朱明華版儀器分析HPLC

1、高效液相色譜簡(jiǎn)介（HPLC）是以是以氣相色譜氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)上，采用礎(chǔ)上，采用顆粒十分細(xì)的固定相顆粒十分細(xì)的固定相，并采用，并采用高壓泵輸送高壓泵輸送流動(dòng)相流動(dòng)相而建立的一種液相色譜法。而建立的一種液相色譜法。HPLC的突出特點(diǎn)：的突出特點(diǎn)： 1）高壓）高壓; 2）高速）高速; 3）高效）高效; 4）高靈敏度）高靈敏度(10-9); 5）高選擇性）高選擇性;HPLC的的應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍：溶解后能制成溶液的溶解后能制成溶液的樣品樣品，不受，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，分子量大、難氣化、樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，分子量大、難氣化、

2、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測(cè)，用途廣熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測(cè)，用途廣泛，占有機(jī)物的泛，占有機(jī)物的80%。GC與與LC的比較的比較HPLC系統(tǒng)溶劑傳輸系統(tǒng)：心臟高壓泵樣品引入系統(tǒng)：自動(dòng)購(gòu)置進(jìn)樣器樣品分離系統(tǒng)：關(guān)鍵色譜柱信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)：檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：軟件泵的基本原理（高壓泵.swf）往復(fù)活塞泵(單向閥)彈簧隔板/紅寶石球串聯(lián)柱塞泵消除流量脈沖 并聯(lián)柱塞泵減小流量脈沖 儀器：手動(dòng)進(jìn)樣器-六通閥/定量環(huán) （LC.swf）六通閥定量環(huán)高壓定量進(jìn)樣閥：高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置。優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)樣準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，適于定量分析。儀器：自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣100樣品盤/機(jī)

3、器手/自動(dòng)洗針機(jī)械手樣品盤色譜柱：柱溫箱、色譜柱外掛架柱溫箱外掛架儀器：檢測(cè)器-紫外UV/Vis雙燈，全波長(zhǎng)檢測(cè)檢測(cè)器流路儀器：檢測(cè)器-其它儀器：化學(xué)工作站進(jìn)樣器高壓泵流動(dòng)相色譜柱檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理流動(dòng)相HPLC流動(dòng)相除了起運(yùn)載流動(dòng)相除了起運(yùn)載作用外，還直接參與分離，作用外，還直接參與分離，影響明顯。影響明顯。 鹽的影響：鹽的影響： 通常加入醋酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽等。無(wú)機(jī)鹽使通常加入醋酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽等。無(wú)機(jī)鹽使流動(dòng)相表面張力增大，對(duì)非離子性溶質(zhì)，使流動(dòng)相表面張力增大，對(duì)非離子性溶質(zhì)，使k增加，增加，對(duì)離子型溶質(zhì)，對(duì)離子型溶質(zhì)，k下降。對(duì)堿性有機(jī)物有改善峰形下降。對(duì)堿性有機(jī)物有改善峰形的作用。

4、的作用。 pH值：值： 加入酸、堿或緩沖液，控制加入酸、堿或緩沖液，控制PH，抑制溶質(zhì)的離子，抑制溶質(zhì)的離子化，改善峰形。用于分析弱酸、堿?；?，改善峰形。用于分析弱酸、堿。流動(dòng)相單組分（一種溶劑）和多組分；單組分（一種溶劑）和多組分；極性、弱極性、非極性；極性、弱極性、非極性；固定組成洗脫和梯度洗脫；固定組成洗脫和梯度洗脫；用用二二元或元或三三元組合溶劑元組合溶劑靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或或增加選擇性增加選擇性，改進(jìn)分，改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。離或調(diào)整出峰時(shí)間。無(wú)水正庚烷無(wú)水正庚烷含水正庚烷含水正庚烷水飽和正庚烷水飽和正庚烷色譜柱色譜柱C18流動(dòng)相常用作流動(dòng)相的溶劑有：乙腈、甲

