相 色 譜 儀 的 使 用管道要素液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接液 相 色 譜 儀 的 使 用管道要素液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接在具體應(yīng)用中，僅僅選擇合適的管道類型和正確的管道尺寸還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，但是如果管道切割不當(dāng)， 那么結(jié)果可能仍不理想。液 相 色 譜 儀 的 使 用管道要素液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接正確的切割技術(shù)確實(shí)能影響色譜法的質(zhì)量 不正確切割不正確切割 正確切割正確切割液 相 色 譜 儀 的 使 用液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連

7、接儲液器和泵之間的管道連接管道通常用Teflon材料制造，尺寸為1/8” OD x 1/16” ID。將管道連接至泵上的接頭通常為-28螺紋，平底幾何形狀。泵和檢測器之間的管道連接管道通常用PEEK聚合體或不銹鋼材料制造，尺寸為：1/16” OD x .010” ID 或稍小。將管道連接至系統(tǒng)部件上的接頭通常為10-32 螺紋，錐形幾何形狀。檢測器之后的管道連接管道通常用Teflon材料制造，尺寸為1/16” OD選擇正確接頭和管道的一般準(zhǔn)則液 相 色 譜 儀 的 使 用液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接管道內(nèi)徑的公英制換算液 相 色 譜 儀 的 使 用液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正

8、確連接HPLC系統(tǒng)不同部位的管道液 相 色 譜 儀 的 使 用液相色譜儀的正確連接液相色譜儀的正確連接不同色譜柱的管道使用指南流動相脫氣流動相脫氣吹氦脫氣法吹氦脫氣法加熱回流法加熱回流法抽真空脫氣法抽真空脫氣法超聲波脫氣法超聲波脫氣法在線真空脫氣法在線真空脫氣法液 相 色 譜 儀 的 使 用 設(shè)備和材料：設(shè)備和材料：溶劑過濾器、真空泵、0.45u或更 細(xì)的水性濾膜和有機(jī)濾膜 過濾的方法過濾的方法：用加了濾膜的溶劑過濾器和真空泵 抽濾 過濾的目的：過濾的目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞 色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制 的緩沖液。必須做!溶劑和水的前處理：過濾溶劑和水的前處理：過濾液 相 色 譜

9、 儀 的 使 用 設(shè)備和材料：超聲波清洗機(jī)設(shè)備和材料：超聲波清洗機(jī) 脫氣的目的脫氣的目的：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生 的氣泡 氣泡對測定的影響：氣泡對測定的影響： 1）柱流量不準(zhǔn) 2）檢測器基線波動 脫氣注意點(diǎn)脫氣注意點(diǎn)： 1）每天脫氣(無在線脫氣器時(shí)） 2）混合溶劑脫氣時(shí)間不能過長必須做!溶劑和水的前處理：脫氣溶劑和水的前處理：脫氣流動相過濾頭產(chǎn)生的問題流動相過濾頭產(chǎn)生的問題故障特征故障特征“鬼峰鬼峰”(由已被污染的過濾頭造成由已被污染的過濾頭造成)保留時(shí)間不斷改變保留時(shí)間不斷改變(由于過濾頭堵塞或部分堵塞由于過濾頭堵塞或部分堵塞)溶劑過濾頭的清洗溶劑過濾頭的清洗1.取下過濾頭放在取下過

10、濾頭放在(1:4,V/V)的硝酸溶液燒杯中的硝酸溶液燒杯中超聲清洗超聲清洗15分鐘分鐘;2.取出后用蒸餾水超聲清洗取出后用蒸餾水超聲清洗10分鐘分鐘;3.用吸球吹出過濾頭中的液體用吸球吹出過濾頭中的液體;4.再用蒸餾水超聲清洗再用蒸餾水超聲清洗10分鐘分鐘;5.用吸球吹凈過濾頭中的水份用吸球吹凈過濾頭中的水份;6.將過濾頭重新插入溶劑瓶中將過濾頭重新插入溶劑瓶中(正相系統(tǒng)注意將正相系統(tǒng)注意將過濾頭烘干過濾頭烘干) 溶劑的等級溶劑的等級 HPLC級級優(yōu)級純優(yōu)級純分析純分析純都經(jīng)過蒸餾和都經(jīng)過蒸餾和0.45u的過濾的過濾(除纖維毛除纖維毛,未溶解的機(jī)械顆粒未溶解的機(jī)械顆粒)優(yōu)級純的純度比分析純大優(yōu)

11、級純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級經(jīng)過級經(jīng)過0.2u的過濾的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)且除去有紫外吸收的雜質(zhì)溶劑純度的影響溶劑純度的影響 溶劑中的雜質(zhì)會導(dǎo)致出現(xiàn)溶劑中的雜質(zhì)會導(dǎo)致出現(xiàn)“鬼峰鬼峰”，特別是，特別是梯度洗脫時(shí)梯度洗脫時(shí)注意：注意： 只能使用色譜級的溶劑只能使用色譜級的溶劑! 不能使用舊的或未經(jīng)過濾的緩沖溶液不能使用舊的或未經(jīng)過濾的緩沖溶液v溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差，進(jìn)溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差，進(jìn)行樣品之前必須進(jìn)行空白梯度洗脫行樣品之前必須進(jìn)行空白梯度洗脫 ，以辨認(rèn)溶劑，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰。雜質(zhì)峰。v梯度混

