酶工程學-第十三、十四周固定化

1、酶工程學酶工程學Enzyme Engineering第十十一周學習內(nèi)容學習內(nèi)容l緒論(第一章)第一章第一章酶工程學酶工程學l酶的生產(chǎn)l酶的改性l酶的應(yīng)用酶生物合成的基本理論(第二章)酶的生物合成法(第三章)酶的提取與分離純化(第四章)酶改性的基本理論(第五章)酶分子修飾(第六章)酶固定化酶固定化(第七章)酶的非水相催化(第八章)酶應(yīng)用的基本理論(第九章)酶反應(yīng)器的應(yīng)用(第十章)酶的應(yīng)用領(lǐng)域(第十一章)第七章第七章 酶固定化酶固定化Immobilized Enzyme l第一節(jié)第一節(jié) 概述概述l第二節(jié)第二節(jié) 固定化酶的性質(zhì)及其影響因素固定化酶的性質(zhì)及其影響因素l第三節(jié)第三節(jié) 固定化酶的制備固定化

2、酶的制備l第四節(jié)第四節(jié) 固定化細胞固定化細胞l第五節(jié)第五節(jié) 固定化輔酶和原生質(zhì)體固定化輔酶和原生質(zhì)體l第六節(jié)第六節(jié) 酶反應(yīng)器和固定化酶（細胞）的應(yīng)用酶反應(yīng)器和固定化酶（細胞）的應(yīng)用內(nèi)容提要內(nèi)容提要生物催化劑生物催化劑細胞細胞酶酶非生長非生長生長生長可溶可溶固定化固定化懸浮懸浮固定化固定化連續(xù)連續(xù)間歇間歇吸附吸附包埋包埋交聯(lián)交聯(lián)化學連續(xù)化學連續(xù)材料材料膜固定膜固定酶液酶液凝膠凝膠吸附吸附化學連接物化學連接物固定化固定化再循環(huán)系統(tǒng)再循環(huán)系統(tǒng)凝膠凝膠吸附吸附連續(xù)連續(xù)半連續(xù)半連續(xù)分批分批間歇間歇 連續(xù)連續(xù)活塞模式活塞模式攪拌連續(xù)反應(yīng)器攪拌連續(xù)反應(yīng)器間歇間歇連續(xù)連續(xù)活塞模式活塞模式攪拌連續(xù)反應(yīng)器攪拌連續(xù)

3、反應(yīng)器圖6-1 生物催化劑作用方式示意第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述游離酶的缺點：游離酶的缺點：1.酶的穩(wěn)定性較差，在溫度、pH、和無機離子等外界因素的影響下，容易變性失活。2.酶一般都是在水溶液中與底物反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后酶難以回收。 3.反應(yīng)結(jié)束后，酶成為產(chǎn)物的雜質(zhì)。固定化酶：固定化酶：l固定化酶是指固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進行催化反應(yīng)的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，具有增強穩(wěn)定性，可反復(fù)或連續(xù)使用以及易于和反應(yīng)產(chǎn)物分開等顯著特點。直接固定菌體或菌體碎片的，稱為固定化菌體或固定化死細胞。水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)固定化酶的優(yōu)缺點固定化酶

4、的優(yōu)缺點 多次使用 可以裝塔連續(xù)反應(yīng)優(yōu)點： 純化簡單 提高產(chǎn)物質(zhì)量 應(yīng)用范圍廣缺點： 首次投入成本高 大分子底物較困難第二第二 節(jié)節(jié) 固定化酶的制備固定化酶的制備一、 一般方法及特點二、 酶的固定化方法一、一、 選擇方法依據(jù)：選擇方法依據(jù)： （1） 酶的性質(zhì)（2） 載體的性質(zhì)（3） 制備方法的選擇二、二、 酶的固定化方法酶的固定化方法（一） 吸附法（二）結(jié)合法（三）交聯(lián)法（四） 包埋法（一）（一） 吸附法吸附法1. 物理吸附：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上。選擇載體的原則： （1）要有巨大的比表面積 （2） 要有活潑的表面 （3） 便于裝柱進行連續(xù)反應(yīng)。常用載體：活性炭、氧化鋁

5、、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石優(yōu)點：缺點：結(jié)合力不勞、容易脫落。 吸附法常用的載體及優(yōu)、缺點操作簡單、條件溫和、載體廉價易得、可反復(fù)使用。 （二）結(jié)合法（二）結(jié)合法l離子鍵結(jié)合法l共價鍵結(jié)合法定義：選擇適宜載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法稱為結(jié)合法。1. 離子鍵結(jié)合法離子鍵結(jié)合法l概念：通過共價鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法。 l常用載體:DEAE-纖維素， DEAE-葡聚糖凝膠l使用注意：pH、離子強度、溫度+ +-+2. 共價鍵結(jié)合法共價鍵結(jié)合法l概念：通過共價鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法。 l可以形成共價鍵的基團： 游離氨基， 游離羧基， 巰基， 咪唑

