第四章蛋白質(zhì)的化學修飾

1、第第 4 章章化學修飾的原理化學修飾的原理化學修飾的方法學化學修飾的方法學蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)親和標記親和標記蛋白質(zhì)化學修飾的應(yīng)用蛋白質(zhì)化學修飾的應(yīng)用內(nèi)內(nèi) 容容 提提 要要化學修飾：凡通過化學基團的引入或除去，而使蛋白質(zhì)化學修飾：凡通過化學基團的引入或除去，而使蛋白質(zhì)共價結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的現(xiàn)象。共價結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的現(xiàn)象。選擇性化學修飾：肽鏈側(cè)鏈基團被化學試劑專一性地修飾。選擇性化學修飾：肽鏈側(cè)鏈基團被化學試劑專一性地修飾。第一節(jié)第一節(jié) 化學修飾的原理化學修飾的原理影響因素影響因素蛋白質(zhì)功能蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性基的反應(yīng)性修飾劑的修飾劑的反應(yīng)性反應(yīng)性一、影響蛋

2、白質(zhì)功能基反應(yīng)性的各因素一、影響蛋白質(zhì)功能基反應(yīng)性的各因素因為大多數(shù)蛋白質(zhì)分子是（親水的表面，疏水的核），所以因為大多數(shù)蛋白質(zhì)分子是（親水的表面，疏水的核），所以pk值值和影響和影響pk值的因素應(yīng)特別關(guān)注。值的因素應(yīng)特別關(guān)注。（一）微區(qū)的極性（一）微區(qū)的極性微區(qū)的極性是決定基團解微區(qū)的極性是決定基團解離狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。離狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。醋酸的醋酸的pk值值在水中為在水中為4.76在在80%乙醇中為乙醇中為6.87在在100%乙醇中為乙醇中為10.32微區(qū)的極性與介質(zhì)的介電常數(shù)有關(guān)。微區(qū)的極性與介質(zhì)的介電常數(shù)有關(guān)。（二）氫鍵效應(yīng)（二）氫鍵效應(yīng)天然蛋白質(zhì)或它的離子通過氫鍵來維持其穩(wěn)定性，也

3、天然蛋白質(zhì)或它的離子通過氫鍵來維持其穩(wěn)定性，也是使是使pk值發(fā)生改變的一個因素值發(fā)生改變的一個因素（三）靜電效應(yīng)（三）靜電效應(yīng)研究表明，不同蛋白質(zhì)中的組氨酸殘基的研究表明，不同蛋白質(zhì)中的組氨酸殘基的pk值是不同值是不同的，原因是由于帶電基團相互影響所致。的，原因是由于帶電基團相互影響所致。局部極性局部極性的變化的變化對色、甲硫、胱氨酸反應(yīng)性影響最小對色、甲硫、胱氨酸反應(yīng)性影響最小對酪、半胱氨酸、羧基反應(yīng)性影響最大對酪、半胱氨酸、羧基反應(yīng)性影響最大對氨基和組氨酸反應(yīng)性影響較大對氨基和組氨酸反應(yīng)性影響較大例如：例如：2-氟酚的氟酚的pk值比值比2-溴酚的溴酚的pk值高值高0.7pH單位，原因是氟單

4、位，原因是氟與酚形成氫鍵的能力比溴強。與酚形成氫鍵的能力比溴強。OHCOHOOHFOHBr水楊酸水楊酸碳酸酐酶：碳酸酐酶： 5.91； 6.04； 7.00； 7.23葡萄球菌核酸酶：葡萄球菌核酸酶： 5.37； 5.71； 5.74； 6.50（四）位阻效應(yīng)（四）位阻效應(yīng)如果烷基在空間上緊靠功能基，修飾劑不易與功能基反如果烷基在空間上緊靠功能基，修飾劑不易與功能基反應(yīng)，出現(xiàn)位阻效應(yīng)。應(yīng)，出現(xiàn)位阻效應(yīng)。影響蛋白質(zhì)中可電離氨基酸側(cè)鏈的影響蛋白質(zhì)中可電離氨基酸側(cè)鏈的pkpk值的因素，也是影響側(cè)鏈基值的因素，也是影響側(cè)鏈基團反應(yīng)性的重要因素。蛋白質(zhì)中個別功能基所處的微區(qū)不同，反團反應(yīng)性的重要因素。蛋