12、合的溶劑互溶性要好梯度混合的溶劑互溶性要好v梯度洗脫應(yīng)使用對流動相組成變化不敏感的選擇梯度洗脫應(yīng)使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而性檢測器（如紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器（如示差折光檢測器）（如示差折光檢測器）v每次梯度洗脫之后要對色譜柱進(jìn)行充分的平衡。每次梯度洗脫之后要對色譜柱進(jìn)行充分的平衡。溶劑混合產(chǎn)生的問題溶劑混合產(chǎn)生的問題流動相中所使用的不同溶劑必須互溶流動相中所使用的不同溶劑必須互溶流動相中溶劑不互溶會導(dǎo)致流動相中溶劑不互溶會導(dǎo)致:1. 基線漂移，基線漂移

13、，2. 保留時(shí)間的重現(xiàn)性差，保留時(shí)間的重現(xiàn)性差，3. 出現(xiàn)肩峰和出現(xiàn)肩峰和“鬼峰鬼峰”的問題的問題.改變保留時(shí)間和峰面積改變保留時(shí)間和峰面積 流動相中形成氣泡對液流的不良影響流動相中形成氣泡對液流的不良影響 泵中形成氣泡使液流波動泵中形成氣泡使液流波動峰變形峰變形 柱中氣泡形成和累積使流動相繞流柱中氣泡形成和累積使流動相繞流尖峰或鋸齒狀噪聲尖峰或鋸齒狀噪聲 檢測池中氣泡形成和累積產(chǎn)生基線噪聲檢測池中氣泡形成和累積產(chǎn)生基線噪聲液 相 色 譜 分 析實(shí)驗(yàn)室常備的流動相和固定相實(shí)驗(yàn)室常備的流動相和固定相 為滿足液相色譜的方法選擇，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該常備以下的流動相和固定相（1）流動相：甲醇、乙腈、純水、四氫

14、呋喃、正己烷二氯甲烷， 這些溶劑基本上能滿足90以上的液相色譜分離問題。（2）固定相：C18鍵合相柱、硅膠柱、氰基柱合氨基柱。幾點(diǎn)注意事項(xiàng)幾點(diǎn)注意事項(xiàng) 色譜柱和流動相確定以后，為想獲得滿意的色譜分離，可進(jìn)一步選擇柱長、填料粒度和流速等。需要指出的是某些樣品在進(jìn)樣前要進(jìn)行很完全的樣品預(yù)處理，另外，許多樣品則需要梯度洗脫，當(dāng)色譜條件有所改變時(shí)，需要尋找更合適的分離條件。液 相 色 譜 儀 的 使 用流動相及儲液器流動相及儲液器1.盡量使用HPLC級的溶劑與試劑.2.最好使用專用的溶劑瓶來放置流動相3.改變流動相時(shí)防止交叉污染.4.不要使用陳舊的流動相.5.定期清洗流動相儲液瓶.6.定期清洗燒結(jié)不銹

15、鋼吸濾頭.液 相 色 譜 儀 的 使 用對流動相的要求對流動相的要求 由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是： （1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。 （2）溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時(shí)，溶劑對此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測量。液 相 色 譜 儀 的 使 用對流動相的要求對流動相的要求 （3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對

16、流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加501OOnm。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。（5）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離. 液 相 色 譜 儀 的 使 用常用流動相的紫外截止波長常用流動相的紫外截止波長液 相 色 譜 儀 的 使 用常用流動相的強(qiáng)度參數(shù)常用流動相的強(qiáng)度參數(shù)1. 使用流動相溶解樣品使用流動相溶解樣品 - 減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時(shí)減少溶劑

17、峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時(shí)由為重要由為重要 - 保證樣品在流動相中的溶解度，避免樣品保證樣品在流動相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀 2. 進(jìn)樣前最好使用進(jìn)樣前最好使用0.45um 的膜進(jìn)行過濾的膜進(jìn)行過濾 如果樣品很臟，要使用如果樣品很臟，要使用0.2um的膜進(jìn)行過濾的膜進(jìn)行過濾1- 1-低壓計(jì)量泵低壓計(jì)量泵; ;1A,1B-1A,1B-時(shí)間比例電磁時(shí)間比例電磁閥閥; ;2- 2-微處理機(jī)微處理機(jī); ;3- 3-混合器混合器; ;4- 4-高壓輸液泵高壓輸液泵; ;5- 5-至色譜柱至色譜柱6- 6-反饋控制器反饋控制器; ;7- 7-混合室混合室;