6、基， 酚基， 羥基， 甲硫基， 吲哚基，二硫鍵l常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無機載體共價鍵結(jié)合法制備固定化酶的共價鍵結(jié)合法制備固定化酶的“通式通式”l首先載體上引進活潑基團 l 然后活化該活潑基團l 最后此活潑基團再與酶分子上某一基團形成共價鍵載體活化的方法載體活化的方法A重氮法B疊氮法C烷基化反應(yīng)法D硅烷化法E溴化氰法A重氮法重氮法反應(yīng)式： l目前在我們國內(nèi)用的較多的載體：l該方法需要載體具有芳香族氨基氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素瓊脂糖葡聚糖凝膠瓊脂l反應(yīng)式及原理B 疊氮法疊氮法例：用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶步驟如下：l酯化l肼解l疊氮化l偶聯(lián)C烷基化反應(yīng)法烷

7、基化反應(yīng)法l含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進行活化，形成含有鹵素基團的活化載體。D硅烷化法硅烷化法l載體特點：機械強度好，表面積大。耐有機溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長等。 l常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。E 溴化氰法溴化氰法l本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類物質(zhì)。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）。用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。（三）（三） 交聯(lián)法交聯(lián)法l定義：借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。1.

8、 交聯(lián)法常用試劑交聯(lián)法常用試劑戊二醛己二胺順丁烯二酸酐雙偶氮苯4,4-雙(二甲氨基)偶氮苯2. 交聯(lián)法的形式交聯(lián)法的形式l交聯(lián)法有2種形式：酶直接交聯(lián)法酶輔助蛋白交聯(lián)法l酶直接交聯(lián)法：在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強度、溫度和反應(yīng)時間之間的平衡。EEEEEEl酶輔助蛋白交聯(lián)法：為避免分子內(nèi)交聯(lián)和在交聯(lián)過程中因化學修飾而引起酶失活，可使用第二個載體蛋白質(zhì)（即輔助蛋白質(zhì)，如白蛋白、明膠、血紅蛋白等）來增加蛋白質(zhì)濃度，使酶與惰性蛋白質(zhì)共交聯(lián)。EEE（四）（四） 包埋法包埋法l定義：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋

9、法。瓊脂瓊脂糖海藻酸鈉角叉菜膠明膠聚丙烯酰胺 l載體：1網(wǎng)格型網(wǎng)格型定義：將酶或含酶菌體包埋在凝膠細微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱為凝膠包埋法。2微囊型包埋法微囊型包埋法定義：將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。 微囊化法制備固定化酶有兩種方法微囊化法制備固定化酶有兩種方法l界面沉淀法：利用某些高聚物在水相和有機相的界面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。l界面聚合法：是用化學手段制備微囊的方法。利用油水界面上發(fā)生聚合反應(yīng)形成聚合體而將酶包裹起來。癸二酰氯，氯仿癸二酰氯，氯仿酶，酶

10、， 水，水，乙二胺乙二胺第三節(jié)第三節(jié) 固定化酶的性質(zhì)及其影響因素固定化酶的性質(zhì)及其影響因素一、 影響固定化酶性質(zhì)的因素二、固定化后酶性質(zhì)的變化三、 評價固定化酶的指標一、一、 影響固定化酶性質(zhì)的因素影響固定化酶性質(zhì)的因素1 酶本身的變化，主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化。2 載體的影響（1） 分配效應(yīng)（2） 空間障礙效應(yīng)（3） 擴散限制效應(yīng)3. 固定化方法的影響二、固定化后酶性質(zhì)的變化二、固定化后酶性質(zhì)的變化1 固定化對酶活性的影響：酶活性下降，反應(yīng)速度下降固定化對酶活性的影響：酶活性下降，反應(yīng)速度下降原因：酶結(jié)構(gòu)的變化 空間位阻2 固定化對酶穩(wěn)定性的影響固定化對

11、酶穩(wěn)定性的影響（1） 操作穩(wěn)定性提高（2） 貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。（3）對熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低。（4 ）對分解酶的穩(wěn)定性提高。（5）對變性劑的耐受力升高三、固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因三、固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因l固定化后酶分子與載體多點連接。l酶活力的釋放是緩慢的。l抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。四、四、 pH的影響的影響 （一）（一）pH對酶活性的影響：對酶活性的影響：（1） 改變酶的空間構(gòu)象（2）影響酶的催化基團的解離（3）影響酶的結(jié)合基團的解離（4）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。（二）（二）pH對固定化酶的影響對固定化酶的影響1. 載體帶

