生物質(zhì)譜技術(shù)原理及應(yīng)用0327 (1)

1、生物質(zhì)譜技術(shù)原理及應(yīng)用生物質(zhì)譜技術(shù)原理及應(yīng)用揚(yáng)州大學(xué)測試中心揚(yáng)州大學(xué)測試中心-色質(zhì)譜機(jī)組色質(zhì)譜機(jī)組王郁楊王郁楊質(zhì)譜的概念質(zhì)譜的概念 質(zhì)譜分析法是通過對被測樣品離子的質(zhì)荷比（質(zhì)譜分析法是通過對被測樣品離子的質(zhì)荷比（m/zm/z）的測）的測定來進(jìn)行分析的一種分析方法。定來進(jìn)行分析的一種分析方法。它可用于未知化合物的鑒定、定量分析、分子結(jié)構(gòu)及化學(xué)特性的確定等方面。 被分析的樣品首先要離子化，然后利用不同離子在電場或磁場的運(yùn)動行為的不同，把離子按質(zhì)荷比分開而得到質(zhì)譜，通過樣品的質(zhì)譜和相關(guān)信息，可以得到樣品的定性定量結(jié)果。質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展自1886年Goldstein發(fā)明早期質(zhì)譜儀器常用的離

2、子源，到1942年第一臺單聚焦質(zhì)譜儀商品化，質(zhì)譜基本上處于理論發(fā)展階段。隨后質(zhì)譜在電離技術(shù)和分析技術(shù)上的發(fā)展和完善，使之很快應(yīng)用于地質(zhì)、空間研究、環(huán)境化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、制藥地質(zhì)、空間研究、環(huán)境化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、制藥等多個領(lǐng)域。然而，即使在等離子體解吸（plasma desorption, PD）和快原子轟擊（fast atom bombardment, FAB）兩項軟電離質(zhì)譜軟電離質(zhì)譜技術(shù)出現(xiàn)以后，質(zhì)譜分析的相對分子質(zhì)量也只是在幾千左右。生物質(zhì)譜生物質(zhì)譜真正意義上的變革以80年代中期出現(xiàn)的兩種新的電離技術(shù)為代表： 電噴霧電離（電噴霧電離（electrospray ionization, ESI）

3、基質(zhì)輔助激光解吸電離（基質(zhì)輔助激光解吸電離（matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI）這兩種技術(shù)所具有的高靈敏度和高質(zhì)量檢測范圍，使得在fmol（10-15）乃至amole（10-18）水平檢測相對分子質(zhì)量高達(dá)幾十萬的生物大分子成為可能，從而開拓了質(zhì)譜學(xué)一個嶄新的領(lǐng)域生物質(zhì)譜生物質(zhì)譜，促使質(zhì)譜技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用和發(fā)展，為蛋白質(zhì)組研究提供了關(guān)鍵的技術(shù)手段。質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)和工作原理質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)和工作原理 質(zhì)譜分析法主要是通過對樣品的離子的質(zhì)荷比的分析而實現(xiàn)對樣品進(jìn)行定質(zhì)譜分析法主要是通過對樣品的離子的質(zhì)荷比的分析而實現(xiàn)對樣品進(jìn)行定性

4、和定量的一種方法。因此，性和定量的一種方法。因此，質(zhì)譜儀必須有電離裝置把樣品電離為離子，有質(zhì)量質(zhì)譜儀必須有電離裝置把樣品電離為離子，有質(zhì)量分析裝置把不同質(zhì)荷比的離子分開，經(jīng)檢測器檢測之后可以得到樣品的質(zhì)譜圖，分析裝置把不同質(zhì)荷比的離子分開，經(jīng)檢測器檢測之后可以得到樣品的質(zhì)譜圖，不管是哪種類型的質(zhì)譜儀，其基本組成是相同，包括不管是哪種類型的質(zhì)譜儀，其基本組成是相同，包括離子源離子源、質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器、檢測檢測器器和和真空系統(tǒng)真空系統(tǒng)。離子源離子源離子源的作用是將欲分析樣品電離，得到帶有樣品信息的離子。離子源的作用是將欲分析樣品電離，得到帶有樣品信息的離子。質(zhì)譜儀的離子源種類很多，主要有：質(zhì)譜

5、儀的離子源種類很多，主要有： 電子電離源電子電離源(Electron Ionization, EI) 化學(xué)電離源化學(xué)電離源(Chemical Ionization, CI)快原子轟擊源快原子轟擊源(Fast Atomic bombardment, FAB)電噴霧源電噴霧源(Electron spray Ionization, ESI)大氣壓化學(xué)電離源大氣壓化學(xué)電離源(Atmospheric pressure chemical Ionization, APCI) 基質(zhì)輔助激光解吸電離源基質(zhì)輔助激光解吸電離源(Matrix Assisted Laser Description Ionization