18、 ;8- 8-流量計(jì)信號流量計(jì)信號; ;9- 9-混合溶劑出口混合溶劑出口高高壓壓梯梯度度低低壓壓梯梯度度1- 1-程序控制器程序控制器; ;2- 2-溶劑溶劑A;A;3- 3-溶劑溶劑B;B;4- 4-高壓泵高壓泵A;A;5- 5-高壓泵高壓泵B;B;恒流泵中氣泡的排除恒流泵中氣泡的排除打開放空閥，按儀器前面板的打開放空閥，按儀器前面板的“沖洗沖洗”功能鍵，功能鍵，用大流量溶劑沖洗系統(tǒng)直到流出的液體連續(xù)，用大流量溶劑沖洗系統(tǒng)直到流出的液體連續(xù)，證明氣泡已經(jīng)排除；證明氣泡已經(jīng)排除；如果用如果用”沖洗沖洗”狀態(tài)仍不能吸液，可以用吸耳球狀態(tài)仍不能吸液，可以用吸耳球或注射器在排液口抽吸，直至液體流出

19、；或注射器在排液口抽吸，直至液體流出；如果仍然無液體流出，可能是閥球閥座粘連，取如果仍然無液體流出，可能是閥球閥座粘連，取出單向閥，向單向閥兩端分別吹氣，一通一堵出單向閥，向單向閥兩端分別吹氣，一通一堵為正常，兩端均堵說明閥球座粘連，需清洗閥為正常，兩端均堵說明閥球座粘連，需清洗閥球閥座球閥座。液 相 色 譜 儀 的 使 用高壓輸液泵高壓輸液泵1.每次使用后要把泵中的含鹽緩沖液洗干凈，防止 鹽的沉積，泵要浸在無緩沖液的溶液或有機(jī)溶劑 中。2.使用HPLC級的流動相試劑.3.使用不銹鋼燒結(jié)吸液濾頭.4.用純水或雙蒸蒸餾水，流量35ml/分，沖洗15分 鐘，沖洗時(shí)必須打開排放閥（逆時(shí)針擰松）必須做

20、!使用輸液泵的注意事項(xiàng)使用輸液泵的注意事項(xiàng)液 相 色 譜 儀 的 使 用操作極限預(yù)防操作極限預(yù)防1.嚴(yán)禁在無流動相時(shí)啟動高壓輸液泵. 2.設(shè)定泵的上限壓力(25Mpa)防止長期壓力過高損壞泵和進(jìn)樣閥.3.設(shè)定泵的下限壓力(0.51Mpa)防止流動相抽干和嚴(yán)重泄漏.輸液泵發(fā)生故障及相應(yīng)排除措施故障故障 可能原因可能原因 解決辦法解決辦法 無流動相流出，無流動相流出，又無壓力指示又無壓力指示泵內(nèi)有大量氣體泵內(nèi)有大量氣體打開泄壓閥，以較大流打開泄壓閥，以較大流量（量（5 5mL/min)mL/min)運(yùn)轉(zhuǎn)，運(yùn)轉(zhuǎn)，密封圈損壞密封圈損壞更換更換壓力和流量不穩(wěn)壓力和流量不穩(wěn)有氣泡有氣泡打開泄壓閥，以較大流

21、打開泄壓閥，以較大流量（量（5 5mL/min)mL/min)運(yùn)轉(zhuǎn)，運(yùn)轉(zhuǎn)，單向閥內(nèi)單向閥內(nèi)有異物有異物稀硝酸超聲清洗稀硝酸超聲清洗壓力高壓力高 堵堵壓力低壓力低漏漏液 相 色 譜 儀 的 使 用 自動進(jìn)樣器 手動進(jìn)樣器 原理：六通閥 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入進(jìn)樣器進(jìn)樣器樣品裝填狀態(tài) (LOAD)手動進(jìn)樣器原理圖142356注射口接輸液泵接色譜柱多余樣品排放142356接輸液泵接色譜柱注射狀態(tài)(INJECT)液 相 色 譜 儀 的 使 用高壓進(jìn)樣閥高壓進(jìn)樣閥必須做必須做! !每次使用后要沖洗干凈進(jìn)樣閥中殘留的樣品和緩沖鹽.防止無機(jī)鹽沉積和樣品微粒磨損閥轉(zhuǎn)子.沖洗方法見進(jìn)樣閥說明書.

22、嚴(yán)禁用嚴(yán)禁用! !嚴(yán)禁使用氣相色譜那樣的尖頭針進(jìn)樣.根據(jù)情況定根據(jù)情況定在注射針前加裝針式過濾器,防止樣品中的微粒進(jìn)入進(jìn)樣閥.手動一般的方法一般的方法 1.在進(jìn)樣狀態(tài)下清洗針口在進(jìn)樣狀態(tài)下清洗針口 2.在裝填狀態(tài)下插入微量注射器在裝填狀態(tài)下插入微量注射器 3.注入樣品注入樣品 4.切到進(jìn)樣狀態(tài)切到進(jìn)樣狀態(tài)便捷的方法（不需清洗）便捷的方法（不需清洗） 1.進(jìn)樣狀態(tài)下插入微量注射器進(jìn)樣狀態(tài)下插入微量注射器 2.切到裝填狀態(tài)切到裝填狀態(tài) 3.注入樣品注入樣品 4.切回到進(jìn)樣狀態(tài)切回到進(jìn)樣狀態(tài)高效液相色譜檢測器高效液相色譜檢測器 紫外檢測器紫外檢測器 折光指數(shù)檢測器折光指數(shù)檢測器 電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器