12、負電荷，pH向堿性方向移動。2. 載體帶正電荷，pH向酸性方向移動。 微環(huán)境是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，而把主體溶液稱為宏觀環(huán)境。l催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高。l催化反應(yīng)的產(chǎn)物為堿性時，固定化酶的pH值比游離酶的pH值低。（三）產(chǎn)物性質(zhì)對體系（三）產(chǎn)物性質(zhì)對體系pH的影響的影響（四）（四） 最適溫度變化最適溫度變化l作用于低分子底物的酶，特異性沒有明顯變化l既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶，特異性往往會變化。l一般與游離酶差不多，但有些會有較明顯的變化。（五）底物特異性變化（五）底物特異性變化（六）米氏常數(shù)（六）米氏常數(shù)Km的變化，的變化，Km值隨

13、載體性質(zhì)變化值隨載體性質(zhì)變化（1） 載體與底物帶相同電荷，KmKm固定化酶降低了酶的親和力。（2） 載體與底物電荷相反，靜電作用，Km120.3-615營養(yǎng)要求簡單簡單復(fù)雜光照要求大多數(shù)要光照不要求不要求對剪切力敏感大多數(shù)不敏感敏感主要產(chǎn)物色素、藥物、香精、酶等醇、有機酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶疫苗、激素、抗體、酶固定化細胞固定化細胞l定義：固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動的細胞稱為固定化細胞.該細胞能進行正常的生長、繁殖和新陳代謝，又稱固定化活細胞或固定化增殖細胞。固定化細胞的特點固定化細胞的特點l類型：微生物細胞、植物細胞、動物細胞l生理狀態(tài)：死細胞（完整細胞、細胞碎片、細

14、胞器） 活細胞（增殖細胞、靜止細胞、完整細胞）l形狀：顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則形狀。 l使用周期：理論上講，固定化增殖細胞保持了細胞原有的全部活性， 只要載體不解體，不污染就可以長期使用。細胞固定化方法細胞固定化方法l吸附法l包埋法吸附法吸附法l定義：通過載體與細胞間的靜電引力，即細胞表面與載體之間范德華作用力，離子鍵和氫鍵作用力，才使細胞固定在載體上的。 pH35- - - -+影響吸附法的主要因素影響吸附法的主要因素 lZ-電位： Z-電位能近似地代表表面電荷密度的大小l細胞的性質(zhì)和細胞壁的組成：細胞壁的電荷性質(zhì)l載體的性質(zhì)：特別是玻璃、陶瓷等無機材料包埋固定法包埋固定法 l包理

15、法是在細胞自身并不與凝膠基體發(fā)生化學鍵合的情況下將其包埋在半透性聚合物顆粒（或膜）內(nèi)的一種固定化方法。包埋法的最大優(yōu)點是能較好的保持細胞內(nèi)多酶系統(tǒng)的活力，可象游離細胞那樣進行產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)。 包埋法常用載體：包埋法常用載體：l瓊脂l海藻酸鈣l角叉菜膠l明膠l聚丙烯酰胺舉例：海藻酸鈣包埋法舉例：海藻酸鈣包埋法l基本原理是：稱取一定量的海藻酸鈉配成水溶液，經(jīng)殺菌冷卻后，與一定體積的細胞或孢子懸浮液混合均勻，然后用注射器或滴管將冷懸液滴入一定濃度的凝固浴中（常用CaCl2 溶液），形成球狀固定化細胞。研究熱點研究熱點光交聯(lián)樹脂包埋法光交聯(lián)樹脂包埋法 l例：相對分子量為1000-3000的光交聯(lián)聚氨酯

16、預(yù)聚物等，加入1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50，然后與一定濃度的細胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外照射3min，就可制得。第五節(jié)第五節(jié) 固定化原生質(zhì)體和輔酶固定化原生質(zhì)體和輔酶一、原生質(zhì)體的制備二、固定化三、輔酶固定化一、原生質(zhì)體的制備一、原生質(zhì)體的制備l將對數(shù)生長期的細胞收集懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中加入水解酶分離得到原生質(zhì)體二、原生質(zhì)體固定化的方法二、原生質(zhì)體固定化的方法l將原生質(zhì)替制備好后，把離心收集到的原生質(zhì)體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中，配成一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液，然后采用包埋法制成固定化原生質(zhì)體。三、輔酶固定化三、輔酶固定化l原因l有機