6、, MALDI) 電噴霧源電噴霧源(ESI源源) 利用高電場使質(zhì)譜進(jìn)樣段的毛細(xì)管柱流出的液滴帶電，在利用高電場使質(zhì)譜進(jìn)樣段的毛細(xì)管柱流出的液滴帶電，在N2氣流的作用下，液氣流的作用下，液滴溶劑蒸發(fā)，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產(chǎn)生的庫倫斥力與液滴溶劑蒸發(fā)，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產(chǎn)生的庫倫斥力與液滴表面張力達(dá)到雷利極限，液滴爆裂為帶電的子液滴，這一過程不斷重復(fù)使最滴表面張力達(dá)到雷利極限，液滴爆裂為帶電的子液滴，這一過程不斷重復(fù)使最終的液滴非常細(xì)小呈霧滴狀，這時的液滴表面電場非常強(qiáng)大，使分析物離子化終的液滴非常細(xì)小呈霧滴狀，這時的液滴表面電場非常強(qiáng)大，使分析物離子化并以帶

7、單電荷或多電荷的離子形式進(jìn)入質(zhì)量分析器。（如下圖）并以帶單電荷或多電荷的離子形式進(jìn)入質(zhì)量分析器。（如下圖）流出液在高電場下形成帶電噴霧，在電場力作用下穿過氣簾；流出液在高電場下形成帶電噴霧，在電場力作用下穿過氣簾；氣簾的作用：霧化；蒸發(fā)溶劑；阻止中性溶劑分子氣簾的作用：霧化；蒸發(fā)溶劑；阻止中性溶劑分子 電噴霧電離源是一種軟電離方式，即便是分子量大，穩(wěn)定性差的化合物，也不會在電離過程中發(fā)生分解，它適合于分析極性強(qiáng)的大分子有機(jī)化合物極性強(qiáng)的大分子有機(jī)化合物，如蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白質(zhì)、肽、糖等。電噴霧電離源的最大特點(diǎn)是容易形成多電荷離子多電荷離子。 這樣，一個分子量為10KD的分子若帶有10個電荷，則

8、其質(zhì)荷比只有1000，進(jìn)入了一般質(zhì)譜儀可以分析的范圍之內(nèi)。根據(jù)這一特點(diǎn)，目前采用ESI，可以測量分子量在300KD以上的蛋白質(zhì)。MALDI 離子源離子源 待測物質(zhì)的溶液與基質(zhì)的溶液混合后蒸發(fā)，使分析物與基質(zhì)成為晶體或半待測物質(zhì)的溶液與基質(zhì)的溶液混合后蒸發(fā)，使分析物與基質(zhì)成為晶體或半晶體，用一定波長的脈沖式激光（晶體，用一定波長的脈沖式激光（337nm的氮激光）進(jìn)行照射時，基質(zhì)的氮激光）進(jìn)行照射時，基質(zhì)分子能有效的吸收激光的能量，使基質(zhì)分子和樣品分子進(jìn)入氣相并得到電分子能有效的吸收激光的能量，使基質(zhì)分子和樣品分子進(jìn)入氣相并得到電離。離。 質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器的作用是將離子源產(chǎn)生的離子按

9、質(zhì)量分析器的作用是將離子源產(chǎn)生的離子按m/z順序分開并排列成譜。質(zhì)量順序分開并排列成譜。質(zhì)量分析器有分析器有 A、磁式單聚焦分析器、磁式單聚焦分析器(Single Focusing) B、磁式雙聚焦分析器、磁式雙聚焦分析器(Double Focusing) C、四極桿分析器、四極桿分析器(Quadrupole) D、離子阱分析器、離子阱分析器(Ion Trap) E、飛行時間分析器、飛行時間分析器(Time of Flight) F、傅立葉變換回旋共振分析器、傅立葉變換回旋共振分析器(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance, FTICR） 四極桿分析

10、器四極桿分析器 由兩對四根高度平行的金屬電極桿組成的，精密地固定在正方形的四個角上，由兩對四根高度平行的金屬電極桿組成的，精密地固定在正方形的四個角上，其中一對電極加上直流電壓其中一對電極加上直流電壓Vdc，另一對電極加上射頻電壓，另一對電極加上射頻電壓V0cost（V0為射頻電壓為射頻電壓的振幅，的振幅，為射頻振蕩頻率，為射頻振蕩頻率，t為時間），即加在兩個極桿之間的總電壓為為時間），即加在兩個極桿之間的總電壓為（Vdc+V0cost）。由于射頻電壓大于直流電壓，所以在四極之間的空間處于射頻）。由于射頻電壓大于直流電壓，所以在四極之間的空間處于射頻調(diào)制的直流電壓的兩種力作用下的射頻場中，離子

11、進(jìn)入此射頻場時，只有合適調(diào)制的直流電壓的兩種力作用下的射頻場中，離子進(jìn)入此射頻場時，只有合適m/e的離子才能通過穩(wěn)定的振蕩穿過電極間隙而進(jìn)入控制器，其它的離子才能通過穩(wěn)定的振蕩穿過電極間隙而進(jìn)入控制器，其它m/e的離子則與極桿的離子則與極桿相撞而被濾去。只要保持相撞而被濾去。只要保持 Vdc/V0值及射頻頻率不變，改變值及射頻頻率不變，改變Vdc、V0可以實現(xiàn)掃描。可以實現(xiàn)掃描。 是一種無磁分析器，體積小，重量輕，操作方便，掃描速度快，分辨率較高。是一種無磁分析器，體積小，重量輕，操作方便，掃描速度快，分辨率較高。是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時間不同是離子在電場作用