23、 熒光檢測器熒光檢測器 蒸發(fā)激光檢測器蒸發(fā)激光檢測器檢測器的保養(yǎng)檢測器的保養(yǎng)u紫外燈的保養(yǎng)：分析前，柱平衡差不多時(shí)，打開紫外燈的保養(yǎng)：分析前，柱平衡差不多時(shí)，打開檢測器；在分析完閉后，先關(guān)紫外燈。（頻繁的檢測器；在分析完閉后，先關(guān)紫外燈。（頻繁的開關(guān)燈會縮短燈的使用壽命）開關(guān)燈會縮短燈的使用壽命）u樣品池要保養(yǎng)樣品池要保養(yǎng)1）用）用HPLC級溶劑級溶劑2）過濾流動相和溶劑）過濾流動相和溶劑3）脫氣）脫氣4）不讓水或腐蝕性溶劑滯留泵中）不讓水或腐蝕性溶劑滯留泵中液 相 色 譜 儀 的 使 用紫外檢測器紫外檢測器每次做每次做1.流過池每次使用后連同色譜柱一起清洗. 2.使用脫過氣的流動相,防止氣泡

24、卡在流過池內(nèi).經(jīng)常做經(jīng)常做3.不定期的用強(qiáng)溶劑反向沖洗流動池(拆開柱子).4.不定期的使用空流動池校正波長.根據(jù)情況定根據(jù)情況定5.在流動池出口加裝背壓閥.液相色譜儀使用中的問題預(yù)柱與保護(hù)柱預(yù)柱與保護(hù)柱從泵來的流動相預(yù)柱進(jìn)樣器保護(hù)柱分析柱到檢測器預(yù)柱對流動相而言保護(hù)柱對色譜柱而言液相色譜儀使用中的問題良好的柱使用規(guī)范良好的柱使用規(guī)范在使用前過濾溶劑完全潤濕在運(yùn)輸中變干的色譜柱了解溶劑對樣品的溶解性及對分離的影響對含有保留性較強(qiáng)的雜質(zhì)組份的樣品進(jìn)行預(yù)處理注意柱子的pH使用范圍定期用強(qiáng)極性的溶劑清洗色譜柱儲存色譜柱時(shí)要沖盡緩沖液,并用有機(jī)溶劑飽和柱子避免外力損傷色譜柱,如彎曲、跌落等液相色譜儀使用

25、中的問題使用保護(hù)柱使用保護(hù)柱帶整體過濾片的Techtron 保護(hù)柱液 相 色 譜 儀 的 使 用液相色譜柱液相色譜柱1.流動相或溶劑的化學(xué)腐蝕性不能太強(qiáng).2.避免樣品微粒在柱頭沉積.3.防止過高壓力沖擊色譜柱.4.流動相pH大于7時(shí)要使用保護(hù)柱.5.正確制備樣品,在樣品注射器前加裝針式過濾器.6.色譜柱不用卸下前: a.必須洗去緩沖液. b.防止產(chǎn)生微生物 c.用大于10%的有機(jī)溶劑充滿整個(gè)色譜柱. d.柱卸下后用柱堵頭將色譜柱首尾密封.液 相 色 譜 儀 的 使 用 分析結(jié)果重現(xiàn)性好 提高柱效 降低柱壓 保證檢測穩(wěn)定性 柱溫控制的優(yōu)點(diǎn)：使用柱溫箱使用柱溫箱液 相 色 譜 儀 的 使 用整臺液

26、相色譜儀的維護(hù)整臺液相色譜儀的維護(hù)1.在使用過含鹽緩沖液后必須清水沖洗泵15分鐘，此時(shí)必須打開排放閥，不能使廢液進(jìn)入色譜柱。2.關(guān)上排放閥，用90%+10%的水、甲醇溶液沖洗整個(gè)系統(tǒng)，時(shí)間為1520分鐘，流量1ml/分。本步驟主要是沖洗干凈系統(tǒng)內(nèi)其他含鹽的部位。3.用純的強(qiáng)溶劑沖洗整個(gè)系統(tǒng)，時(shí)間為1小時(shí)，流量為1ml/分。本步驟主要是保護(hù)色譜柱。4.如果未使用緩沖液，上面1、2兩步驟可免去，直接用純的強(qiáng)溶劑沖洗整個(gè)系統(tǒng)，時(shí)間為1小時(shí)，流量為1ml/分。每次用過儀器后必須做每次用過儀器后必須做! !HPLC的日常操作條件的日常操作條件u最好是恒溫、恒濕最好是恒溫、恒濕 溫度：溫度：1530 相對

