_基因工程復(fù)習(xí)重點(diǎn)

1、基因工程期末復(fù)習(xí)第一章：基因工程1. 定義：通過(guò)基因操作來(lái)定向改變或修飾生物體或人類自身，并具有明確應(yīng)用目的的活動(dòng)稱為基因工程。2. 基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟：基因克隆的通用策略 ：涉及的過(guò)程可用分/合成、切、連、轉(zhuǎn)、選、鑒。從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過(guò)酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段；在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子；將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（寄主細(xì)胞），并與之一起增殖；從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了細(xì)胞重組DNA分子的受體細(xì)胞克??； 從篩選出來(lái)的受體細(xì)胞克隆，提取出已

2、經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用； 將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。 3.三大元件：載體、質(zhì)粒、片段。第二章：分子克隆工具酶1、工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、DNA修飾酶、核酸外切酶、單鏈核酸內(nèi)切酶。2、限制性內(nèi)切酶：是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸內(nèi)切酶。三種（型酶、型酶、 型酶）3、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護(hù)宿主 DNA 不被相應(yīng)的限制酶所切割。三種（）4、回文結(jié)構(gòu)：雙鏈DNA中含有的二個(gè)結(jié)構(gòu)相同、方

3、向相反的序列稱為反向重復(fù)序列，每條單鏈以任一方向閱讀時(shí)都是一樣的。5、同裂酶（isoschizomers)：指來(lái)源不同但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶可能進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的敏感性不同。6、同尾酶（isocaudamer）：指來(lái)源不同、識(shí)別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大。7、影響核酸內(nèi)切酶活性的因素：DNA濃度DNA的甲基化程度酶切消化反應(yīng)的溫度（大多數(shù)酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度37度）DNA的分子結(jié)構(gòu)。星星活性：在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱為星星活性（star act

4、ivity)。8、4連接酶：該酶常從4噬菌體的受感細(xì)胞中提取，是由4噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶是4連接酶。9、影響連接酶作用的因素反應(yīng)溫度：連接缺口的溫度：37；連接粘性末端的最佳溫度： 415 。4DNA連接酶的用量：平末端DNA分子的連接反應(yīng)中，最適12個(gè)單位。粘性末端DNA片斷之間的連接，酶濃度0.1個(gè)單位。ATP的用量10mol1mmol/L之間。提高外源片斷與載體的濃度的比值，（1020倍）。10、常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法。11、DNA聚合酶：DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具備模板、引物、dNTP等的情況下）及其相輔的活性

5、。依賴于DNA的DNA聚合酶： DNA聚合酶(全酶)；DNA聚合酶大片段 (klenow片段)；耐熱DNA聚合酶(Taq 酶)；依賴于RNA的DNA聚合酶：反轉(zhuǎn)錄酶。12、DNA聚合酶活性：三種酶活性5 3DNA聚合酶活性5 335 核酸外切酶活性。13、逆轉(zhuǎn)錄酶：以單鏈RNA為模板合成雙鏈DNA的反應(yīng)。5 3合成DNA，無(wú)35外切活性。第三章 分子克隆載體1、載體：將外源DNA或基因攜帶入宿主細(xì)胞(host cell)的工具。（克隆載體、表達(dá)載體）來(lái)源：質(zhì)粒載體、噬菌體載體、人工染色體載體、病毒載體。二 .質(zhì)粒：染色體外的遺傳因子，能自我復(fù)制，多數(shù)為雙鏈閉環(huán)DNA，大小1KB-200KB外源

6、DNA如超過(guò)10kb，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和DNA得率都非常低。三大特性：自我復(fù)制、克隆位點(diǎn)、篩選標(biāo)記（其他如易分離純化，具有啟動(dòng)子）1、能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。 2、要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn) multiple cloning sites ，MCS）。 3、有適合的標(biāo)記，易于選擇。 表達(dá)性質(zhì)粒載體：按特殊設(shè)計(jì)構(gòu)建的，能使克隆在其中特定位點(diǎn)的外源真核基因的編碼序列，在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體。主要包括：大腸桿菌的啟動(dòng)子、及操縱位點(diǎn)序列、多克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯信號(hào)、質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)及抗菌素抗性基因。