12、下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比 (m/z) 與離子的飛行時間成正比。與離子的飛行時間成正比。反射飛行時間質(zhì)量檢測器反射飛行時間質(zhì)量檢測器飛行時間分析器飛行時間分析器 飛行時間質(zhì)量分析器的主要部分是一個離子漂移管。飛行時間質(zhì)量分析器的主要部分是一個離子漂移管。離子在加速電壓離子在加速電壓V作用下得到動能，則有：作用下得到動能，則有： 1/2 mv2=eV或或v=(2eV/m)1/2離子以速度離子以速度v進(jìn)入自由空間（漂移區(qū)），假定離子在漂移進(jìn)入自由空間（漂移區(qū)），假定離子在漂移區(qū)飛行的時間為區(qū)飛行的時間為T，漂移區(qū)長度為，漂移

13、區(qū)長度為L，則：，則： T=L(m/2eV)1/2 可以看出，離子在漂移管中飛行的時間與離子質(zhì)量的可以看出，離子在漂移管中飛行的時間與離子質(zhì)量的平方根成正比。也即，對于能量相同的離子，離子的質(zhì)量平方根成正比。也即，對于能量相同的離子，離子的質(zhì)量越大，達(dá)到接收器所用的時間越長，質(zhì)量越小，所用時間越大，達(dá)到接收器所用的時間越長，質(zhì)量越小，所用時間越短，根據(jù)這一原理，可以把不同質(zhì)量的離子分開。適當(dāng)越短，根據(jù)這一原理，可以把不同質(zhì)量的離子分開。適當(dāng)增加漂移管的長度可以增加分辨率。增加漂移管的長度可以增加分辨率。 飛行時間質(zhì)量分析器的飛行時間質(zhì)量分析器的特點(diǎn)特點(diǎn)：質(zhì)：質(zhì)量范圍寬，掃描速度快，既不需電場量

14、范圍寬，掃描速度快，既不需電場也不需磁場。也不需磁場。 但是，長時間以來一直存在分辨但是，長時間以來一直存在分辨率低這一缺點(diǎn)，造成分辨率低的主要率低這一缺點(diǎn)，造成分辨率低的主要原因在于離子進(jìn)入漂移管前的時間分原因在于離子進(jìn)入漂移管前的時間分散、空間分散和能量分散。這樣，即散、空間分散和能量分散。這樣，即使是質(zhì)量相同的離子，由于產(chǎn)生時間使是質(zhì)量相同的離子，由于產(chǎn)生時間的先后，產(chǎn)生空間的前后和初始動能的先后，產(chǎn)生空間的前后和初始動能的大小不同，達(dá)到檢測器的時間就不的大小不同，達(dá)到檢測器的時間就不相同，因而降低了分辨率。相同，因而降低了分辨率。 目前，通過采取目前，通過采取激光脈沖電離方激光脈沖電離

15、方式，離子延遲萃取技術(shù)式，離子延遲萃取技術(shù)和和離子反射技離子反射技術(shù)術(shù)，可以在很大程度上克服上述三個，可以在很大程度上克服上述三個原因造成的分辨率下降?，F(xiàn)在，飛行原因造成的分辨率下降?，F(xiàn)在，飛行時間質(zhì)譜儀的分辨率可達(dá)時間質(zhì)譜儀的分辨率可達(dá)20000以上。以上。最高可檢質(zhì)量超過最高可檢質(zhì)量超過300000Da，并且，并且具有很高的靈敏度。具有很高的靈敏度。MALDI-TOF檢測器檢測器 質(zhì)譜儀的檢測主要使用質(zhì)譜儀的檢測主要使用電子倍增器，也有的使用光電子倍增器，也有的使用光電倍增管。由四極桿出來的電倍增管。由四極桿出來的離子打到高能打拿極產(chǎn)生電離子打到高能打拿極產(chǎn)生電子，電子經(jīng)電子倍增器產(chǎn)生子，

16、電子經(jīng)電子倍增器產(chǎn)生電信號，記錄不同離子的信電信號，記錄不同離子的信號即得質(zhì)譜號即得質(zhì)譜。真空系統(tǒng)真空系統(tǒng) 為了保證離子源中燈絲的正常工作，保證離子在離子源和分析器為了保證離子源中燈絲的正常工作，保證離子在離子源和分析器正常運(yùn)行，消減不必要的離子碰撞，散射效應(yīng)，復(fù)合反應(yīng)和離子正常運(yùn)行，消減不必要的離子碰撞，散射效應(yīng)，復(fù)合反應(yīng)和離子-分子分子反應(yīng)，減小本底與記憶效應(yīng)反應(yīng)，減小本底與記憶效應(yīng),因此，質(zhì)譜儀的離子源和分析器都必須處因此，質(zhì)譜儀的離子源和分析器都必須處在優(yōu)于在優(yōu)于10-5mbar的真空中才能工作。的真空中才能工作。 一般真空系統(tǒng)由一般真空系統(tǒng)由機(jī)械真空泵機(jī)械真空泵和和擴(kuò)散泵擴(kuò)散泵或或渦