27、濕度相對濕度80%u房間應(yīng)有良好的通風(fēng)房間應(yīng)有良好的通風(fēng)u空調(diào)或其他設(shè)備產(chǎn)生的氣流不要直吹儀器空調(diào)或其他設(shè)備產(chǎn)生的氣流不要直吹儀器u避免光線直射避免光線直射u遠(yuǎn)離高電干擾、高振動設(shè)備遠(yuǎn)離高電干擾、高振動設(shè)備液 相 色 譜 分 析 分析型液相色譜分析型液相色譜定性及定量分析 a.靈敏度的要求 b.樣品的復(fù)雜性 c.樣品量的要求 d.精度及準(zhǔn)確度的要求 e.容易使用液 相 色 譜 分 析 制備型液相色譜制備型液相色譜分離及純化 a.化合物的穩(wěn)定性 b.樣品的復(fù)雜性 c.制備量的要求 d.純度的要求及純度的鑒定 e.方法的安全性液 相 色 譜 分 析0.0100200300400510152025m

28、Vt0tR1tR2tR3tR4tR5Q：需要什么樣的分離結(jié)果？A：分辨率高。液 相 色 譜 分 析W1W2tR1tR2什么是色譜的什么是色譜的分辨率分辨率？分辨率R的公式：)(122112WWttRRR液 相 色 譜 分 析影響分辨率的因素：影響分辨率的因素：kk，N N分辨率的方程：411NaaKKRk是容量因子，表達(dá)了樣品與填料的作用強(qiáng)弱。是選擇性系數(shù)，描述兩化合物分離的好壞程度， 是化學(xué)因素。N是理論塔板數(shù)，描述色譜峰的譜帶展寬程度。液 相 色 譜 分 析V1Wh/2色譜柱的柱效色譜柱的柱效N N理論塔板數(shù)計(jì)算公式：2h/2Wt54. 5RN液 相 色 譜 分 析提高柱效的方法提高柱效的

29、方法色譜柱本身減小填料的顆粒度找到最佳的流速（根據(jù)不同的內(nèi)徑）合適的溫度降低溶劑的粘度增加柱長液 相 色 譜 分 析其他影響柱效的因素其他影響柱效的因素柱外效應(yīng)連接管路進(jìn)樣器檢測器進(jìn)樣體積樣品濃度液 相 色 譜 分 析容量因子容量因子KKK12345510152025510152025510152025K峰高R與峰高的關(guān)系 與R的關(guān)系) 1/(KKR改變K值的方法：調(diào)節(jié)流動相的極性、pH、離子強(qiáng)度等梯度淋洗k=(tR-t0)/ t0液 相 色 譜 分 析選擇性系數(shù)選擇性系數(shù)定義：120102kkttttaRR1時(shí)兩組分分不開，aaR1改變的途徑：改變流動相改變固定相改變溫度改變樣品的本身性質(zhì)液

30、 相 色 譜 分 析、KK、N N 如何控制分辨率如何控制分辨率 原始分離狀態(tài)改變 K 后改變 后改變 N 后液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例等度分析等度分析色譜柱：C18，4mm30mm流動相：乙腈/水，不同的溶劑強(qiáng)度，60/40、50/50、40/60，由強(qiáng)漸弱流速：2ml/min.樣品： 對羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 對羥基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 對羥基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例改變?nèi)萘恳蜃?K60/4050/5040/60液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例改變選擇性a 通過

31、改變流動相改變選擇性 同樣強(qiáng)度的不同溶劑 改變色譜柱123THF/H2O 28:72MeOH/H2O 58:42CH3CN/H2O 38:62液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例梯度方法的建立 梯度洗脫的特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)單位時(shí)間的分離能力增加檢測靈敏度提高 缺點(diǎn)儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測方式柱需再生定量分析的重復(fù)性較低分析時(shí)間長液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例梯度的洗脫方式 高壓梯度及低壓梯度溶劑 A溶劑 B泵 A泵 B混合器A 高壓梯度溶劑 A泵溶劑 B比例閥（溶劑混合點(diǎn)）混合器B 低壓梯度（溶劑混合點(diǎn)）液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例梯度洗脫的可變參數(shù) A及B(可能還

32、有C和D液)的成分和化學(xué)特性 梯度的陡度 梯度的變化形狀124356789 10 11液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例如不用梯度：分離不理想液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例梯度條件的優(yōu)化液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例梯度曲線的變化 凹線液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例梯度曲線的變化 凸線液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例梯度平衡時(shí)間的影響（一）10分鐘的梯度，6分鐘的平衡時(shí)間色譜圖不重復(fù)液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例梯度平衡時(shí)間的影響（二）平衡時(shí)間6分鐘平衡時(shí)間7分鐘平衡時(shí)間8分鐘平衡時(shí)間9分鐘平衡時(shí)間從6到7分鐘，第一個(gè)峰的保留時(shí)

33、間有明顯的變化，說明6到7分鐘的平衡時(shí)間不足，而8到9分鐘變化不大因而大于這個(gè)時(shí)間時(shí)，平衡充足。液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例有機(jī)污染物的影響（一）50ml超純水的有機(jī)物污染狀態(tài)液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例有機(jī)污染物的影響（二）“三蒸水”有大量的有機(jī)污染物不適合梯度分析液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例有機(jī)污染物的影響（三）典型的“實(shí)驗(yàn)室水”有大量的有機(jī)污染物不適合高靈敏度梯度分析液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例梯度方法開發(fā)實(shí)例 - 第一步 開發(fā)一個(gè)有9個(gè)烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的條件下(0-100% 水-乙腈)，分離不理想。整個(gè)