5、醇、乙腈 水、甲醇-水、四氫呋喃、氯仿、正己烷等。乙腈的毒性、成本均高于甲醇，在等度淋洗時(shí)一般選用甲醇-水體系。乙腈-水比較適合梯度洗脫，而甲醇-水系統(tǒng)出于熱力學(xué)和可壓縮性因素，在梯度洗脫時(shí)易導(dǎo)致基線漂移。梯度洗提(脫)梯度洗脫即程序控制流動(dòng)相的組成，使在整個(gè)分離過(guò)程中，溶劑強(qiáng)度按照特定的變化規(guī)律增加。優(yōu)點(diǎn)：分離復(fù)雜混合物，使所有組分都處在最佳的k值范圍內(nèi)。缺點(diǎn)：檢測(cè)器的使用受到限制，分析結(jié)果的重復(fù)性取決于流速的穩(wěn)定性。柱子需進(jìn)行再生處理。與氣相色譜中的程序升溫相當(dāng) 對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（相，即流動(dòng)相的極性小于固定液

6、的極性（正正相相 normal phase色譜），反之，流動(dòng)相的極色譜），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（性大于固定液的極性（反相反相 reverse phase色色譜）。譜）。為什么？化學(xué)鍵合相色譜優(yōu)點(diǎn)：有較好的分離效果；優(yōu)點(diǎn)：有較好的分離效果；缺點(diǎn)：固定液流失，使柱效和分離選擇性下降缺點(diǎn)：固定液流失，使柱效和分離選擇性下降產(chǎn)生基線噪聲而降低檢測(cè)器的靈敏度。不適用產(chǎn)生基線噪聲而降低檢測(cè)器的靈敏度。不適用于梯度洗脫操作。于梯度洗脫操作。*化學(xué)鍵合相色譜法化學(xué)鍵合相色譜法* 為了解決固定液的流失問(wèn)題，人們將各種不為了解決固定液的流失問(wèn)題，人們將各種不同的有機(jī)官能團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵合到硅同的

7、有機(jī)官能團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵合到硅膠膠( (載體載體) )表面的游離羥基上，而生成化學(xué)鍵表面的游離羥基上，而生成化學(xué)鍵合固定相，并進(jìn)而發(fā)展成鍵合相色譜法。合固定相，并進(jìn)而發(fā)展成鍵合相色譜法。 特點(diǎn)：化學(xué)鍵合固定相對(duì)各種極性溶劑都有特點(diǎn)：化學(xué)鍵合固定相對(duì)各種極性溶劑都有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。由它制備的良好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。由它制備的色譜柱色譜柱柱效高、使用壽命長(zhǎng)、重現(xiàn)性好，幾柱效高、使用壽命長(zhǎng)、重現(xiàn)性好，幾乎對(duì)各種類型的有機(jī)化合物都呈現(xiàn)良好的選乎對(duì)各種類型的有機(jī)化合物都呈現(xiàn)良好的選擇性，特別適用于具有寬范圍擇性，特別適用于具有寬范圍k k值的樣品的值的樣品的分離，并可用于梯度洗脫操作

8、。分離，并可用于梯度洗脫操作。 根據(jù)鍵合固定相與流動(dòng)相相對(duì)極性的強(qiáng)弱，根據(jù)鍵合固定相與流動(dòng)相相對(duì)極性的強(qiáng)弱，該法分為正相鍵合相色譜法和反相鍵合相色該法分為正相鍵合相色譜法和反相鍵合相色譜法。在前者中，鍵合固定相的極性譜法。在前者中，鍵合固定相的極性大于大于流流動(dòng)相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的動(dòng)相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性和強(qiáng)極性化合物。在后者中，鍵合固定極性和強(qiáng)極性化合物。在后者中，鍵合固定相的極性相的極性小于小于流動(dòng)相的極性，適于分離非極流動(dòng)相的極性，適于分離非極性、極性或離子型化合物。據(jù)統(tǒng)計(jì)在高效液性、極性或離子型化合物。據(jù)統(tǒng)計(jì)在高效液相色譜法中，約相色譜法中，約7070