17、輪分子泵渦輪分子泵組成。機(jī)械真空組成。機(jī)械真空泵能達(dá)到的極限真空度為泵能達(dá)到的極限真空度為10-3mbar,不能滿足要求，必須依靠不能滿足要求，必須依靠高真空泵高真空泵。擴(kuò)散泵是常用的高真空泵，其性能穩(wěn)定可靠，缺點(diǎn)是啟動慢，從停機(jī)擴(kuò)散泵是常用的高真空泵，其性能穩(wěn)定可靠，缺點(diǎn)是啟動慢，從停機(jī)狀態(tài)到儀器能正常工作所需時間長；渦輪分子泵則相反，儀器啟動快，狀態(tài)到儀器能正常工作所需時間長；渦輪分子泵則相反，儀器啟動快，但使用壽命不如擴(kuò)散泵。但由于渦輪分子泵使用方便，沒有油的擴(kuò)散但使用壽命不如擴(kuò)散泵。但由于渦輪分子泵使用方便，沒有油的擴(kuò)散污染問題，因此，近年來生產(chǎn)的質(zhì)譜儀大多使用渦輪分子泵。渦輪分污染問

18、題，因此，近年來生產(chǎn)的質(zhì)譜儀大多使用渦輪分子泵。渦輪分子泵直接與離子源或分析器相連，抽出的氣體再由機(jī)械真空泵排到體子泵直接與離子源或分析器相連，抽出的氣體再由機(jī)械真空泵排到體系之外。系之外。質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)質(zhì)譜儀是一種很好的定性鑒定用儀器，對混合物的分析質(zhì)譜儀是一種很好的定性鑒定用儀器，對混合物的分析無能為力。無能為力。色譜儀是一種很好的分離用儀器，但定性能力很差。色譜儀是一種很好的分離用儀器，但定性能力很差。 二者結(jié)合起來，則能發(fā)揮各自專長，使分離和鑒定同二者結(jié)合起來，則能發(fā)揮各自專長，使分離和鑒定同時進(jìn)行時進(jìn)行(色譜色譜- -質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜聯(lián)用) 。這樣，使質(zhì)譜儀無論在定性分。這樣，

19、使質(zhì)譜儀無論在定性分析還是在定量分析方面都十分方便。同時，為了增加未析還是在定量分析方面都十分方便。同時，為了增加未知物分析的結(jié)構(gòu)信息，為了增加分析的選擇性，采用知物分析的結(jié)構(gòu)信息，為了增加分析的選擇性，采用串串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)質(zhì)譜法法(質(zhì)譜質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜聯(lián)用)，也是目前質(zhì)譜儀發(fā)展的一個，也是目前質(zhì)譜儀發(fā)展的一個方向。方向。MALDI-TOF MSMALDI-TOF-TOF MSESI-Q-Q-Q MSESI-IT MSESI-IT-TOF MSESI-Q-TOF MSESI-FTICR MS生物質(zhì)譜生物質(zhì)譜 目前商業(yè)化的生物質(zhì)譜儀主要是：液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-ESI-

20、MS-MS）與帶有串聯(lián)質(zhì)譜功能的MALDI-TOF質(zhì)譜儀。 前者是在傳統(tǒng)的電噴霧質(zhì)譜儀的基礎(chǔ)上采用飛行時間質(zhì)量分析器代替四極桿質(zhì)量分析器，大大提高了儀器的分辨率、靈敏度和質(zhì)量范圍，其商品名有Q-TOF和Q-STAR等； 后者是在質(zhì)譜中加入了源后降解（post-source decay, PSD）模式或碰撞誘導(dǎo)解離（collisionally induced dissociation, CID）模式，從而使生物大分子的測序成為可能。 ESI-MS可以和液相色譜、毛細(xì)管電泳等現(xiàn)代化的分離手段聯(lián)用，從而大大擴(kuò)展了其在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，包括藥物代謝、臨床和法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用等。 MALDI-TOF-M

21、S的特點(diǎn)是對鹽和添加物的耐受能力高，且測樣速度快，操作簡單。 此外，可用于生物大分子測定的質(zhì)譜儀還有離子阱質(zhì)譜和傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜等。質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用 1、蛋白質(zhì)組學(xué)的定義和基礎(chǔ)知識、蛋白質(zhì)組學(xué)的定義和基礎(chǔ)知識2、質(zhì)譜在蛋白質(zhì)學(xué)中重要應(yīng)用、質(zhì)譜在蛋白質(zhì)學(xué)中重要應(yīng)用 蛋白質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)鑒定 差異表達(dá)差異表達(dá) 蛋白質(zhì)定量蛋白質(zhì)定量什么是蛋白質(zhì)組學(xué) 蛋白質(zhì)組學(xué)是大規(guī)模研究蛋白質(zhì)，特別是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)是大規(guī)模研究蛋白質(zhì)，特別是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的學(xué)科。和功能的學(xué)科。蛋白質(zhì)組學(xué)這個概念是相對應(yīng)于基因組學(xué)產(chǎn)生的，而且通常被視為是基因組學(xué)的下一步，且復(fù)雜程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出基因組學(xué)。更重要的是