34、色譜峰組保留時(shí)間太長，分離度也不好液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例梯度方法開發(fā)實(shí)例 - 第二步為使色譜峰前移，提高起始時(shí)乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分離得到改善。但是9個(gè)化合物出了10個(gè)色譜峰，說明有雜質(zhì)存在，很可能是流動相水中的。液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例梯度方法開發(fā)實(shí)例 - 第三步 從空白梯度圖顯示，在同樣的色譜條件，同樣的檢測靈敏度下，共有兩個(gè)雜質(zhì)峰。說明流動相水中的雜質(zhì)在此條件下可能會對檢測有影響。液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例梯度方法開發(fā)實(shí)例 - 第四步 空白梯度圖同樣品的色譜圖進(jìn)行對照后，我們看到雜質(zhì)（共兩個(gè)峰）中的第一個(gè)小峰對第8

35、個(gè)色譜峰有干擾，會使其定量分析結(jié)果不準(zhǔn)確。液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例梯度方法開發(fā)實(shí)例 - 第五步 根據(jù)“梯度曲線下的面積越大，洗脫能力越強(qiáng)”的規(guī)律，試用#5曲線使3-9號峰提前(曲線5，50-100%B)，但是小峰仍沒有分出來。液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例梯度方法開發(fā)實(shí)例 - 第六步 根據(jù)“梯度曲線下的面積越大，洗脫能力越強(qiáng)”的規(guī)律，試用#5曲線使3-9號峰提前，改用50-95%B見到好的現(xiàn)象。液 相 色 譜 分 析 分析方法建立的實(shí)例梯度方法開發(fā)實(shí)例 - 第七步最后用50-90%B，曲線4，得到好的結(jié)果。液 相 色 譜 分 析液相色譜的檢測模式液相色譜的檢測模式

36、靈敏度、選擇性、適應(yīng)能力液 相 色 譜 分 析開發(fā)液相色譜分析方法開發(fā)液相色譜分析方法分辨率是色譜分析中主要考慮的因素。在開發(fā)色譜方法時(shí)，有很多因素是很重要的。除分辨率 之外，以下因素都要考慮。 1.靈敏度 5.成本 2.載樣量 6.容易使用 3.分析速度 7.色譜柱壽命 4.溶劑消耗 8.效率液 相 色 譜 分 析液相色譜分析方法的建立液相色譜分析方法的建立1建立液相色譜分析方法通常有以下幾步：（1）分子量在樣品預(yù)處理或GPC分析時(shí)有用（2）選擇合適的液相色譜方法（正相、反相或其他）；（3）選擇合適的色譜柱；（4）溶解度選擇流動相的條件（5）官能團(tuán)有否離子化基團(tuán)？保留特性如何？（6）樣品的基

37、質(zhì)考慮是否要前處理，如何前處理液 相 色 譜 分 析液相色譜分析方法的建立液相色譜分析方法的建立2續(xù)前一頁（7）選擇合適的K值的條件；（8）選擇良好的峰位（值）；（9）選擇良好的色譜柱條件（N值）；（10）檢測特性是否有紫外吸收？熒光？（11）用實(shí)測樣品解決出現(xiàn)的特殊問題；（12）證實(shí)方法的正確性。液 相 色 譜 分 析選擇液相色譜的方法選擇液相色譜的方法主主 要要 液液 相相 色色 譜譜 方方 法法 特特 性性液 相 色 譜 分 析選擇液相色譜的方法選擇液相色譜的方法次 要 液 相 色 譜 方 法 特 性液 相 色 譜 分 析液相色譜的保留液相色譜的保留保留時(shí)間tR的初步估計(jì)：保留時(shí)間tR

38、死時(shí)間t0(1+峰容量因子k）峰的容量因子k（保留時(shí)間tR死時(shí)間t0）/死時(shí)間t0t00.5Ld2 左式中： t0進(jìn)樣峰的出峰時(shí)間tR= t0(1+ k) tR峰的保留時(shí)間 L柱長(cm)k=(tR-t0)/ t0 d柱內(nèi)徑(cm) k峰的容量因子 液 相 色 譜 分 析反相色譜不同配比流動相與容量因子值反相色譜不同配比流動相與容量因子值甲醇/水乙腈/水四氫呋喃/水峰容量因子值0/1000/1000/10010010/906/944/964020/8012/8810/901630/7022/7817/83640/6032/6823/772.550/5040/6030/70160/4050/50

39、37/630.470/3060/4045/550.280/2073/2753/470.0690/1086/1463/370.03100/0100/072/280.01液 相 色 譜 分 析溶溶 劑劑 強(qiáng)強(qiáng) 度度 改變流動相的組成或溶劑的強(qiáng)度，就可以改變K和tR。在一定的條件下，減少保留時(shí)間或縮短分析時(shí)間的溶劑（小tR和K值）為強(qiáng)溶劑，增加或延長分析時(shí)間的溶劑（大tR和K值）為弱溶劑。例如，在反相色譜中，水是弱溶劑。在甲醇/水為流動相的系統(tǒng)中增加甲醇的比例，流動相變強(qiáng)。 液相色譜的溶劑由弱到強(qiáng)排列的順序?yàn)椋赫和椤⒙确?、二氯甲烷、甲基叔丁醚、乙醚、四氫呋喃、乙酸乙酯、乙腈、丙醇、甲醇?在反相色

