第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法

1、第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、光學(xué)顯微鏡一、光學(xué)顯微鏡 幾種顯微鏡觀察樣品的大小幾種顯微鏡觀察樣品的大小: :（一）普通復(fù)式光學(xué)（一）普通復(fù)式光學(xué) 顯微鏡顯微鏡 光學(xué)放大系統(tǒng)光學(xué)放大系統(tǒng) 照明系統(tǒng)照明系統(tǒng) 鏡架及樣品調(diào)節(jié)系鏡架及樣品調(diào)節(jié)系統(tǒng)統(tǒng)（一）普通復(fù)式光學(xué)（一）普通復(fù)式光學(xué) 顯微鏡顯微鏡分辨率：分辨率： ：光波長；：光波長；N N：介質(zhì)空氣：介質(zhì)空氣=1=1； ：物鏡鏡口角：物鏡鏡口角（二）相差顯微鏡（二）相差顯微鏡 通過在普通光通過在普通光學(xué)顯微鏡上增加學(xué)顯微鏡上增加“環(huán)狀光闌環(huán)狀光闌”和物和物鏡后焦面上的

2、鏡后焦面上的“相相差板差板”來調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)/ /改變改變相位差，通過光的相位差，通過光的干涉作用轉(zhuǎn)換成振干涉作用轉(zhuǎn)換成振幅差，改變光亮。幅差，改變光亮。（三）熒光顯微鏡（三）熒光顯微鏡構(gòu)造：構(gòu)造： 濾光片系統(tǒng)：濾光片系統(tǒng)： 激發(fā)濾光片激發(fā)濾光片 阻斷濾光片阻斷濾光片 專用物鏡鏡頭專用物鏡鏡頭（三）熒光顯微鏡（三）熒光顯微鏡 激發(fā)濾光片：只激發(fā)濾光片：只許特定波長光通過許特定波長光通過 阻斷濾光片：只阻斷濾光片：只許可見熒光通過。許可見熒光通過。 （四）激光掃描共焦（四）激光掃描共焦顯微鏡（顯微鏡（LSCMLSCM） 共焦：共焦：指聚光鏡與指聚光鏡與物鏡同時聚焦到樣物鏡同時聚焦到樣品的同一點上。該

3、品的同一點上。該點以外發(fā)出的熒光點以外發(fā)出的熒光被共焦板擋住。被共焦板擋住。二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡（一）電鏡的基本知識（一）電鏡的基本知識 1.1.光鏡與電鏡的基本區(qū)別光鏡與電鏡的基本區(qū)別（一）電鏡的基本知識（一）電鏡的基本知識 2.2.電鏡的基本構(gòu)造電鏡的基本構(gòu)造 電子束照明系統(tǒng)：電子束照明系統(tǒng)： 電子槍與聚光鏡電子槍與聚光鏡 成像系統(tǒng)：物鏡、成像系統(tǒng)：物鏡、 中間鏡與投影鏡中間鏡與投影鏡 真空系統(tǒng)：真空系統(tǒng)： 記錄系統(tǒng)：記錄系統(tǒng)：（二）主要電鏡制片技術(shù)（二）主要電鏡制片技術(shù)1.1.超薄切片技術(shù)超薄切片技術(shù) 切片厚度切片厚度40-50nm40-50nm固定：固定： 化學(xué)法化學(xué)法戊二醛、

4、四氧化餓（餓酸）戊二醛、四氧化餓（餓酸） 物理法物理法超低溫冷凍超低溫冷凍（二）主要電鏡制片技術(shù)（二）主要電鏡制片技術(shù)1.1.超薄切片技術(shù)超薄切片技術(shù) 切片厚度切片厚度40-50nm40-50nm 固定：固定： 包埋：包埋：用環(huán)氧樹脂。包埋前樣品要脫水用環(huán)氧樹脂。包埋前樣品要脫水 切片：切片：玻璃刀（常用）或石英刀玻璃刀（常用）或石英刀 染色：染色：金屬鹽染色。電子束在通過樣品金屬鹽染色。電子束在通過樣品 時，金屬離子不同程度地散射或時，金屬離子不同程度地散射或 吸收電子，在樣品上形成明暗差別。吸收電子，在樣品上形成明暗差別。（二）主要電鏡制片技術(shù)（二）主要電鏡制片技術(shù) 超薄切片樣本制備過程超