5、白質(zhì)中個別功能基所處的微區(qū)不同，反應(yīng)性也不同，個別功能基的反應(yīng)性可通過競爭標記法來測定。應(yīng)性也不同，個別功能基的反應(yīng)性可通過競爭標記法來測定。二、蛋白質(zhì)功能基的超反應(yīng)性二、蛋白質(zhì)功能基的超反應(yīng)性例如：碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有例如：碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4個組氨酸殘基，其個組氨酸殘基，其pk值是：值是：影響功能基影響功能基pk值值基團之間的功能障礙基團之間的功能障礙影響功能基反影響功能基反應(yīng)性的因素應(yīng)性的因素多數(shù)蛋白質(zhì)的功能基與簡單氨基酸中的同樣基團相比，反應(yīng)性多數(shù)蛋白質(zhì)的功能基與簡單氨基酸中的同樣基團相比，反應(yīng)性要差。但是，每個蛋白質(zhì)分子中至少有一個基團對一定的試劑要差。但是，每個蛋

6、白質(zhì)分子中至少有一個基團對一定的試劑顯示出超反應(yīng)性。顯示出超反應(yīng)性。影響超反應(yīng)性的因素：影響超反應(yīng)性的因素：1.1.改變蛋白質(zhì)功能基的改變蛋白質(zhì)功能基的pk值；值；2.2.蛋白質(zhì)功能基具有較大的親核性；蛋白質(zhì)功能基具有較大的親核性；3.3.通過靜電相互作用吸引試劑，并使其有適當取向；通過靜電相互作用吸引試劑，并使其有適當取向；4.4.試劑與靠近修飾部位的蛋白質(zhì)區(qū)域之間的立體化學適應(yīng)性；試劑與靠近修飾部位的蛋白質(zhì)區(qū)域之間的立體化學適應(yīng)性；5.5.試劑的結(jié)合。試劑的結(jié)合。超反應(yīng)性可由上述一個或幾個因素的綜合作用而產(chǎn)生。超反應(yīng)性可由上述一個或幾個因素的綜合作用而產(chǎn)生。超反應(yīng)性：蛋白質(zhì)的某個側(cè)鏈基團與

7、個別試劑能發(fā)生非常超反應(yīng)性：蛋白質(zhì)的某個側(cè)鏈基團與個別試劑能發(fā)生非常迅速的反應(yīng)。迅速的反應(yīng)。三、修飾劑反應(yīng)性的決定因素三、修飾劑反應(yīng)性的決定因素蛋白質(zhì)的構(gòu)象和表面特性對氨基酸側(cè)鏈的反應(yīng)性有影響，同樣，蛋白質(zhì)的構(gòu)象和表面特性對氨基酸側(cè)鏈的反應(yīng)性有影響，同樣，它們也可能對接近功能基的修飾劑產(chǎn)生有利或不利的影響。它們也可能對接近功能基的修飾劑產(chǎn)生有利或不利的影響。木瓜蛋白酶中的木瓜蛋白酶中的19個酪氨酸殘基，個酪氨酸殘基，只有一個能與修飾劑反應(yīng)，修飾只有一個能與修飾劑反應(yīng)，修飾后酶活性并不改變，說明什麼？后酶活性并不改變，說明什麼？（一）選擇吸附（一）選擇吸附化學修飾前，修飾劑根據(jù)各自的特點，選擇性

8、地吸附在低或高極化學修飾前，修飾劑根據(jù)各自的特點，選擇性地吸附在低或高極性區(qū)，根據(jù)對速度的飽和效應(yīng)，可檢測出蛋白質(zhì)性區(qū)，根據(jù)對速度的飽和效應(yīng)，可檢測出蛋白質(zhì)-修飾劑復合物修飾劑復合物的形成。的形成。（二）靜電相互作用（二）靜電相互作用帶電的修飾劑能被選擇性地吸引到蛋白質(zhì)表面帶相反電荷的部帶電的修飾劑能被選擇性地吸引到蛋白質(zhì)表面帶相反電荷的部位。位。靜電排斥力能抑制修飾作用。靜電排斥力能抑制修飾作用。（三）位阻因素（三）位阻因素蛋白質(zhì)表面的位阻因素，或者底物、輔助因子、抑制劑所產(chǎn)生蛋白質(zhì)表面的位阻因素，或者底物、輔助因子、抑制劑所產(chǎn)生的位阻因素都可能阻止修飾劑與功能基的正常反應(yīng)。的位阻因素都可能