22、，基因組的存在是相對穩(wěn)定的，而細(xì)胞和細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)組則是隨蛋白質(zhì)和基因以及環(huán)境的生物化學(xué)反應(yīng)而變化的。同一生物在生物體的不同部位、生命的不同時期以及不同的環(huán)境中，具有不同的蛋白質(zhì)表達(dá)。MALDI 源生物質(zhì)譜 MALDI-TOF-MS 基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（MALDI） 飛行時間質(zhì)量分析器（飛行時間質(zhì)量分析器（TOF）SampleInletIonizationMass AnalyzerMass Sorting (filtering)Ion DetectorDetectionIon SourceSample/Matrix dried on MALDI Plate

23、(Autoloader Cassette)Detect ionsForms ions(charged molecules)Sort Ions by Mass (m/z)Basic Components of a Mass SpectrometerData ProcessingVacuum EnvelopeRelative Abundancem/z 1000 2000 Mass SpectrumData SystemMALDI 離子源離子源 待測物質(zhì)的溶液與基質(zhì)的溶液混合后蒸發(fā)，使分析物與基質(zhì)成為晶體或半待測物質(zhì)的溶液與基質(zhì)的溶液混合后蒸發(fā)，使分析物與基質(zhì)成為晶體或半晶體，用一定波長的脈沖式激光

24、（晶體，用一定波長的脈沖式激光（337nm的氮激光）進(jìn)行照射時，基質(zhì)的氮激光）進(jìn)行照射時，基質(zhì)分子能有效的吸收激光的能量，使基質(zhì)分子和樣品分子進(jìn)入氣相并得到電分子能有效的吸收激光的能量，使基質(zhì)分子和樣品分子進(jìn)入氣相并得到電離。離。 MALDI 基質(zhì)應(yīng)具有的特性基質(zhì)應(yīng)具有的特性 能夠嵌入樣品分子間并能起到隔離樣品分子之間的能夠嵌入樣品分子間并能起到隔離樣品分子之間的相互作用相互作用(如形成共結(jié)晶如形成共結(jié)晶); 能溶解于可溶解樣品分子的溶劑能溶解于可溶解樣品分子的溶劑; 在真空狀態(tài)下是穩(wěn)定的在真空狀態(tài)下是穩(wěn)定的; 可吸收激光可吸收激光,既與激光形成共振吸收既與激光形成共振吸收; 可激發(fā)樣品分子離

25、子化可激發(fā)樣品分子離子化. 常用的常用的 MALDI 基質(zhì)基質(zhì)Matrix Application 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)2,5-二羥基苯甲酸二羥基苯甲酸Small molecules, small peptides, nucleotides, oligonucleotides, oligosaccharides 3,5-Dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid (SA) 3,5-二甲氧基羥基肉硅酸二甲氧基羥基肉硅酸(反式反式)Large peptides, whole proteins, glycoproteins, lipid

26、s a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) 腈基腈基羥基肉硅酸羥基肉硅酸Peptides, proteins, lipids, nucleotides是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時間不同是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比 (m/z) 與離子的飛行時間成正比。與離子的飛行時間成正比。反射飛行時間質(zhì)量檢測器反射飛行時間質(zhì)量檢測器飛行時間分析器飛行時間分析器TOF-TOFMALDI-TOF/TOFMALDI 源可以電離分子質(zhì)量為源可以電離分子質(zhì)量為1021

27、06 Da 的生物分子并用于質(zhì)譜分的生物分子并用于質(zhì)譜分析。析。MALDI產(chǎn)生的離子采用飛行時間（產(chǎn)生的離子采用飛行時間（TOF）檢測器來檢測，因此）檢測器來檢測，因此適用于蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖等生物大分子的測定。適用于蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖等生物大分子的測定。通過通過第一級第一級TOF選擇特定多肽和蛋白選擇特定多肽和蛋白，而后送入碰撞池進(jìn)行裂解，再，而后送入碰撞池進(jìn)行裂解，再進(jìn)入進(jìn)入第二級第二級TOF進(jìn)行序列和修飾等結(jié)構(gòu)解析進(jìn)行序列和修飾等結(jié)構(gòu)解析，完成蛋白質(zhì)的精確鑒定，完成蛋白質(zhì)的精確鑒定。根據(jù)測定蛋白質(zhì)酶解后的根據(jù)測定蛋白質(zhì)酶解后的肽質(zhì)量指紋圖譜、肽序列標(biāo)簽以及一級質(zhì)譜肽質(zhì)量指紋圖

28、譜、肽序列標(biāo)簽以及一級質(zhì)譜（MS）結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜（）結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）法去檢索核酸或蛋白質(zhì)序列庫，可法去檢索核酸或蛋白質(zhì)序列庫，可達(dá)到對蛋白質(zhì)的達(dá)到對蛋白質(zhì)的快速鑒定和高通量篩選快速鑒定和高通量篩選。LC MALDI TOF/TOF分析與分析與AB SCIEX TOF/TOF 5800 系統(tǒng)系統(tǒng)5800 MALDI TOF/TOF 串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜主機(jī)串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜主機(jī)Tempo LC MALDI 點(diǎn)樣系統(tǒng)點(diǎn)樣系統(tǒng)Mascot 2.3 結(jié)合結(jié)合Mascot Deamon搜索引擎搜索引擎ProteinPilot 4.0 蛋白分析工具蛋白分析工具Tempo LC MALDI 點(diǎn)樣系統(tǒng)點(diǎn)樣系