5、薄切片樣本制備過程2.2.冷凍蝕刻技術(shù)冷凍蝕刻技術(shù)過程：過程： 冰凍斷裂冰凍斷裂 蝕刻復(fù)型蝕刻復(fù)型用途：用途：主要用來觀察主要用來觀察 膜斷裂面上的膜斷裂面上的 蛋白質(zhì)顆粒和蛋白質(zhì)顆粒和 膜表面形貌特膜表面形貌特 征。征。2.2.冷凍蝕刻技術(shù)冷凍蝕刻技術(shù)過程：冰凍斷裂過程：冰凍斷裂 蝕刻復(fù)型蝕刻復(fù)型用途：主要用來觀察用途：主要用來觀察 膜斷裂面上的膜斷裂面上的 蛋白質(zhì)顆粒和蛋白質(zhì)顆粒和 膜表面形貌特膜表面形貌特 征。征。第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞及其組分的分析方法細(xì)胞及其組分的分析方法一、超離心技術(shù)分離細(xì)胞組分一、超離心技術(shù)分離細(xì)胞組分 制備勻漿制備勻漿: :采用低滲勻漿、超聲波粉碎或研采用低滲勻漿、

6、超聲波粉碎或研磨的方法可使細(xì)胞膜破損，形成細(xì)胞核、磨的方法可使細(xì)胞膜破損，形成細(xì)胞核、線粒體、葉綠體等細(xì)胞器和細(xì)胞組分的混線粒體、葉綠體等細(xì)胞器和細(xì)胞組分的混合物勻漿。合物勻漿。 差速離心差速離心: :使各種細(xì)胞組分和顆粒都分離開。使各種細(xì)胞組分和顆粒都分離開。更細(xì)的組分分離可采用梯度密度離心。更細(xì)的組分分離可采用梯度密度離心。差速離心差速離心密度梯度離心密度梯度離心二、細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法二、細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法 顯色劑與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)上特定基團(tuán)特異顯色劑與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)上特定基團(tuán)特異性結(jié)合產(chǎn)生特異性顏色來分析該物質(zhì)在細(xì)性結(jié)合產(chǎn)生特異性顏色來分析該物質(zhì)在細(xì)胞的分布與數(shù)量。胞的分布與數(shù)量。

7、如：如： DNADNA上脫氧核糖的醛基與希夫試劑反應(yīng)上脫氧核糖的醛基與希夫試劑反應(yīng)生成紫紅色以顯示生成紫紅色以顯示DNADNA； 餓酸與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不飽和脂肪酸反應(yīng)呈現(xiàn)餓酸與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不飽和脂肪酸反應(yīng)呈現(xiàn)黑色；黑色； 氮汞試劑與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的酪氨酸殘基氮汞試劑與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的酪氨酸殘基反紅色沉淀反紅色沉淀。三、特異蛋白抗原的定位與定性三、特異蛋白抗原的定位與定性 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子定位技術(shù)：細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子定位技術(shù)： 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù) 免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)三、特異蛋白抗原的定位與定性三、特異蛋白抗原的定位與定性（一）免疫熒光技術(shù)（一）免疫熒光技術(shù) 亦稱亦稱熒光抗體技術(shù)熒光抗體技術(shù)。將免疫學(xué)

8、方法（抗。將免疫學(xué)方法（抗原原- -抗體特異結(jié)合）與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合抗體特異結(jié)合）與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合來研究特異蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布。來研究特異蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布。 熒光色素?zé)晒馍? (如異硫氰酸熒光黃，如異硫氰酸熒光黃，F(xiàn)ITC) )與與抗體抗體結(jié)合起來，即結(jié)合起來，即熒光抗體熒光抗體，再讓熒光抗，再讓熒光抗體與其對應(yīng)的胞內(nèi)抗原結(jié)合使之呈現(xiàn)熒光。體與其對應(yīng)的胞內(nèi)抗原結(jié)合使之呈現(xiàn)熒光。三、特異蛋白抗原的定位與定性三、特異蛋白抗原的定位與定性（一）免疫熒光技術(shù)（一）免疫熒光技術(shù) 直接免疫熒光技術(shù)、間接免疫熒光技術(shù)直接免疫熒光技術(shù)、間接免疫熒光技術(shù)1.1.直接免疫熒光技術(shù)實驗步驟直接免疫熒光