40、譜中有機(jī)溶劑增加10左右，tR和K值要減少2-3倍。液 相 色 譜 分 析峰峰 位位 的的 重重 排排在分析多組分樣品時(shí)，僅改變流動相的強(qiáng)度（組成百分比）而不改變其組成，一般僅僅改變所有組分的tR，不會發(fā)生峰位重排。在反相色譜中，下列條件改變可能發(fā)生峰位重排：（1）流動相中換了強(qiáng)溶劑種類；（2）pH值的改變；（3）柱填料的改變；（4）柱溫的改變；（5）流動相組成的改變（如加入離子對試劑三乙基胺等）液 相 色 譜 分 析液相色譜壓力計(jì)算液相色譜壓力計(jì)算222/1200/250ppcdLFeddLFeP（0.46內(nèi)徑柱）式中 L柱長 流動相粘度 F流速，mL/min dc柱內(nèi)徑，cm dp柱填料直

41、徑，m 反相色譜常用流動相的粘度值（mPas）（25）有機(jī)溶劑/水（體積比）甲醇乙腈四氫呋喃0/1000.890.890.8920/801.40.981.2240/601.620.891.3860/401.540.721.2180/201.120.520.85100/00.560.350.46下表紅線框內(nèi)的數(shù)字即為該溶液與水混合后的粘度（在25時(shí)） 即噪音高或噪音高或基線漂移基線漂移解決問題解決問題可能原因可能原因柱子沒有平衡好柱子沒有平衡好雜質(zhì)組分從色譜柱中緩慢流出雜質(zhì)組分從色譜柱中緩慢流出雜質(zhì)在柱子中的富集雜質(zhì)在柱子中的富集檢測器或色譜柱的溫度差異檢測器或色譜柱的溫度差異系統(tǒng)有氣泡系統(tǒng)有氣

42、泡檢測器氘燈需更換檢測器氘燈需更換電壓不穩(wěn)造成干擾電壓不穩(wěn)造成干擾解決辦法解決辦法繼續(xù)沖洗色譜柱至平衡繼續(xù)沖洗色譜柱至平衡利用強(qiáng)極性的溶劑沖洗色譜柱利用強(qiáng)極性的溶劑沖洗色譜柱沖洗色譜柱；提高樣品的預(yù)處理；沖洗色譜柱；提高樣品的預(yù)處理；使用色譜純的溶劑使用色譜純的溶劑使用色譜柱恒溫箱使用色譜柱恒溫箱流動相脫氣；流動相脫氣；更換氘燈更換氘燈使用穩(wěn)壓電源；檢查供電系統(tǒng)使用穩(wěn)壓電源；檢查供電系統(tǒng)出現(xiàn)出現(xiàn)“鬼鬼峰峰”解決問題解決問題可能原因可能原因上一針樣品中沒有上一針樣品中沒有完全流出的物質(zhì)完全流出的物質(zhì)色譜柱被污染色譜柱被污染溶劑中有雜質(zhì)溶劑中有雜質(zhì)流動相和溶解樣品流動相和溶解樣品的溶劑不互溶的溶劑

43、不互溶解決辦法解決辦法待樣品中的組分盡可能完全流出后才進(jìn)下一個(gè)待樣品中的組分盡可能完全流出后才進(jìn)下一個(gè)樣品；每運(yùn)行完一個(gè)樣品后用強(qiáng)極性的溶劑沖樣品；每運(yùn)行完一個(gè)樣品后用強(qiáng)極性的溶劑沖洗色譜柱；改進(jìn)樣品的預(yù)處理洗色譜柱；改進(jìn)樣品的預(yù)處理每運(yùn)行完一個(gè)樣品后用強(qiáng)極性的溶劑沖每運(yùn)行完一個(gè)樣品后用強(qiáng)極性的溶劑沖色譜柱；改進(jìn)樣品的預(yù)處理色譜柱；改進(jìn)樣品的預(yù)處理使用色譜純的溶劑使用色譜純的溶劑盡量用流動相溶解樣品；盡量用流動相溶解樣品；出現(xiàn)肩峰或出現(xiàn)肩峰或前延峰前延峰解決問題解決問題可能原因可能原因柱頭柱頭“塌陷塌陷”造成死體積造成死體積溶解樣品的溶劑選擇錯(cuò)誤溶解樣品的溶劑選擇錯(cuò)誤干擾物質(zhì)的存在；干擾物質(zhì)的