7、1.構(gòu)型：SC型共價(jià)閉合環(huán)形DNA（ccc DNA）、OC型開(kāi)環(huán)DNA（ocDNA）、L 型線性DNA。2.質(zhì)粒DNA的復(fù)制類型：（拷貝數(shù)的多少）：嚴(yán)謹(jǐn)型、松弛型質(zhì)粒復(fù)制子拷貝數(shù)pBR322pMB115-20pUCpMB1500-700pACYCP15A10-212pSC101pSC101-5Co1E1Co1E115-203.質(zhì)粒的不相容性：在同一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，一般不能同時(shí)含有兩種同一復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒。也稱為質(zhì)粒的不相容性。是指在沒(méi)有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。質(zhì)粒的不親合性分子基礎(chǔ)，主要是由于它們?cè)趶?fù)制功能之間的相互干擾造成的。4

8、.質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移性：在天然條件下，很多天然質(zhì)粒都可以通過(guò)細(xì)菌接合作用從一種宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種宿主內(nèi)，這種轉(zhuǎn)移依賴于質(zhì)粒上的tra基因產(chǎn)物。5.改造天然質(zhì)粒方法：（1）加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個(gè)以上，易于用作選擇。（2）增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組。（3）縮短長(zhǎng)度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量。（4）改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝。（5）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件；方法就是重組。6.質(zhì)粒載體必須具備的基本條件：（1）具有復(fù)制起點(diǎn)；（replication origin）自我增值的基本條件，一般具一個(gè)復(fù)制子。（2）具有篩選標(biāo)簽；理想的質(zhì)粒載

9、體具有兩種抗菌素抗性基因。（3）具有若干限制酶切單一位點(diǎn)（MCS multiple cloning sites ）；（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。7.質(zhì)粒載體的選擇記號(hào)：抗菌素抗性（氨芐青霉素抗性基因ampr、四環(huán)素抗性基因tetr、氯霉素抗性基因Cmr、卡那霉素抗性基因kanr新霉素neor抗性基因）8.互補(bǔ)：lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)宿主和載體各自編碼的片段和片段雖然沒(méi)有酶活性，但是當(dāng)載體和宿主細(xì)胞同時(shí)表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生的片段和片段發(fā)生互補(bǔ)，可形成具有酶活性的-半乳糖苷酶，稱作互補(bǔ)這個(gè)互補(bǔ)系統(tǒng)用來(lái)監(jiān)測(cè)質(zhì)粒上有無(wú)

10、插入序列藍(lán)白斑篩選：pUC質(zhì)粒在LacZ的大腸桿菌中，在有IPTG誘導(dǎo)物和X-gal生色底物的平板培養(yǎng)中，菌落是白色的。若在該細(xì)胞中引入pUC質(zhì)粒，其上有LacZ，質(zhì)粒和大腸桿菌DNA可實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)， 表達(dá)出-半乳糖苷酶，可降解生色底物使菌落呈藍(lán)色（有活性、陰性克?。?。如果在質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)的某個(gè)酶切點(diǎn)上克隆了外源基因，則LacZ基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的-半乳糖苷酶，因此菌落呈白色（無(wú)活性、陽(yáng)性克?。?。 9.質(zhì)粒DNA的分離和純化從細(xì)菌中提取質(zhì)粒DNA的方法都包括以下三個(gè)步驟：培養(yǎng)細(xì)菌、收集和裂解細(xì)菌、純化質(zhì)粒DNA三種方法：氯化銫密度梯度離心法；堿變性法；煮沸法原理：堿

11、變性法抽提質(zhì)粒是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH12.6的高堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA都發(fā)生變性，但質(zhì)粒超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，所以當(dāng)以pH4.8的KAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中。而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。 流程：1、取1.5毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)物，加在微量離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀；2、加入100微升冰冷的懸浮液，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-H