9、阻止修飾劑與功能基的正常反應(yīng)。D-氨基酸氧化酶的巰基與氨基酸氧化酶的巰基與N-烷基馬來酰亞胺的反應(yīng)，巰基的辛烷基馬來酰亞胺的反應(yīng)，巰基的辛基化速度比乙基化速度快基化速度比乙基化速度快15倍。倍。核糖核酸酶第核糖核酸酶第12號組氨酸烷化號組氨酸烷化-溴代丁酸反應(yīng)很快；溴代丁酸反應(yīng)很快；-溴代戊酸反應(yīng)很慢；溴代戊酸反應(yīng)很慢；-溴代己酸不能反應(yīng)。溴代己酸不能反應(yīng)。（四）催化因素（四）催化因素修飾部位附近的其它功能基，如果起一般的酸堿催化作用，也修飾部位附近的其它功能基，如果起一般的酸堿催化作用，也能影響修飾反應(yīng)。不同的修飾劑，反應(yīng)速度和反應(yīng)部位有明顯能影響修飾反應(yīng)。不同的修飾劑，反應(yīng)速度和反應(yīng)部位有

10、明顯差異。差異。（五）局部環(huán)境的極性（五）局部環(huán)境的極性溶劑效應(yīng)是復雜的。有些有機反應(yīng)的速度與溶劑的極性有關(guān)，有溶劑效應(yīng)是復雜的。有些有機反應(yīng)的速度與溶劑的極性有關(guān)，有些反應(yīng)則與極性無關(guān)。些反應(yīng)則與極性無關(guān)。反反 應(yīng)應(yīng) 類類 型型降低極性對速度的影響降低極性對速度的影響RSR+ICH2CONH2R2S+CH2CONH2I-溶劑極性對反應(yīng)速度的影響溶劑極性對反應(yīng)速度的影響適當降低或大大降低適當降低或大大降低沒有影響沒有影響沒有影響沒有影響適當增加或大大增加適當增加或大大增加RSR+H2O2R2SO+H2ORS-+ICH2CONH2RSCH2CONH2+I-RNH3+OCN- RNHCONH2胰凝

11、乳蛋白酶活性中胰凝乳蛋白酶活性中心絲氨酸的乙?；慕z氨酸的乙?；趸揭宜猁}反應(yīng)強硝基苯乙酸鹽反應(yīng)強苯乙酸鹽反應(yīng)弱苯乙酸鹽反應(yīng)弱疏水環(huán)境疏水環(huán)境阻止產(chǎn)物中電荷分離的反應(yīng)阻止產(chǎn)物中電荷分離的反應(yīng)加速電荷中和的反應(yīng)加速電荷中和的反應(yīng)第二節(jié)第二節(jié) 化學修飾的方法學化學修飾的方法學一、修飾反應(yīng)專一性的控制一、修飾反應(yīng)專一性的控制（一）試劑的選擇（一）試劑的選擇選擇試劑在很大程度上要依據(jù)修飾目的。選擇試劑在很大程度上要依據(jù)修飾目的。反應(yīng)類型反應(yīng)類型反應(yīng)類型反應(yīng)類型對于沒有電荷分離和電荷只是從一個離子轉(zhuǎn)移到另一個離子的反對于沒有電荷分離和電荷只是從一個離子轉(zhuǎn)移到另一個離子的反應(yīng)，則介質(zhì)的極性不重要。應(yīng)，則

12、介質(zhì)的極性不重要。對氨基對氨基的修飾的修飾修飾所有氨基，而不修飾其它基團修飾所有氨基，而不修飾其它基團;僅修飾僅修飾-氨基；氨基；修飾暴露的或反應(yīng)性高的氨基，以及修飾暴露的或反應(yīng)性高的氨基，以及修飾有催化活性的氨基等。修飾有催化活性的氨基等。修飾的部位和程度一般可用選擇適當?shù)脑噭┖头磻?yīng)條件修飾的部位和程度一般可用選擇適當?shù)脑噭┖头磻?yīng)條件來控制。來控制。選擇蛋白質(zhì)修選擇蛋白質(zhì)修飾劑要考慮：飾劑要考慮：修飾反應(yīng)要完成到什么程度；修飾反應(yīng)要完成到什么程度；對個別氨基酸殘基是否專一；對個別氨基酸殘基是否專一；在反應(yīng)條件下，修飾反應(yīng)有沒有限度；在反應(yīng)條件下，修飾反應(yīng)有沒有限度；修飾后蛋白質(zhì)的構(gòu)象是否基本