9、技術(shù)實驗步驟（1 1）熒光抗體制備）熒光抗體制備 將將10mg/ml10mg/ml的抗體溶液的抗體溶液10ml10ml裝入透析袋，裝入透析袋，將透析袋放入含將透析袋放入含0.1mg/ml FITC0.1mg/ml FITC的的pH9.4pH9.4的的碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液100ml100ml的燒杯中，的燒杯中，44磁力攪磁力攪拌拌24h24h，取出透析袋，進(jìn)行純化、鑒定。，取出透析袋，進(jìn)行純化、鑒定。 （2 2）標(biāo)本處理）標(biāo)本處理 滴加滴加0.01mol/L0.01mol/L，pH7.4pH7.4的的PBSPBS于待檢標(biāo)本于待檢標(biāo)本片上，片上，10min10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。

10、后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。 滴加適當(dāng)熒光標(biāo)記抗體稀釋液，完全覆蓋滴加適當(dāng)熒光標(biāo)記抗體稀釋液，完全覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)保溫標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)保溫30min30min左右。左右。 取出玻片用取出玻片用0.01mol/L0.01mol/L，pH7.4pH7.4的的PBSPBS沖洗沖洗后，再用后，再用PBSPBS振蕩浸泡三次（振蕩浸泡三次（3-5 min/3-5 min/次）。次）。 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。（3 3）鏡檢）鏡檢 標(biāo)本處理后，立即用熒光顯微鏡觀察。

11、標(biāo)本處理后，立即用熒光顯微鏡觀察。特異性熒光強(qiáng)度一般可用特異性熒光強(qiáng)度一般可用“+”+”表示：表示：（- -）無熒光；（）無熒光；（）極弱的可疑熒光；）極弱的可疑熒光；（+ +）熒光較弱，但清楚可見；（）熒光較弱，但清楚可見；（+）熒光明）熒光明亮；（亮；（+ -+ -+）熒光閃亮。）熒光閃亮。 待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“+”+”以上，而各種對照顯示為（以上，而各種對照顯示為（）或（）或（- -），），即可判定為陽性。即可判定為陽性。2.間接免疫熒光技術(shù)實驗步驟間接免疫熒光技術(shù)實驗步驟、同同直接法直接法取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使取出玻片，用濾紙吸去多余

12、水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。記的抗人球蛋白抗體。將玻片在搪瓷盒內(nèi)再于將玻片在搪瓷盒內(nèi)再于37保溫保溫30min。重復(fù)操作重復(fù)操作。同同直接法直接法鏡檢，結(jié)果判定同接法。鏡檢，結(jié)果判定同接法。（二）免疫電鏡技術(shù)（二）免疫電鏡技術(shù) 免疫鐵蛋白技術(shù)免疫鐵蛋白技術(shù) 免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù) 免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù) 實驗步驟類似免疫熒光技術(shù)：實驗步驟類似免疫熒光技術(shù)：標(biāo)本標(biāo)本固定、包埋、切片、免疫標(biāo)記、染色固定、包埋、切片、免疫標(biāo)記、染色等等免疫膠體金電鏡技術(shù)的基本原理與應(yīng)用免疫膠體金電鏡技術(shù)的基本原理與應(yīng)用示膀胱上皮細(xì)胞

13、膜蛋白示膀胱上皮細(xì)胞膜蛋白四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性 原位雜交技術(shù)原位雜交技術(shù) 用標(biāo)記的核酸探針通過分子雜交確定用標(biāo)記的核酸探針通過分子雜交確定特異核苷酸序列在染色體或在細(xì)胞中的位特異核苷酸序列在染色體或在細(xì)胞中的位置的方法稱為置的方法稱為原位雜交。原位雜交。原位雜交技術(shù)顯原位雜交技術(shù)顯示示Z13Z13基因在受精基因在受精后后1 1天的斑馬魚胚天的斑馬魚胚胎的體節(jié)、眼和胎的體節(jié)、眼和松果體中的表達(dá)松果體中的表達(dá)五、定量細(xì)胞化學(xué)分析五、定量細(xì)胞化學(xué)分析 與細(xì)胞分選技術(shù)與細(xì)胞分選技術(shù) 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程一、細(xì)胞培