12、Cl PH=8.0, 10mM EDTA，45mg溶菌酶）靜置5分鐘；3、加入200微升微冷的裂解液（0.2NaOH，1.0%SDS）緩緩混勻置室溫5分鐘。4、加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸鈉，振蕩后，冰浴5分鐘。5、離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒DNA。溶液：50mmol/L 葡萄糖; 25mmol/L Tris-Cl(pH8.0); 10mmol/L EDTA(pH 8.0) (主要作用：Solution I 中的EDTA可以螯合二價(jià)金屬離子進(jìn)而抑制依賴于二價(jià)金屬離子的DNA酶的活性，對(duì)DNA起到保護(hù)作用。加入solution后一定要充分打散菌體。)溶液 (pH

13、 12.6) ：0.2mol/L NaOH ;1%SDS (現(xiàn)用現(xiàn)配) (主要作用：細(xì)胞壁肽聚糖堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性. Solution II要新鮮配置,NaOH可吸收空氣中的二氧化碳而減弱堿性。加入solution II后放置時(shí)間不要超過(guò)5min，以免變性質(zhì)粒不易復(fù)性)溶液 (pH 4.8) ：100ml5mol/L NaAc 60ml; 冰醋酸 11.5ml; 雙蒸水 28.5ml (作用：中和堿液，質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白SDS, 線性DNA沉淀)三 噬菌體載體1.基本過(guò)程：吸附、注入、合成、組裝、釋放2.噬菌體載體（特有多極調(diào)控、9-23KB）DNA是一條線性雙鏈DNA分子，一

14、旦進(jìn)入宿主細(xì)胞，黏性末端互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈環(huán)狀DNA分子，這種黏性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為COS位點(diǎn)，隨后閉合充當(dāng)轉(zhuǎn)錄模板噬菌體載體的主要類型1. 插入式載體通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)允許外源DNA片段插入的載體。2. 替換型載體（取代型載體）：具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，允許外源DNA片段替換非必需DNA片段的載體。（廣泛）3.柯斯質(zhì)粒載體：是一類人工構(gòu)建的含有-DNA cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型載體，也稱為黏粒載體（45KB）特點(diǎn)：具有噬菌體特性（cos位點(diǎn)）、具有質(zhì)粒載體特性、具有高容量的克隆能力四 其他載體1.酵母載體：整合型載體（YIp）、復(fù)制型載體（YNp）、附加體型載體（YEp）2.人工染

15、色體載體（一種穿梭載體:能夠在兩類不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體）酵母人工染色體（YAC）：選擇標(biāo)記主要采用營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因，例如帶有突變赭石突變抑制基因在培養(yǎng)基上形成紅色菌落，而帶有赭石突變抑制基因SUP4則為白色細(xì)菌人工染色體（BAC）又稱F黏粒五 表達(dá)載體1.克隆基因正確表達(dá)的基本條件：最基本條件：應(yīng)該能夠進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯，以及在正常情況下還與轉(zhuǎn)譯后加工有關(guān)。重要條件：編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物應(yīng)能維持正常的穩(wěn)定性。具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)；具有克隆基因的功能（強(qiáng)）啟動(dòng)子； 插入序列的正確取向2.表達(dá)元件：?jiǎn)?dòng)子：必須是強(qiáng)啟動(dòng)子、應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平、啟動(dòng)子應(yīng)是誘導(dǎo)型的常見(jiàn)原核強(qiáng)啟動(dòng)子：

16、Plac、Ptac、PL啟動(dòng)子、T7噬菌體啟動(dòng)子Plac：受Lac阻遏蛋白負(fù)調(diào)控，受乳糖或類似物IPTG的誘導(dǎo)；Ptac: Lac啟動(dòng)子和Trp啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子。受Lac阻遏蛋白負(fù)調(diào)控，可用乳糖或類似物IPTG的誘導(dǎo)，啟動(dòng)能力比Plac和Ptrp都強(qiáng)；PL啟動(dòng)子：噬菌體早期左向轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，受噬菌體CI基因負(fù)調(diào)控。溫度誘導(dǎo)（低溫30阻遏，高溫42 誘導(dǎo)）。 T7噬菌體啟動(dòng)子：具有高度特異性，只能由T7噬菌體的RNA聚合酶識(shí)別并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄T7如何誘導(dǎo)調(diào)控的原理轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)譯起始序列轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子轉(zhuǎn)譯終止密碼子第四章：基因操作中大分子的分離和分析一 核酸凝膠電泳（用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段；