13、保持不變；修飾后蛋白質(zhì)的構(gòu)象是否基本保持不變；是否需要分離修飾后的衍生物；是否需要分離修飾后的衍生物；反應(yīng)是否需要可逆；反應(yīng)是否需要可逆；是否適合于建立快速、方便的分析方法。是否適合于建立快速、方便的分析方法。如果修飾的目的是改變蛋白質(zhì)的帶電狀況或溶解性，如果修飾的目的是改變蛋白質(zhì)的帶電狀況或溶解性，必須選擇能引入最大電荷量的試劑。必須選擇能引入最大電荷量的試劑。如果要修飾的蛋白質(zhì)對有機溶劑不穩(wěn)定，必須在水介質(zhì)如果要修飾的蛋白質(zhì)對有機溶劑不穩(wěn)定，必須在水介質(zhì)中反應(yīng)，則應(yīng)選擇在水中有一定溶解性的試劑。中反應(yīng)，則應(yīng)選擇在水中有一定溶解性的試劑。還必須考慮，反應(yīng)生成物容易進行定量測定；試劑的還必須考

14、慮，反應(yīng)生成物容易進行定量測定；試劑的體積小一些為宜。體積小一些為宜。用于修飾酶活性部位的氨基酸殘基的試劑應(yīng)具備的特用于修飾酶活性部位的氨基酸殘基的試劑應(yīng)具備的特征：征：選擇性地與一個氨基酸殘基反應(yīng)；選擇性地與一個氨基酸殘基反應(yīng)；反應(yīng)在酶蛋白不變性的條件下進行；反應(yīng)在酶蛋白不變性的條件下進行；標記的殘基在肽中穩(wěn)定，很易通過降解分離出來進行鑒定；標記的殘基在肽中穩(wěn)定，很易通過降解分離出來進行鑒定；反應(yīng)的程度能用簡單的方法測定。反應(yīng)的程度能用簡單的方法測定。（二）反應(yīng)條件的選擇（二）反應(yīng)條件的選擇條件條件不造成蛋白質(zhì)不造成蛋白質(zhì)的不可逆變性的不可逆變性有利于專一性有利于專一性修飾蛋白質(zhì)修飾蛋白質(zhì)（

15、三）反應(yīng)的專一性（三）反應(yīng)的專一性若修飾劑專一性較差，除控制反應(yīng)條件外，可利用其它途徑實若修飾劑專一性較差，除控制反應(yīng)條件外，可利用其它途徑實現(xiàn)修飾的專一性?，F(xiàn)修飾的專一性。1.利用蛋白質(zhì)分子中，某些基團的特殊活性蛋白質(zhì)，特利用蛋白質(zhì)分子中，某些基團的特殊活性蛋白質(zhì)，特殊的空間結(jié)構(gòu)，能影響某些基團的活性殊的空間結(jié)構(gòu)，能影響某些基團的活性位置專一性：在蛋白質(zhì)分子中特別活潑的基團，在適當條件下位置專一性：在蛋白質(zhì)分子中特別活潑的基團，在適當條件下只是其本身發(fā)生作用，而其它基團皆不作用。只是其本身發(fā)生作用，而其它基團皆不作用。2.選擇不同的反應(yīng)選擇不同的反應(yīng)pH蛋白質(zhì)分子中各功能基的解離常數(shù)是不同的

16、，所以控制不同的蛋白質(zhì)分子中各功能基的解離常數(shù)是不同的，所以控制不同的反應(yīng)反應(yīng)pH，也就控制了各功能基的解離程度，從而有利于修飾的，也就控制了各功能基的解離程度，從而有利于修飾的專一性。專一性。碘乙酸對蛋白質(zhì)進行修飾，試劑可與半胱氨酸、甲硫氨酸、組碘乙酸對蛋白質(zhì)進行修飾，試劑可與半胱氨酸、甲硫氨酸、組氨酸的側(cè)鏈及氨酸的側(cè)鏈及-氨基、氨基、-氨基發(fā)生作用。氨基發(fā)生作用。當反應(yīng)當反應(yīng)pH=6時，只專一地與組氨酸的咪唑基作用。時，只專一地與組氨酸的咪唑基作用。當反應(yīng)當反應(yīng)pH=3時，只專一地與時，只專一地與甲硫甲硫氨酸的氨酸的側(cè)鏈側(cè)鏈作用。作用。在酸性在酸性pH下，比較活潑的巰基和氨基，以帶質(zhì)子形式