9、8080的分析任務(wù)皆的分析任務(wù)皆由反相鍵合相色譜法來(lái)完成的。由反相鍵合相色譜法來(lái)完成的。反相反相HPLC 極性極性:固定相固定相 流動(dòng)相流動(dòng)相 固定相固定相 - 極性極性 流動(dòng)相流動(dòng)相(己烷己烷, 庚烷庚烷)- 非極性非極性 極性物質(zhì)后出峰極性物質(zhì)后出峰正相色譜正相色譜 20%反相色譜反相色譜80%正相色譜正相色譜 20%反相色譜反相色譜80%正己烷/異丙醇（v/v）：70/30；80/20；90/10；95/5 正相正相HPLC為什么反相色譜應(yīng)用如此廣泛?它能使中性化合物和極性化合物在一根色譜柱中得到分離。適用于多種基體中的多類不同性質(zhì)化合物的測(cè)定和分離。保留時(shí)間可以用分子的疏水性進(jìn)行描述和

10、解釋。 所用高純度的水、甲醇和乙腈等溶劑價(jià)格便宜、實(shí)用。選擇性可通過(guò)用緩沖溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)（通過(guò)調(diào)節(jié)pH值來(lái)調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度和膠團(tuán)粒子大小等等），以實(shí)現(xiàn)最佳分離。固定相-填充材料液相色譜柱填料盡管有有機(jī)高分液相色譜柱填料盡管有有機(jī)高分子、石墨化碳、氧化鋁、氧化鈦，氧子、石墨化碳、氧化鋁、氧化鈦，氧化鋯等，但多以全多孔硅膠作基質(zhì)。化鋯等，但多以全多孔硅膠作基質(zhì)。 烷基鍵合固定相特性對(duì)保留值的影響：烷基鍵合固定相特性對(duì)保留值的影響： 反相：鍵合相烷鏈長(zhǎng)，反相：鍵合相烷鏈長(zhǎng)，k大，選擇性好。大，選擇性好?，F(xiàn)代高效液相色譜柱的要求1.超純 B 型球形硅膠 峰形好、柱效高。2.不能有使色譜性能降低的直徑小于50

11、 的微孔。3.粒徑尺寸從 3 m 到 10 m 能滿足從分析到制備色譜規(guī)模的需求。 4.色譜柱柱床裝填好 使用壽命長(zhǎng)、柱效高。5.封尾徹底 峰形好、使用壽命長(zhǎng)。6.批與批之間得重現(xiàn)性好。7.不同的相具有不同的選擇性 能更好的實(shí)現(xiàn)分離。8.鍵合相化學(xué)穩(wěn)定好 適用的 pH 范圍廣, 使用壽命長(zhǎng)。HPLC 色譜柱結(jié)構(gòu)類 型內(nèi)徑D (cm)柱長(zhǎng)(cm)粒徑 (m)分析柱0.3 0.463 - 253 - 10微孔柱0.1, 0.2115, 253 - 8半制備柱0.8 1.010 - 255 - 20制備柱2.0 5.010 - 255 - 20HPLC在醫(yī)藥方面的應(yīng)用1、新藥研發(fā)：目標(biāo)物的檢測(cè)、純度

12、等2、藥品的預(yù)處理：片劑，油膏，水劑等3、體液：血、尿、脊椎液、唾液等4、抗菌素 ：青霉素 、甾族(激素)等 5、其它HPLC在環(huán)保方面的應(yīng)用1、農(nóng)藥殘留量分析 ：含氯農(nóng)藥 、有機(jī)磷 農(nóng)藥 、除蟲(chóng)菊等2、致癌物質(zhì) ：硝基呋喃及其代謝物、霉 素 、亞硝胺、苯并芘等3、水質(zhì)分析：內(nèi)分泌污染物等4、其它HPLC在生化方面的應(yīng)用1、蛋白質(zhì)分析2、肽類的分析3、核酸4、氨基酸 5、其它手性的普遍性及在醫(yī)藥中的重要性手性的普遍性及在醫(yī)藥中的重要性n手性的發(fā)現(xiàn)和普遍存在手性的發(fā)現(xiàn)和普遍存在nPasteur（1848年外消旋酒石酸鈉銨鹽晶體）n實(shí)物與鏡像不重合n蛋白質(zhì)、核酸等n手性化合物的性質(zhì)手性化合物的性質(zhì) (旋光、手性環(huán)境)n反應(yīng)停事件（反應(yīng)停事件（20世紀(jì)六十年代）世紀(jì)六十年代）u1956年，聯(lián)邦