44、存在；樣品中的雜質(zhì)樣品中的雜質(zhì)色譜柱過載色譜柱過載柱外效應(yīng)的影響柱外效應(yīng)的影響解決辦法解決辦法更換色譜柱更換色譜柱用流動相溶解樣品用流動相溶解樣品改進(jìn)樣品預(yù)處理；改進(jìn)樣品預(yù)處理；使用色譜純?nèi)軇┦褂蒙V純?nèi)軇悠废♂寣悠废♂寵z查管路連接檢查管路連接峰形展寬峰形展寬解決問題解決問題解決辦法解決辦法更換色譜柱或預(yù)柱更換色譜柱或預(yù)柱減少進(jìn)樣體積；稀釋樣品減少進(jìn)樣體積；稀釋樣品用流動相溶解樣品用流動相溶解樣品檢查管路連接檢查管路連接檢查是否有漏；使用小的檢查是否有漏；使用小的檢測池檢測池提高色譜柱溫度提高色譜柱溫度更換色譜柱更換色譜柱可能原因可能原因色譜柱或預(yù)柱被污染或不合適色譜柱或預(yù)柱被污染或不合

45、適色譜柱色譜柱“過載過載”或進(jìn)樣體積過大或進(jìn)樣體積過大溶解樣品的溶劑選用不當(dāng)溶解樣品的溶劑選用不當(dāng)柱外效應(yīng)的影響柱外效應(yīng)的影響色譜柱和檢測器之間有漏；色譜柱和檢測器之間有漏；檢測器的檢測池過大檢測器的檢測池過大色譜柱溫度太低；色譜柱溫度太低；流動相的黏度太高流動相的黏度太高色譜柱柱效下降色譜柱柱效下降出現(xiàn)脫尾峰出現(xiàn)脫尾峰解決問題解決問題解解決辦法決辦法減少樣品體積；減少樣品體積；改進(jìn)樣品預(yù)處理；改進(jìn)樣品預(yù)處理；調(diào)節(jié)流動相的組成；調(diào)節(jié)流動相的組成；使用流動相改性劑（如三乙胺）；使用流動相改性劑（如三乙胺）；降低流動相的降低流動相的pHpH值；值；使用堿性去活的色譜柱使用堿性去活的色譜柱更換濾網(wǎng)；

46、使用柱前過濾系統(tǒng)；更換濾網(wǎng)；使用柱前過濾系統(tǒng)；將樣品過濾將樣品過濾檢查管路連接檢查管路連接更換色譜柱；更換色譜柱；可能原因可能原因色譜柱過載色譜柱過載干擾峰；雜質(zhì)干擾峰；雜質(zhì)硅膠表面未完全鍵合的硅膠表面未完全鍵合的硅羥基的影響硅羥基的影響色譜柱的濾網(wǎng)堵塞色譜柱的濾網(wǎng)堵塞柱外效應(yīng)的影響；柱外效應(yīng)的影響；死體積死體積色譜柱有色譜柱有“塌陷塌陷”、短流或斷流、短流或斷流出現(xiàn)雙重峰或出現(xiàn)雙重峰或分叉峰分叉峰解決問題解決問題可能原因可能原因樣品體積過大；樣品體積過大；色譜柱過載色譜柱過載溶解樣品的溶劑選用溶解樣品的溶劑選用不當(dāng)不當(dāng)色譜柱有色譜柱有“塌陷塌陷”、短流或斷流短流或斷流色譜柱濾網(wǎng)堵塞色譜柱濾網(wǎng)

47、堵塞進(jìn)樣器沒有徹底清洗進(jìn)樣器沒有徹底清洗解決辦法解決辦法減少進(jìn)樣體積；減少進(jìn)樣體積；稀釋樣品；稀釋樣品；將樣品在流動相中溶解將樣品在流動相中溶解更換色譜柱；更換色譜柱；使用較溫和的分離條件使用較溫和的分離條件更換色譜柱的濾網(wǎng)；更換色譜柱的濾網(wǎng)；使用柱前過濾裝置；使用柱前過濾裝置；過濾樣品過濾樣品徹底清洗進(jìn)樣器；徹底清洗進(jìn)樣器；更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子保留時(shí)間變長保留時(shí)間變長解決問題解決問題可能原因可能原因流速降低流速降低硅膠表面有活性點(diǎn)硅膠表面有活性點(diǎn)鍵合相流失鍵合相流失流動相的組成有變化流動相的組成有變化溫度降低溫度降低解決辦法解決辦法檢查系統(tǒng)是否有漏；檢查系統(tǒng)是否有漏；更換泵的密封圈；更換泵的密封圈；排凈氣泡；排凈氣泡；使用流動相改性劑（如加入三乙胺）；使用流動相改性劑（如加入三乙胺）；使用堿性去活的色譜柱使用堿性去活的色譜柱保持流動相保持流動相pHpH值在值在2-7.5 2-7.5 范圍內(nèi)范圍內(nèi)檢查泵；檢查濾網(wǎng)；檢查泵；檢查濾網(wǎng)；防止流動相的揮發(fā)或降解防止流動相的揮發(fā)或降解使用色譜柱恒溫箱使用色譜柱恒溫箱保留時(shí)間縮短保留時(shí)間縮短解決問題解決問題可能原因可能原因流速升高流速升高色譜柱過載色譜柱過載鍵合相流失鍵合相流