14、養(yǎng)一、細(xì)胞培養(yǎng) 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) 動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng) 植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)（一）動物細(xì)胞培養(yǎng)（一）動物細(xì)胞培養(yǎng) 定義：定義： 動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是從動物體內(nèi)取出動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是從動物體內(nèi)取出細(xì)胞或者組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在細(xì)胞或者組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或者組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功細(xì)胞或者組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。能的一門技術(shù)。 動物細(xì)胞培養(yǎng)是動物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)動物細(xì)胞培養(yǎng)是動物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)（一）動物細(xì)胞培養(yǎng)（一）動物細(xì)胞培養(yǎng) 特征：特征： 1. 1. 倍增

15、時間長，生長緩慢倍增時間長，生長緩慢 2. 2.培養(yǎng)中需氧量少，對攪拌敏感培養(yǎng)中需氧量少，對攪拌敏感 3. 3.多以聚集體存在（多以聚集體存在（貼壁生長貼壁生長） 4.4.原代細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)5050代即開始退化代即開始退化 5. 5.培養(yǎng)基要求有動物體液（如培養(yǎng)基要求有動物體液（如小牛血清小牛血清）（一）動物細(xì)胞培養(yǎng)（一）動物細(xì)胞培養(yǎng) 操作步驟：操作步驟： 1. 1. 剪切：剪切：組織剪成組織剪成 2-3mm2-3mm3 3碎塊碎塊 、HanksHanks液清洗、青鏈霉素殺菌液清洗、青鏈霉素殺菌30-60min30-60min 2.2.消化：消化：用用30-5030-50倍組織體積的倍組

16、織體積的0.25%0.25%胰胰蛋白酶溶液于蛋白酶溶液于3737C C水浴消化水浴消化 3.3.鏡檢鏡檢：rpm500-1000rpm500-1000、5min5min；檢查細(xì)胞；檢查細(xì)胞單層單層覆蓋瓶底覆蓋瓶底4.4.培養(yǎng)：培養(yǎng)：向無菌合成向無菌合成培養(yǎng)基上接種消化后的培養(yǎng)基上接種消化后的 單層細(xì)胞，于單層細(xì)胞，于3737C C溫箱或溫箱或CO2CO2培養(yǎng)培養(yǎng) 箱（瓶塞用透氣無菌棉塞）中培養(yǎng)。箱（瓶塞用透氣無菌棉塞）中培養(yǎng)。5.5.監(jiān)控：監(jiān)控：1-21-2天后（細(xì)胞形態(tài)、培養(yǎng)液天后（細(xì)胞形態(tài)、培養(yǎng)液PHPH值）值） （正常呈桃紅色，（正常呈桃紅色，PH7.2-7.4PH7.2-7.4；若發(fā)；

17、若發(fā) 黃，說明偏酸，更換培養(yǎng)液）黃，說明偏酸，更換培養(yǎng)液）（一）動物細(xì)胞培養(yǎng)（一）動物細(xì)胞培養(yǎng)（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)（二）植物細(xì)胞培養(yǎng) 植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng) 植物器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體植物器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體 等外植體材料無菌條件下培養(yǎng)在人工培等外植體材料無菌條件下培養(yǎng)在人工培 養(yǎng)基上，在適當(dāng)條件下誘發(fā)長成完整植養(yǎng)基上，在適當(dāng)條件下誘發(fā)長成完整植 株的一種技術(shù)。株的一種技術(shù)。 植物細(xì)胞培養(yǎng)：植物細(xì)胞培養(yǎng)： 單倍體細(xì)胞培養(yǎng)單倍體細(xì)胞培養(yǎng) 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)離體的植物離體的植物器官、組織器官、組織或細(xì)胞或細(xì)胞 (外植體外植體)愈愈傷傷組組織織根根芽芽植植物物體體脫分化脫分化再分化再