17、存在，下，比較活潑的巰基和氨基，以帶質(zhì)子形式存在，變成不活潑狀態(tài)。變成不活潑狀態(tài)。ICH2COO-+蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)SHpH7蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)S CH2COO-+H+I-ICH2COO-+蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)SCH3pH2蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)S CH2COO-+I-CH3ICH2COO-+蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)NH2pH8.5蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)NHCH2COO-+H+I-ICH2COO-NHN+蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)pH5.5NCH2COO-N蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)+H+I-3.利用某些產(chǎn)物的不穩(wěn)定性利用某些產(chǎn)物的不穩(wěn)定性在高在高pH下，氰酸、二硫化碳等可把氨基轉(zhuǎn)變成脲和脲的衍生下，氰酸、二硫化碳等可把氨基轉(zhuǎn)變成脲和脲的衍生物。但因物。但因pH高，巰基

18、與試劑反應(yīng)的產(chǎn)物迅速被分解。高，巰基與試劑反應(yīng)的產(chǎn)物迅速被分解。4.親和標記親和標記親和標記試劑除了能與蛋白質(zhì)作用外，還要求試劑的結(jié)構(gòu)和與蛋親和標記試劑除了能與蛋白質(zhì)作用外，還要求試劑的結(jié)構(gòu)和與蛋白質(zhì)作用的底物或抑制劑相似。白質(zhì)作用的底物或抑制劑相似。5.差別標記差別標記在底物或抑制劑存在下進行化學修飾時，由于它們保護著蛋白在底物或抑制劑存在下進行化學修飾時，由于它們保護著蛋白質(zhì)的活性部位基團，使這些基團不能與試劑作用。然后將過量質(zhì)的活性部位基團，使這些基團不能與試劑作用。然后將過量的底物或抑制劑除去，所得到的部分修飾的蛋白質(zhì)再與含同位的底物或抑制劑除去，所得到的部分修飾的蛋白質(zhì)再與含同位素標

19、記的同樣試劑作用，結(jié)果只有原來被底物或抑制劑保護的素標記的同樣試劑作用，結(jié)果只有原來被底物或抑制劑保護的基團是帶放射性同位素標記的?；鶊F是帶放射性同位素標記的。6.利用蛋白質(zhì)狀態(tài)的差異利用蛋白質(zhì)狀態(tài)的差異在結(jié)晶狀態(tài)下進行反應(yīng)，可以提高修飾的專一性。在結(jié)晶狀態(tài)下進行反應(yīng)，可以提高修飾的專一性。二、修飾程度和修飾部位的測定二、修飾程度和修飾部位的測定最常使用的是間接法。最常使用的是間接法。三、化學修飾結(jié)果的解釋三、化學修飾結(jié)果的解釋（一）蛋白質(zhì)功能改變的解釋（一）蛋白質(zhì)功能改變的解釋在確證試劑已經(jīng)作用于蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上，除驗證修飾蛋白質(zhì)在在確證試劑已經(jīng)作用于蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上，除驗證修飾蛋白質(zhì)在溶液中的

20、構(gòu)象是否發(fā)生變化外，還要證明修飾作用是否發(fā)生在溶液中的構(gòu)象是否發(fā)生變化外，還要證明修飾作用是否發(fā)生在活性部位上?；钚圆课簧稀３Ｓ梅椒ǎ撼Ｓ梅椒ǎ?.如果修飾發(fā)生在活性部位或必需基團上，則蛋白質(zhì)活性的如果修飾發(fā)生在活性部位或必需基團上，則蛋白質(zhì)活性的喪失于修飾程度一定成某種化學計量關(guān)系，而且底物必然能喪失于修飾程度一定成某種化學計量關(guān)系，而且底物必然能降低修飾蛋白質(zhì)的失活程度，而與活性部位不能結(jié)合的分子降低修飾蛋白質(zhì)的失活程度，而與活性部位不能結(jié)合的分子則沒有這種影響。則沒有這種影響。2.當采用可逆保護試劑時，修飾失活的蛋白質(zhì)隨保護基的去除當采用可逆保護試劑時，修飾失活的蛋白質(zhì)隨保護基的去除可重

