選DNA重組技術(shù)的基本工具

1、基因工程基因工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程（克隆技術(shù)）（克隆技術(shù)）胚胎工程胚胎工程生態(tài)工程生態(tài)工程生物技術(shù)的安全性和倫理問(wèn)題生物技術(shù)的安全性和倫理問(wèn)題選修選修3 3 現(xiàn)代生物科技專(zhuān)題現(xiàn)代生物科技專(zhuān)題基本原理基本原理 應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例選修選修3 3具體內(nèi)容要求標(biāo)準(zhǔn)具體內(nèi)容要求標(biāo)準(zhǔn)特點(diǎn)：特點(diǎn)： 知識(shí)性目標(biāo)：以知識(shí)性目標(biāo)：以了解水平了解水平為主；為主； （“簡(jiǎn)述簡(jiǎn)述” ” 、“舉例說(shuō)出舉例說(shuō)出”）情感性目標(biāo)：以情感性目標(biāo)：以感受水平感受水平為主；為主； （“關(guān)注關(guān)注”）技能性目標(biāo)：以技能性目標(biāo)：以資料收集、交流討論資料收集、交流討論 為主。為主?；蚬こ陶Q生的基因工程誕生的技術(shù)突破技術(shù)突破1. 1. 基因轉(zhuǎn)移

2、載體的發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)19671967年，羅斯年，羅斯(Roth)(Roth)、赫林斯基赫林斯基( (HrlinskiHrlinski) ) 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌擬核細(xì)菌擬核DNADNA之外的之外的質(zhì)粒有自我復(fù)制能力，質(zhì)粒有自我復(fù)制能力，并可以在細(xì)菌細(xì)胞間并可以在細(xì)菌細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，此發(fā)現(xiàn)為基因轉(zhuǎn)移，此發(fā)現(xiàn)為基因轉(zhuǎn)移找到了一種運(yùn)載工具。轉(zhuǎn)移找到了一種運(yùn)載工具。限制酶限制酶19701970年，史密斯年，史密斯H.C. H.C. SmithSmith等分離出第一種等分離出第一種限制性限制性（核酸）（核酸）內(nèi)切酶內(nèi)切酶。19781978年年 NobelNobel 生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)基因工程誕生的基因

3、工程誕生的技術(shù)突破技術(shù)突破2. 2. 工具酶的發(fā)現(xiàn)工具酶的發(fā)現(xiàn)基因工程誕生的基因工程誕生的技術(shù)突破技術(shù)突破2. 2. 工具酶的發(fā)現(xiàn)工具酶的發(fā)現(xiàn)DNADNA連接酶連接酶19671967年，年，5 5個(gè)實(shí)驗(yàn)室個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)了DNADNA連接酶。連接酶。這些發(fā)現(xiàn)，為這些發(fā)現(xiàn)，為DNADNA的切割、連的切割、連接及功能基因的接及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件獲得創(chuàng)造了條件19751975年，英國(guó)弗雷德里克年，英國(guó)弗雷德里克桑格桑格F. F. SangerSanger和美國(guó)沃爾特和美國(guó)沃爾特吉爾伯特吉爾伯特W. W. GilbertGilbert分別發(fā)明了分別發(fā)明了DNADNA快速測(cè)序技術(shù)

4、快速測(cè)序技術(shù)19801980年年NobelNobel化學(xué)獎(jiǎng)化學(xué)獎(jiǎng)基因工程誕生的基因工程誕生的技術(shù)突破技術(shù)突破3. DNA3. DNA測(cè)序、合成技術(shù)的發(fā)明測(cè)序、合成技術(shù)的發(fā)明19751975年，英國(guó)弗雷德里克年，英國(guó)弗雷德里克桑格桑格F. F. SangerSanger和美國(guó)沃爾特和美國(guó)沃爾特吉爾伯特吉爾伯特W. W. GilbertGilbert分別發(fā)明了分別發(fā)明了DNADNA快速測(cè)序技術(shù)快速測(cè)序技術(shù)基因工程誕生的基因工程誕生的技術(shù)突破技術(shù)突破3. DNA3. DNA測(cè)序、合成技術(shù)的發(fā)明測(cè)序、合成技術(shù)的發(fā)明之后，人們又發(fā)明了之后，人們又發(fā)明了DNADNA合成儀。合成儀。19801980年年No