17、輔因子中具有某些特殊的化學基團，參與酶的催化反應(yīng)l有機輔因子在使用過程中要流失，并且不能自行再生l有機輔因子價格昂貴l工業(yè)上應(yīng)用全酶的關(guān)鍵是有機輔因子的保留和再生輔酶固定化的方法輔酶固定化的方法l固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M行適當?shù)幕瘜W修飾后固定在超濾器中。l輔酶固定化必須解決輔酶在多個酶之間傳遞的障礙。 輔酶的固定化輔酶的固定化輔酶固定化的形式輔酶固定化的形式第六節(jié)第六節(jié) 酶反應(yīng)器和固定化酶（細胞）的應(yīng)用酶反應(yīng)器和固定化酶（細胞）的應(yīng)用 l酶反應(yīng)器介紹l反應(yīng)器選擇的依據(jù)l反應(yīng)器和酶穩(wěn)定性l固定化酶和細胞的應(yīng)用（工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、分析化學、酶電

18、極、親和色譜、環(huán)境保護、能源開發(fā)、基礎(chǔ)理論研究）一、酶反應(yīng)器一、酶反應(yīng)器1 分批攪拌反應(yīng)器。2 連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器。3 連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器4 填充床反應(yīng)器5 循環(huán)反應(yīng)器6 流化床反應(yīng)器 定義：用于各種酶進行催化反應(yīng)的容器及其附屬設(shè)備。類型：1 分批攪拌反應(yīng)器分批攪拌反應(yīng)器l反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡單，不需要特殊裝置，適與小規(guī)模試驗2 連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器3 連續(xù)攪拌桶連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器超濾反應(yīng)器酶循環(huán)4 填充床反應(yīng)器填充床反應(yīng)器5 循環(huán)反應(yīng)器循環(huán)反應(yīng)器6 流化床反應(yīng)器流化床反應(yīng)器l與連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器類似，是讓適量的顆粒狀酶懸浮于反應(yīng)床中，不用攪拌器，而是底物向上流過固定酶床，因

19、此流速要適當控制。反應(yīng)器選擇反應(yīng)器選擇l酶的形式：l底物的物理性質(zhì)：l酶反應(yīng)動力學l酶的穩(wěn)定性l操作要求、應(yīng)用和可塑性成本反應(yīng)器和酶的穩(wěn)定性反應(yīng)器和酶的穩(wěn)定性l反應(yīng)器中酶催化活性損失的原因：l酶本身失效l酶從載體上脫落l載體肢解l擴散限制效應(yīng)二、固定化酶（細胞）的應(yīng)用二、固定化酶（細胞）的應(yīng)用1. 固定化酶（細胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用2 固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用3 固定化酶在分析化學中應(yīng)用4 固定化酶和親和色譜5 固定化酶與環(huán)境保護6 新能源開發(fā)中的應(yīng)用7 固定化酶在基礎(chǔ)理論研究中應(yīng)用1 固定化酶（細胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用固定化酶（細胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用l葡萄糖異構(gòu)酶世界上生產(chǎn)規(guī)模最大

20、的一種固定化酶。l利用固定化乳糖酶可以連續(xù)生產(chǎn)低乳糖奶l固定化酵母細胞等微生物可用于生產(chǎn)各種酒類l熱點：固定化原生質(zhì)體的應(yīng)用2 固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用l例1l固定化青霉素?；?，只要改變pH值等條件，就可以生成不同的產(chǎn)物。青霉素?；复呋铣深^孢類抗生素青霉素?；复呋铣深^孢類抗生素OH2NR2R1NH2NSOOOHNR1NH2NSOOO OHH1: D-(-)-PGA (R1 = H, R2 = NH2)2: D-(-)-PGM (RI = H, R2 = OMe)3. D-(-)-HPGA (R1 = OH, R2 = NH2)4: D-(-)-HPGM (

21、R1 = H, R2 = OMeH2OPenicillin G acylase+Ampicillin (RI = H)Amoxicillin (R1 = OH) 7-ACA as nucleusR2R1NH2NSNNSR3R1OOOOOOH2NNH2OHR3HOH+Penicillin G acylaseH2O7-ACCA (R3 = Cl)7-ADCA (R3 = Me)Cefaclor (R1 = H, R3 = Cl)Cephalexin (R1 = H, R3 = Me)Cefadroxil ( R1 = OH, R3 = Me)7-ACCA or 7-ADCA as nucleusl - Reversible reaction l - Hydrolysis of substrate or product by biocatalystl - Difficulty of separation of product from reactantsCHCOOCH3NH2CHCOOHNH2CHCONHNSOCOOHCH3NH2H2NNSOCOOHCH3+H2NNSOCOOHCH3+Esterase HydrolaseSynthetasel例2：制造人工腎l利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的