18、分化植物組織植物組織/ /細(xì)胞培養(yǎng)的基本過程細(xì)胞培養(yǎng)的基本過程（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)植物組織植物組織/ /細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作程序細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作程序培養(yǎng)材料（全能細(xì)胞）采集培養(yǎng)材料（全能細(xì)胞）采集 受精卵、分生組織細(xì)胞、配子和單倍受精卵、分生組織細(xì)胞、配子和單倍體細(xì)胞體細(xì)胞培養(yǎng)材料（組織塊）的消毒培養(yǎng)材料（組織塊）的消毒 材料洗凈、瀝干、切成小塊材料洗凈、瀝干、切成小塊 70%70%酒精酒精或或-10-10H H2 2O O2 2浸泡浸泡30-60s30-60s（無菌）（無菌） 消毒消毒10min10min（飽和漂白粉液或（飽和漂白粉液或0.01%HgCl0.01%HgCl2

19、2） 無菌水沖洗干凈無菌水沖洗干凈(3-4(3-4次次) )制備外植體制備外植體 將消毒材料按培養(yǎng)要求進(jìn)行處理將消毒材料按培養(yǎng)要求進(jìn)行處理 如：切成如：切成0.2-0.5cm0.2-0.5cm厚的小塊厚的小塊( (片片););去去除芽的鱗片、嫩枝的外皮、種皮胚乳等。但除芽的鱗片、嫩枝的外皮、種皮胚乳等。但葉片不需剝皮葉片不需剝皮接種與培養(yǎng)接種與培養(yǎng)接種：接種：外植體植入培養(yǎng)基上（外植體植入培養(yǎng)基上（4-104-10個個/ /瓶）瓶）封口：封口：培養(yǎng)瓶、管等用無菌材料密封培養(yǎng)瓶、管等用無菌材料密封愈傷組織培養(yǎng)：愈傷組織培養(yǎng)：外植體膨大形成愈傷組織外植體膨大形成愈傷組織增殖：增殖：繼代培養(yǎng)與分化培

20、養(yǎng)。繼代培養(yǎng)與分化培養(yǎng)。2525C C左右培養(yǎng)左右培養(yǎng)出新梢，分株或切段后于增殖培養(yǎng)基上繼續(xù)出新梢，分株或切段后于增殖培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)成芽苗培養(yǎng)成芽苗（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)（二）植物細(xì)胞培養(yǎng) （二）植物細(xì)胞培養(yǎng)（二）植物細(xì)胞培養(yǎng) 1.1.機(jī)械法：機(jī)械法： 2.2.酶解法：纖維素酶、瓊脂酶、果膠酶酶解法：纖維素酶、瓊脂酶、果膠酶 3.3.愈傷組織誘導(dǎo)法：高頻振蕩使愈傷組織分愈傷組織誘導(dǎo)法：高頻振蕩使愈傷組織分散成單個細(xì)胞散成單個細(xì)胞 植物單細(xì)胞制備植物單細(xì)胞制備（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)（二）植物細(xì)胞培養(yǎng) 1.1.分離：分離：機(jī)械法（質(zhì)壁分離）；機(jī)械法（質(zhì)壁分離）； 酶解法酶解法 2.2.純化：純化：離心沉

21、降法；離心沉降法； 漂浮法；漂浮法； 離心和漂浮結(jié)合法離心和漂浮結(jié)合法植物細(xì)胞原生質(zhì)體制備植物細(xì)胞原生質(zhì)體制備（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)（二）植物細(xì)胞培養(yǎng) 1.1.平板培養(yǎng)法平板培養(yǎng)法: :類似于微生物的平板培養(yǎng)類似于微生物的平板培養(yǎng) 2.2.看護(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng): :常用愈傷組織看護(hù)常用愈傷組織看護(hù) 3. 3.飼養(yǎng)層培養(yǎng)飼養(yǎng)層培養(yǎng): :無分裂能力的組織共培養(yǎng)無分裂能力的組織共培養(yǎng) 4. 4.液體淺層靜置培養(yǎng)液體淺層靜置培養(yǎng): : 5. 5.細(xì)胞懸浮培養(yǎng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng): :植物單細(xì)胞培養(yǎng)方法植物單細(xì)胞培養(yǎng)方法二、細(xì)胞工程二、細(xì)胞工程 植物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程 細(xì)胞重組細(xì)胞重組 動物細(xì)胞工程動物細(xì)胞工程 細(xì)胞