21、新恢復活力，而且恢復程度應(yīng)與保護基去除量成一定比例可重新恢復活力，而且恢復程度應(yīng)與保護基去除量成一定比例關(guān)系。關(guān)系。修飾劑也可修飾遠離活性部位的氨基酸，使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改修飾劑也可修飾遠離活性部位的氨基酸，使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，造成蛋白質(zhì)活力喪失。引入帶電或龐大基團時易出現(xiàn)這種變，造成蛋白質(zhì)活力喪失。引入帶電或龐大基團時易出現(xiàn)這種情況。情況。(二）修飾殘基的不穩(wěn)定性二）修飾殘基的不穩(wěn)定性原始修飾以后，還可能發(fā)生共價改變。原始修飾以后，還可能發(fā)生共價改變。如?；D(zhuǎn)移、巰基轉(zhuǎn)移、鹵素轉(zhuǎn)移及二硫交換過程可能自發(fā)地如?；D(zhuǎn)移、巰基轉(zhuǎn)移、鹵素轉(zhuǎn)移及二硫交換過程可能自發(fā)地或在純化、降解過程中發(fā)生?；蛟诩兓?/p>

22、、降解過程中發(fā)生。（三）沒有被發(fā)現(xiàn)的修飾（三）沒有被發(fā)現(xiàn)的修飾咪唑基、巰基、羧基等在反應(yīng)條件下不穩(wěn)定或在以后的純化咪唑基、巰基、羧基等在反應(yīng)條件下不穩(wěn)定或在以后的純化中被水解，因而檢測不出。中被水解，因而檢測不出。有些修飾反應(yīng)不能檢測出來，是由于它們在蛋白質(zhì)化學中不有些修飾反應(yīng)不能檢測出來，是由于它們在蛋白質(zhì)化學中不占優(yōu)勢。占優(yōu)勢。第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾一、氨基的修飾一、氨基的修飾氨基氨基修飾修飾引入正電荷的修飾引入正電荷的修飾引入負電荷的修飾引入負電荷的修飾電荷消失的修飾電荷消失的修飾（一）引入正電荷的修飾（一）引入正電荷的修飾下列試劑修飾賴氨酸后，可在賴氨酸側(cè)鏈上留

23、下可電離的帶正下列試劑修飾賴氨酸后，可在賴氨酸側(cè)鏈上留下可電離的帶正電基團。電基團。1.還原烷基化還原烷基化ENZNH2 + RHCO-H2O+H2OENZN=CHRENZNHCH2RH希夫堿希夫堿所用的醛有不同所用的醛有不同R基基醛醛2.用甲基乙亞酰胺脒化用甲基乙亞酰胺脒化H2NROC RENZNH2 CRNH2 ENZNH R OH+pH8.5（二）消除電荷的修飾（二）消除電荷的修飾這類試劑可抑制賴氨酸的這類試劑可抑制賴氨酸的-NH2的質(zhì)子化，使形成的衍生物不帶的質(zhì)子化，使形成的衍生物不帶電。電。ENZNH2 1.乙?；阴；疧CCCH3CH3OOpH7+C CH3OENZNHCH3COO

24、-+H+2.甲氨?；饔眉装滨；饔肊NZNH2 + HNCOpH=7COENZNHNH2+ HNCO+ H2OENZS-副反應(yīng)：副反應(yīng)：CONH2ENZS+ OH-pH68甲基乙亞酰胺甲基乙亞酰胺醋酸酐醋酸酐氰酸鹽氰酸鹽巰基巰基優(yōu)點是氰酸鹽優(yōu)點是氰酸鹽離子體積小離子體積小ENZO-+ HNCO+ H2OpH5COOENZNH2+ OH-COENZO-+ HNCO+ H2OpH=5CCOOENZNH2+ OH-OENZ+ HNCONHNpH=8CENZNH2ONHN3.芳基化芳基化三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBS）與氨基作用，產(chǎn)生三硝基苯衍生物，反）與氨基作用，產(chǎn)生三硝基苯衍生物，反應(yīng)產(chǎn)物為黃色。應(yīng)產(chǎn)物為黃色。 TNBS也能與巰基作用。也能與巰基作用。SO3HNO2NO2NO2NH2R+pH7+H+NHR + SO3HNO2NO2NO2酚基酚基羧基羧基咪唑基咪唑基TNBS（黃色）（黃色）