29、統(tǒng)MALDI 的特點(diǎn)的特點(diǎn)圖譜相對簡單圖譜相對簡單;激光具有一定的頻率，和激光具有一定的頻率，和TOF完美匹配完美匹配;理論上待測物沒有分子量范圍限制理論上待測物沒有分子量范圍限制;樣本消耗量極小樣本消耗量極小(0.5 L);樣本點(diǎn)靶后可多次分析樣本點(diǎn)靶后可多次分析;一次實驗可迅速完成多個不同樣本的分一次實驗可迅速完成多個不同樣本的分析，高通量析，高通量;缺點(diǎn)缺點(diǎn)質(zhì)荷比質(zhì)荷比500-800區(qū)域噪音較大；區(qū)域噪音較大；和液相色譜在線連接使用較為困難和液相色譜在線連接使用較為困難可以吸收激光能量發(fā)生變化的分子不適用可以吸收激光能量發(fā)生變化的分子不適用MALDIMALDI優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 基于凝膠分離的蛋白

30、質(zhì)點(diǎn)或者條帶的鑒定基于凝膠分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)或者條帶的鑒定 (2-DE,DIGE,Co-IP, GST pull down.) 運(yùn)用質(zhì)譜進(jìn)行定量的蛋白質(zhì)組分析技術(shù)運(yùn)用質(zhì)譜進(jìn)行定量的蛋白質(zhì)組分析技術(shù) (iTRAQ,SILAC,ICAT.) 生物大分子的分子量分析生物大分子的分子量分析 蛋白質(zhì)的序列分析，肽段的從頭測序蛋白質(zhì)的序列分析，肽段的從頭測序 蛋白質(zhì)翻譯后修飾的分析蛋白質(zhì)翻譯后修飾的分析 (磷酸化，糖基化磷酸化，糖基化.) 有機(jī)小分子有機(jī)小分子(1000)與高聚物分子與高聚物分子(基質(zhì)合適基質(zhì)合適)分析分析MALDI MALDI 源生物質(zhì)譜技術(shù)平臺的應(yīng)用源生物質(zhì)譜技術(shù)平臺的應(yīng)用雙向電泳雙向電泳

31、切膠切膠酶解酶解肽提取肽提取點(diǎn)靶點(diǎn)靶5800數(shù)數(shù)據(jù)采集據(jù)采集進(jìn)靶進(jìn)靶799.01441.82084.62727.43370.24013.0Mass (m/z)4829.80102030405060708090100Final - Shots 750 - qinghua; Run #7; Label C11936.02322030.05491528.81702007.97522292.24291656.87952682.45701970.99132326.12131965.04263036.51591141.62501645.93053362.51272357.1841889.49262665.

32、4473一級圖譜一級圖譜9.0492.6976.21459.81943.42427.0Mass (m/z)8769.40102030405060708090100Final - Shots 1050 - NWFU20080321; Run #3; Label G30 Prec = 2298.1658 114.1294639.25851661.88341021.47001350.7125291.14471136.4447892.4456605.25101465.73941732.91431249.74602009.0321874.5229421.0647228.145070.1026111.01

33、12.6114.2115.8117.4119.0Mass (m/z)8769.40102030405060708090100Final - Shots 1050 - NWFU20080321; Run #3; Label G30 Prec = 2298.1658 114.1294115.1286113.1072112.0890二級圖譜二級圖譜二級匹二級匹配圖譜配圖譜數(shù)據(jù)庫檢索數(shù)據(jù)庫檢索FEFAPVDTIDEEGTNTVK 115/1141.0502匹配肽匹配肽Glutathione S-transferase 115/1141.0054鑒定的鑒定的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)Western-bloting 驗

34、證驗證ProteinPilotSoftware2-DE 路線路線適用于質(zhì)譜的染色方法適用于質(zhì)譜的染色方法熒光染色（熒光染色（SYPRO Ruby protein gel stain）考馬斯亮蘭染色（考馬斯亮蘭染色（Bio-Safe Coomassie colloidal 250 stain） 銀染（銀染（Silver Stain Plus stain）一級圖譜一級圖譜二級圖譜二級圖譜Trypsin digestion799.01441.82084.62727.43370.24013.0Mass (m/z)4829.80102030405060708090100Final - Shots 750

35、 - qinghua; Run #7; Label C11936.02322030.05491528.81702007.97522292.24291656.87952682.45701970.99132326.12131965.04263036.51591141.62501645.93053362.51272357.1841889.49262665.44739.0492.6976.21459.81943.42427.0Mass (m/z)8769.40102030405060708090100Final - Shots 1050 - NWFU20080321; Run #3; Label G3