17、檢測(cè)：分子量、DNA濃度）1.基本原理：核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，呈負(fù)離子化狀態(tài)；核酸分子在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度的電場(chǎng)中，它們會(huì)向正電極方向遷移（“”-“+”）2.瓊脂糖凝膠電泳：核酸片段因其分子量或分子形狀不同，電泳移動(dòng)速度有差異而分離DNA遷移率的影響因素：DNA分子的大?。ǚ幢龋傊菨舛龋ǚ幢龋?、DNA構(gòu)象、凝膠和電泳緩沖液中的EB、電壓、瓊脂糖種類、電泳緩沖液配制：最常用1%的，稱取瓊脂糖1g，加100ml電泳緩沖液（TAE），微波爐煮沸，冷卻到50度時(shí)倒膠3、RNA膠的制備：1.5g瓊脂糖加115ml水，加熱融化。冷卻至60時(shí)加30ml的5 X MOPS電泳緩沖液 (終濃度為

18、1X); 加5ml甲醛（瓊脂糖終濃度為1%）。制膠。二 分子雜交1.定義：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下（適當(dāng)?shù)臏囟?、離子強(qiáng)度等），按堿基互補(bǔ)的原則，重新形成雙鏈核酸分子的過(guò)程2. 探針（probe）：被標(biāo)記的核酸分子，可以是DNA、RNA和合成的寡核苷酸基本原理：堿基互補(bǔ)；雜合雙鏈：DNA:RNA 、DNA:DNA；類型：液相雜交、固相雜交3.雜交的基本過(guò)程：凝膠電泳分離變性印跡轉(zhuǎn)移預(yù)雜交雜交洗膜雜交信號(hào)檢測(cè)4、Southern Blot原理：將待檢測(cè)的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，

19、固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過(guò)堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。DNA 瓊脂糖電泳 印跡轉(zhuǎn)移 預(yù)雜交雜交（變性探針） 洗膜放射自顯影或顯色5、Northern Blot原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測(cè)。mRNA提取甲醛變性電泳印跡轉(zhuǎn)移預(yù)雜交雜交（變性探針）洗膜放射自顯影或化學(xué)發(fā)光6、western 雜交基本原理同southern、northern bl

20、ot方式。但其是檢測(cè)蛋白質(zhì)，關(guān)鍵在于探針的性質(zhì)：抗體（antibody）三 PCR技術(shù)及其應(yīng)用1. 定義：是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增2.反應(yīng)體系：10擴(kuò)增緩沖液10ul、4種dNTP混合物各200umol/L、引物各10100pmol、模板DNA0.12ug、TaqDNA聚合酶2.5u、Mg2+1.5mmol/L、加雙或三蒸水至100ulTaq DNA聚合酶：水生棲熱菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶 53DNA聚合酶活性和53外切酶活性 ；無(wú)35外切酶活性

21、，3.PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)4.步驟：變性（雙鏈DNA通過(guò)高溫變性解離成互補(bǔ)單鏈DNA ）、退火（DNA加熱變性+引物慢慢冷卻使其結(jié)合）、延伸（適溫延伸53引物形成新鏈變成4條鏈DNA ）基本原理：堿基互補(bǔ)設(shè)計(jì)原則：（1）靠近5上游Primer與雙鏈DNA正鏈相同 3下游Primer與雙鏈DNA正鏈互補(bǔ)，與負(fù)鏈相同 正鏈5 3 負(fù)鏈 3 5例如：IL-3正鏈5GCTCCATGACCCAG-GCGATCTTTTGAGTCCAA 3負(fù)鏈3CGAGGTACTGGGTC-CGCTAGAAAACTCAGGTT 5 上游引物序列：與其相同 5 GCTCCATGACCCAG 3 下游引物序列：先寫(xiě)出相應(yīng)負(fù)鏈35然后倒過(guò)來(lái)53 所以序列為：5-TTG GAC TCA AAA GAT CGC -35、Sanger雙脫氧終止法F. Sanger在1977年發(fā)明用雙脫氧鏈終止法測(cè)定單鏈DNA的序列，其基本原理如下：DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；該酶能夠用2，3-雙