5、belNobel化學(xué)獎(jiǎng)化學(xué)獎(jiǎng)19721972年，斯坦福大學(xué)的伯格年，斯坦福大學(xué)的伯格P.BergP.Berg小組完小組完成了首次體外重組實(shí)驗(yàn)成了首次體外重組實(shí)驗(yàn)開(kāi)創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)開(kāi)創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)將猿猴病毒將猿猴病毒SV40SV40的的DNADNA片斷片斷 與與 噬菌體噬菌體的的DNADNA片斷連接起來(lái)。片斷連接起來(lái)。誕生了世界上第一誕生了世界上第一個(gè)人工個(gè)人工DNADNA重組產(chǎn)物。重組產(chǎn)物?；蚬こ陶Q生的基因工程誕生的技術(shù)突破技術(shù)突破4. DNA4. DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)體外重組的實(shí)現(xiàn)19731973年，斯坦福大學(xué)的博耶年，斯坦福大學(xué)的博耶H.BoyerH.Boyer、科恩科恩S. CohenS. Cohe

6、n將含有將含有卡那霉素抗性卡那霉素抗性基基因的大腸桿菌因的大腸桿菌R6-5R6-5質(zhì)粒與含有質(zhì)粒與含有四環(huán)素四環(huán)素抗性抗性基因的另一種大腸桿菌質(zhì)粒基因的另一種大腸桿菌質(zhì)粒pSC101pSC101連接成連接成重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒，具有，具有雙重抗雙重抗藥性藥性。基因工程誕生的基因工程誕生的技術(shù)突破技術(shù)突破2. Boyer-Cohen2. Boyer-Cohen實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)重組重組DNADNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功后來(lái)，又把后來(lái)，又把非洲爪蟾非洲爪蟾的核糖體基因片的核糖體基因片斷同斷同pSC101pSC101質(zhì)粒重組質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)入大腸桿菌轉(zhuǎn)入大腸桿菌，并在菌體內(nèi)并在菌體內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的成功轉(zhuǎn)錄出相

7、應(yīng)的mRNAmRNA。這是第一次成功的基因克隆實(shí)驗(yàn)。這是第一次成功的基因克隆實(shí)驗(yàn)?；蚬こ陶Q生的基因工程誕生的技術(shù)突破技術(shù)突破2. Boyer-Cohen2. Boyer-Cohen實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)重組重組DNADNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功19861986年年 Nobel Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)基因工程的概念基因工程的概念原理：原理：1.基因是什么？（獲取目的基因的前提）基因是什么？（獲取目的基因的前提）基因是獨(dú)立的有遺傳效應(yīng)的基因是獨(dú)立的有遺傳效應(yīng)的DNA片段片段2.不同生物的基因?yàn)槭裁茨芷唇樱坎煌锏幕驗(yàn)槭裁茨芷唇?？從基因結(jié)構(gòu)的共性分析從基因結(jié)構(gòu)的共性分析 共同的雙螺旋結(jié)構(gòu)共

8、同的雙螺旋結(jié)構(gòu)3.同一基因在不同生物的細(xì)胞內(nèi)為什么能同一基因在不同生物的細(xì)胞內(nèi)為什么能表達(dá)出相同的蛋白質(zhì)？表達(dá)出相同的蛋白質(zhì)？從基因功能的共性分析從基因功能的共性分析 生物共用一套遺傳密碼生物共用一套遺傳密碼基因工程基因工程別名別名操作環(huán)境操作環(huán)境操作對(duì)象操作對(duì)象操作水平操作水平基本過(guò)程基本過(guò)程結(jié)果結(jié)果實(shí)質(zhì)實(shí)質(zhì)基因拼接技術(shù)基因拼接技術(shù) 或或DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù)生物體外生物體外基因基因DNADNA分子水平分子水平人類(lèi)需要的基因產(chǎn)物人類(lèi)需要的基因產(chǎn)物剪切剪切拼接拼接導(dǎo)入導(dǎo)入表達(dá)表達(dá)基因重組基因重組步驟一工具：步驟一工具：步驟二工具：步驟二工具：步驟三工具：步驟三工具：DNADNA的的“分子

9、手術(shù)刀分子手術(shù)刀”限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶DNADNA的的“分子縫合針?lè)肿涌p合針”DNADNA連接酶連接酶基因的基因的“分子運(yùn)輸車(chē)分子運(yùn)輸車(chē)”載體載體基因的大小以納米計(jì)算基因的大小以納米計(jì)算，要對(duì)它進(jìn)行，要對(duì)它進(jìn)行剪切、拼接等操作，沒(méi)有非常精細(xì)的剪切、拼接等操作，沒(méi)有非常精細(xì)的工具是不行的。進(jìn)行基因操作最少需工具是不行的。進(jìn)行基因操作最少需要以下三種工具：要以下三種工具：1.11.1 DNADNA重組技術(shù)的工具重組技術(shù)的工具一、限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）一、限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶） “分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀”1.1.來(lái)源來(lái)源: :2.2.種類(lèi)種類(lèi): :3.3.作用：作用：主要原核生物主