36、0 Prec = 2298.1658 114.1294639.25851661.88341021.47001350.7125291.14471136.4447892.4456605.25101465.73941732.91431249.74602009.0321874.5229421.0647228.145070.1026LC-MALDISDS-PAGEiTRAQ 路線路線iTRAQ + LC-MALDI + 5800 + ProteinPilot樣品標(biāo)記試劑樣品標(biāo)記試劑數(shù)據(jù)分析軟件數(shù)據(jù)分析軟件數(shù)據(jù)采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集質(zhì)譜液相分離點(diǎn)靶系統(tǒng)液相分離點(diǎn)靶系統(tǒng)iTRAQ試劑試劑LC-MALDI液相點(diǎn)靶系

37、統(tǒng)液相點(diǎn)靶系統(tǒng)AB SCIEX TOF/TOF 5800 標(biāo)記：在缺乏標(biāo)記：在缺乏Lys和和Arg的培的培養(yǎng)基中添加養(yǎng)基中添加Lys和和Arg的同位的同位素素Lys(D4或或13C6 15N4)、Arg(13C6,或或13C6 15N4)等培等培養(yǎng)細(xì)胞，使蛋白質(zhì)被標(biāo)記成養(yǎng)細(xì)胞，使蛋白質(zhì)被標(biāo)記成“中型中型”或或“重型重型”； 細(xì)胞處理、裂解、提取蛋白細(xì)胞處理、裂解、提取蛋白質(zhì)；質(zhì)； 等量混合對照與處理組蛋白等量混合對照與處理組蛋白質(zhì)、質(zhì)、SDS-PAGE電泳、染色；電泳、染色； 割取蛋白質(zhì)條帶，胰蛋白酶割取蛋白質(zhì)條帶，胰蛋白酶消化，質(zhì)譜分析。消化，質(zhì)譜分析。細(xì)胞代謝標(biāo)記（細(xì)胞代謝標(biāo)記（SILAC

38、）免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-IP）GST pull down蛋白質(zhì)與核酸相互作用鑒定蛋白質(zhì)與核酸相互作用鑒定蛋白高級結(jié)構(gòu)及蛋白蛋白高級結(jié)構(gòu)及蛋白- -配體復(fù)合物研究配體復(fù)合物研究生物大分子的分子量分析生物大分子的分子量分析BSA某蛋白聚合體某蛋白聚合體有機(jī)小分子研究有機(jī)小分子研究數(shù)據(jù)庫檢索數(shù)據(jù)庫檢索 Mascot 2.3 結(jié)合Mascot Deamon搜索引擎 ProteinPilot 4.0 蛋白分析工具一級圖譜一級圖譜二級圖譜二級圖譜Mascot DeamonMascot DeamonProteinPilot使用Paragon算法同時搜索幾百種種生物修飾及其它修飾、遺傳變異、以及未預(yù)期

39、的裂解方式，不會增加出現(xiàn)假陽性的幾率，也不會延長搜索時間或是增加多級分析的復(fù)雜性。使用嵌入式Pro GroupTM 算法進(jìn)行蛋白group分析，可區(qū)分蛋白異構(gòu)體，蛋白子集，并抑制假陽性。定量工作流程 - 為iTRAQTM、ICAT和 SILACTM試劑工作流程提供優(yōu)化支持，包括4標(biāo)（4plex）、8標(biāo)（8plex）試劑，和用于生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)及驗證的新型試劑mTRAQ。使用反庫（decoy）搜索進(jìn)行自動化且嚴(yán)密的假陽性率（False Discovery Rate，F(xiàn)DR）分析，可為您的結(jié)果提供高級別的質(zhì)量控制。MALDI 樣品基本要求樣品基本要求 磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液 50 mM 重碳酸銨重

40、碳酸銨 30 mM Tris buffer 100 mM 胍胍 (鹽酸鹽鹽酸鹽, 硫酸鹽硫酸鹽) 1 M Triton 0.1% SDS 0.01% 堿金屬鹽堿金屬鹽 1 M 甘油甘油 50000 ( ESI+, m/z=1222 )； 45000 ( ESI-, m/z=1334)MS質(zhì)量準(zhǔn)確度：質(zhì)量準(zhǔn)確度：優(yōu)于優(yōu)于0.8ppm (全掃描，全掃描，ESI+, m/z=1222，內(nèi)標(biāo)校正，內(nèi)標(biāo)校正)優(yōu)于優(yōu)于2ppm (全掃描，全掃描，ESI+, m/z=1222，外標(biāo)校正，外標(biāo)校正)MS/MS質(zhì)量準(zhǔn)確度：優(yōu)于質(zhì)量準(zhǔn)確度：優(yōu)于2ppm (外標(biāo)校正外標(biāo)校正)同位素豐度比：平均豐度比誤差小于同位素豐

41、度比：平均豐度比誤差小于2% (調(diào)諧標(biāo)樣調(diào)諧標(biāo)樣)掃描方式：一級質(zhì)譜全掃描掃描方式：一級質(zhì)譜全掃描(MS)，二級質(zhì)譜全掃描，二級質(zhì)譜全掃描(MS/MS)電噴霧源電噴霧源(ESI源源) 利用高電場使質(zhì)譜進(jìn)樣段的毛細(xì)管柱流出的液滴帶電，在N2氣流的作用下，液滴溶劑蒸發(fā)，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產(chǎn)生的庫倫斥力與液滴表面張力達(dá)到雷利極限，液滴爆裂為帶電的子液滴，這一過程不斷重復(fù)使最終的液滴非常細(xì)小呈霧滴狀，這時的液滴表面電場非常強(qiáng)大，使分析物離子化并以帶單電荷或多電荷的離子形式進(jìn)入質(zhì)量分析器。ESI源質(zhì)譜技術(shù)源質(zhì)譜技術(shù) 如果樣品具有容易接收如果樣品具有容易接收H+ 的功能團(tuán)的功能團(tuán) (例