22、融合細(xì)胞融合 胚胎工程胚胎工程 動物克隆動物克隆 染色體工程染色體工程 轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物（一）植物細(xì)胞工（一）植物細(xì)胞工程程（一）植物細(xì)胞工程（一）植物細(xì)胞工程 細(xì)胞雜交：細(xì)胞雜交：（一）植物細(xì)胞工程（一）植物細(xì)胞工程 人工種子人工種子 種子的結(jié)構(gòu)種子的結(jié)構(gòu)種皮種皮胚乳胚乳胚胚什么是人工種子？什么是人工種子？就是將組織培養(yǎng)產(chǎn)生的體就是將組織培養(yǎng)產(chǎn)生的體細(xì)胞胚或不定芽細(xì)胞胚或不定芽包裹在能提供包裹在能提供養(yǎng)分的膠囊里，再在膠囊外包上一層養(yǎng)分的膠囊里，再在膠囊外包上一層具有保護(hù)功能和防止機(jī)械損傷的外膜具有保護(hù)功能和防止機(jī)械損傷的外膜，造成一種類似于種子的結(jié)構(gòu)。造成一種類似于種子的結(jié)構(gòu)。（一）植

23、物細(xì)胞工程（一）植物細(xì)胞工程胚胚 狀狀 體體人工種皮人工種皮人工胚乳人工胚乳人工種子的制備人工種子的制備 包埋液（人工包埋液（人工胚乳）制備：胚乳）制備： 2%-3%2%-3%的海藻酸的海藻酸鈉鈉+ +營養(yǎng)物、生長因營養(yǎng)物、生長因子等子等。（二）動物細(xì)胞工程（二）動物細(xì)胞工程1.1.細(xì)胞重組細(xì)胞重組 又稱又稱細(xì)胞拆合細(xì)胞拆合。是指從活細(xì)胞中分離。是指從活細(xì)胞中分離出細(xì)胞器及其組分，然后在體外一定條件出細(xì)胞器及其組分，然后在體外一定條件下將不同細(xì)胞來源的細(xì)胞器及其組分進(jìn)行下將不同細(xì)胞來源的細(xì)胞器及其組分進(jìn)行重組，使其重新裝配成為具有生物活性的重組，使其重新裝配成為具有生物活性的細(xì)胞或細(xì)胞器的一種

24、實驗技術(shù)。細(xì)胞或細(xì)胞器的一種實驗技術(shù)。（二）動物細(xì)胞工程（二）動物細(xì)胞工程1.1.細(xì)胞重組細(xì)胞重組 （1 1）核體）核體 胞質(zhì)分離得到的細(xì)胞核帶有少量胞質(zhì)胞質(zhì)分離得到的細(xì)胞核帶有少量胞質(zhì)并圍有質(zhì)膜，稱為核體。并圍有質(zhì)膜，稱為核體。 （2 2）胞質(zhì)體）胞質(zhì)體 除去細(xì)胞核后由質(zhì)膜包裹的無核細(xì)胞。除去細(xì)胞核后由質(zhì)膜包裹的無核細(xì)胞。（二）動物細(xì)胞工程（二）動物細(xì)胞工程 2.2.細(xì)胞融合細(xì)胞融合 又稱又稱體細(xì)胞雜交體細(xì)胞雜交（somatic hybridiazation），），是指兩個或更多個相同或不同細(xì)胞是指兩個或更多個相同或不同細(xì)胞通過膜通過膜 融合形成單個細(xì)胞的過程。融合形成單個細(xì)胞的過程。（二）