42、例如如 氨基化合物、肽和蛋白質(zhì)上所帶的氨氨基化合物、肽和蛋白質(zhì)上所帶的氨基基) ，那么使用正離子檢測法。那么使用正離子檢測法。 如果樣品具有容易失去如果樣品具有容易失去H+ 的功能團(tuán)的功能團(tuán) (例例如如 羧酸、核酸和糖上所帶的羥基羧酸、核酸和糖上所帶的羥基) ，那那么使用負(fù)離子檢測法。么使用負(fù)離子檢測法。儀器功能及附件：儀器功能及附件：1) 離子源：配有離子源：配有ESI電噴霧電離源、電噴霧電離源、APCI大氣壓化學(xué)電離源、大氣壓化學(xué)電離源、nanoESI納納升電噴霧電離源升電噴霧電離源2) 戴安公司戴安公司U3000高效液相色譜儀，配有高效液相色譜儀，配有DAD二極管陣列檢測器，自動進(jìn)二極管

43、陣列檢測器，自動進(jìn)樣器，柱溫箱樣器，柱溫箱3) EASY-nLC納升液相色譜儀納升液相色譜儀應(yīng)用范圍：應(yīng)用范圍： 用于小分子有機(jī)化合物的定性分析，可提供精確質(zhì)荷比和同位素豐度，用于小分子有機(jī)化合物的定性分析，可提供精確質(zhì)荷比和同位素豐度，推算分子的原子組成；用于中等極性和強(qiáng)極性大分子物質(zhì)的定性分析，進(jìn)推算分子的原子組成；用于中等極性和強(qiáng)極性大分子物質(zhì)的定性分析，進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)等研究。行蛋白質(zhì)組學(xué)等研究。優(yōu)點(diǎn)：高采樣速率、高分辨率、高質(zhì)量準(zhǔn)確度、高質(zhì)量數(shù)優(yōu)點(diǎn)：高采樣速率、高分辨率、高質(zhì)量準(zhǔn)確度、高質(zhì)量數(shù)Multiply Charged IonsESI spectrum of HEW Lysozy

44、me（溶菌酶）溶菌酶）MW = 14,305.14大分子樣品會生成帶多種電荷大分子樣品會生成帶多種電荷 (from 2 to 20 )的樣品離子的樣品離子A亞型亞型MW= 18363.5024B亞型亞型MW=18277.4748A亞型亞型+B亞型亞型ESI圖譜可以靈敏地反映蛋白質(zhì)的構(gòu)造圖譜可以靈敏地反映蛋白質(zhì)的構(gòu)造Native AzurinDenatured Azurin 大部分折疊、拼接或復(fù)合的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜是非高斯分布大部分折疊、拼接或復(fù)合的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜是非高斯分布 的，在圖譜上只能觀察到少量的峰，代表較高的的，在圖譜上只能觀察到少量的峰，代表較高的m/z m/z 值。值。 變性或變性或op

45、en form open form 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)/ /多肽較容易離子化，其譜圖是多個高斯分布的峰。多肽較容易離子化，其譜圖是多個高斯分布的峰。膠和液相雜合分離路線膠和液相雜合分離路線影響影響ESI因素：因素：a) 樣品的樣品的pKa 和溶液的和溶液的pH。樣品在電噴霧溶液中是否已預(yù)先形成離子取。樣品在電噴霧溶液中是否已預(yù)先形成離子取決于樣品的決于樣品的pKa值。在低值。在低Ph值條件下有利于樣品分子質(zhì)子化，提高值條件下有利于樣品分子質(zhì)子化，提高pH導(dǎo)致靈敏度和分子所帶電荷的數(shù)目減少。在正離子檢測中，溶液導(dǎo)致靈敏度和分子所帶電荷的數(shù)目減少。在正離子檢測中，溶液pH應(yīng)應(yīng)較低，可用醋酸、三氟乙酸較低，可用醋酸、三氟乙酸(TFA)調(diào)節(jié)。溶液調(diào)節(jié)。溶液pH通常至少低于樣品的通常至少低于樣品的pKa 2個單位。在負(fù)離子檢測中，溶液個單位。在負(fù)離子檢測中，溶液pH應(yīng)較高，可用氨水調(diào)節(jié)，使應(yīng)較高，可用氨水調(diào)節(jié)，使溶液溶液pH比樣品比樣品pKa高高2個單位。個單位。b) 溶劑的性質(zhì)。溶劑應(yīng)具有較低的汽化點(diǎn)，有較低的黏度和表面張力。溶劑的性質(zhì)。溶劑應(yīng)具有較低的汽化點(diǎn)，有較低的黏度和表面張力。常用的常用的ESI溶劑有醇類、乙腈、丙酮、水等。常用混合溶劑及添加劑，溶劑有醇類、