25、動物細(xì)胞工程（二）動物細(xì)胞工程 細(xì)胞融合過程：細(xì)胞融合過程： （二）動物細(xì)胞工程（二）動物細(xì)胞工程 利用細(xì)胞融合、培養(yǎng)利用細(xì)胞融合、培養(yǎng)生產(chǎn)單隆抗體生產(chǎn)單隆抗體 應(yīng)用舉例應(yīng)用舉例（二）動物細(xì)胞工程（二）動物細(xì)胞工程 3.3.胚胎工程胚胎工程 是對哺乳動物的胚胎進(jìn)行操作是對哺乳動物的胚胎進(jìn)行操作, ,讓它繼讓它繼續(xù)發(fā)育獲得人們所需要的成體動物的一種續(xù)發(fā)育獲得人們所需要的成體動物的一種技術(shù)技術(shù). . 包括包括胚胎培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)、胚胎移植胚胎移植、胚胎分割與胚胎分割與融合融合、胚胎性別鑒定胚胎性別鑒定、胚胎保存胚胎保存等。等。（二）動物細(xì)胞工程（二）動物細(xì)胞工程 試管動物（嬰兒）：試管動物（嬰兒）：

26、體外受精通常是在試管中完成。由此體外受精通常是在試管中完成。由此體外受精后發(fā)育的胚胎再移植到供體動物體外受精后發(fā)育的胚胎再移植到供體動物體內(nèi)發(fā)育生長而得到動物后代稱體內(nèi)發(fā)育生長而得到動物后代稱試管動物試管動物。 精子的采集與獲能；精子的采集與獲能； 卵子的回收及成熟培養(yǎng)；卵子的回收及成熟培養(yǎng)； 體外受精；體外受精； 受精卵的體外發(fā)育；受精卵的體外發(fā)育； 試管胚胎的移植，等試管胚胎的移植，等試管動物的培育試管動物的培育（二）動物細(xì)胞工程（二）動物細(xì)胞工程 胚胎分割胚胎分割（embryo splitting） 即是將一枚胚胎用顯微手術(shù)的方法分割即是將一枚胚胎用顯微手術(shù)的方法分割成二分、四分甚至八分

27、胚，經(jīng)體內(nèi)或體外成二分、四分甚至八分胚，經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)，然后移植入受體中，以得到培養(yǎng)，然后移植入受體中，以得到同卵雙同卵雙生生或或同卵多生同卵多生后代的技術(shù)，也是胚胎克隆后代的技術(shù)，也是胚胎克隆的一種方法。的一種方法。（二）動物細(xì)胞工程（二）動物細(xì)胞工程胚胎融合胚胎融合 胚胎嵌合胚胎嵌合鼠女鼠女豹妹豹妹（二）動物細(xì)胞工程（二）動物細(xì)胞工程 4.4.動物克隆動物克隆細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植 利用顯微技術(shù)將一種動物細(xì)胞核移入利用顯微技術(shù)將一種動物細(xì)胞核移入到同種或異種動物的去核成熟卵細(xì)胞內(nèi)的到同種或異種動物的去核成熟卵細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)?？赡軇?chuàng)造無性雜交新品種。技術(shù)?？赡軇?chuàng)造無性雜交新品種。（二）動物細(xì)胞

28、工程（二）動物細(xì)胞工程 4.4.動物克隆動物克隆細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植 胚胚 胎胎 克克 ?。郝。菏褂玫暮斯w細(xì)胞來自多使用的核供體細(xì)胞來自多 細(xì)胞階段的胚胎。細(xì)胞階段的胚胎。 體細(xì)胞克?。后w細(xì)胞克隆：使用的核供體細(xì)胞來自動使用的核供體細(xì)胞來自動 物體。物體。細(xì)胞核移植是廣義上的克?。杭?xì)胞核移植是廣義上的克隆：胚胎細(xì)胞克隆動物胚胎細(xì)胞克隆動物體細(xì)胞克隆動物體細(xì)胞克隆動物（二）動物細(xì)胞工程（二）動物細(xì)胞工程 5.5.轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù) 通過人工方式將外源基因整合到生物通過人工方式將外源基因整合到生物體基因組內(nèi)，并使該基因生物能穩(wěn)定地將體基因組內(nèi)，并使該基因生物能穩(wěn)定地將此基因遺傳給后代的技術(shù)。此基因遺傳給后代的技術(shù)。 轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物 轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物（二）動物細(xì)胞工程（二）動物細(xì)胞工程 5.5.轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù) 轉(zhuǎn)基因動物：轉(zhuǎn)基因動物： 將特定的將特定的目的基因目的基因從某一生物體分離出從某一生物體分離出來，進(jìn)行來，進(jìn)行擴(kuò)增和加工擴(kuò)增和