10、要原核生物40004000種種專(zhuān)一性專(zhuān)一性識(shí)別雙鏈識(shí)別雙鏈DNA DNA 分子的某種分子的某種特定的特定的核苷酸序列核苷酸序列，并且使每一條鏈中，并且使每一條鏈中特定部位特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的的兩個(gè)核苷酸之間的磷磷酸二酯鍵酸二酯鍵斷開(kāi)。斷開(kāi)。黏性末端黏性末端當(dāng)限制酶當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的從識(shí)別序列的中心軸線中心軸線兩側(cè)兩側(cè)切開(kāi)切開(kāi)時(shí)，時(shí)，被限制酶切開(kāi)的被限制酶切開(kāi)的DNADNA兩條單兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)鏈的切口，帶有幾個(gè)，他們之間正好他們之間正好，這樣的切口，這樣的切口叫叫。當(dāng)限制酶當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的從識(shí)別序列的中心軸線處中心軸線處切開(kāi)切開(kāi)時(shí)，時(shí)，切開(kāi)的切開(kāi)的DNADNA兩條單鏈的切口

11、兩條單鏈的切口平整的，這樣的切口叫平整的，這樣的切口叫平末端平末端。平末端平末端1.11.1 DNADNA重組技術(shù)的工具重組技術(shù)的工具一、限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）一、限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶） “分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀” ” 1.1.來(lái)源來(lái)源: :2.2.種類(lèi)種類(lèi): :3.3.作用：作用：4.4.結(jié)果結(jié)果: :主要原核生物主要原核生物40004000種種專(zhuān)一性專(zhuān)一性形成兩種末端：形成兩種末端： 黏性末端黏性末端 平末端平末端 要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性

12、末端要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端如何把如何把兩種來(lái)源不同的兩種來(lái)源不同的DNADNA片段片段連連接起來(lái)？接起來(lái)？用用 同一種限制酶同一種限制酶 來(lái)分別切割，來(lái)分別切割，會(huì)產(chǎn)生會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端相同的黏性末端，然后讓兩，然后讓兩者的黏性末端者的黏性末端黏合黏合起來(lái)，就似乎可起來(lái)，就似乎可以合成重組的以合成重組的DNADNA分子了。分子了。把把互補(bǔ)配對(duì)的兩個(gè)互補(bǔ)配對(duì)的兩個(gè)黏性末端黏性末端之間的之間的縫隙縫隙磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵“縫合縫合”起來(lái)，起來(lái)， （即梯子兩邊扶手的斷口（即梯子兩邊扶手的斷口連接連接）形）形成一個(gè)成一個(gè)重組重組的的DNADNA分子。分子。1.11.1 DNADNA重組技術(shù)的

13、工具重組技術(shù)的工具二、二、 DNADNA連接酶連接酶 “分子縫合針?lè)肿涌p合針”作用：作用：從大腸桿菌中分離從大腸桿菌中分離 從從T4T4噬菌體中分離噬菌體中分離EcoliEcoli DNA DNA連接酶連接酶 T T4 4DNADNA連接酶連接酶DNADNA連接酶與連接酶與DNADNA聚合酶是一回事嗎？聚合酶是一回事嗎？從從T4T4噬菌體中分離的噬菌體中分離的T T4 4 DNA DNA連接酶連接酶還還可把可把平末端之間的縫隙平末端之間的縫隙“縫合縫合”起起來(lái)，但效率較低來(lái)，但效率較低DNA聚合酶DNA連接酶不同點(diǎn)相同點(diǎn)DNADNA連接酶與連接酶與DNADNA聚合酶有區(qū)別嗎？聚合酶有區(qū)別嗎？只

14、能將單個(gè)核苷酸只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片加到已有的核酸片段上，段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)在兩個(gè)DNADNA片片段之間段之間形成磷酸二形成磷酸二酯鍵酯鍵需要以一條需要以一條DNADNA鏈鏈為模板為模板不需要模板不需要模板均形成磷酸二酯鍵均形成磷酸二酯鍵1.11.1 DNADNA重組技術(shù)的工具重組技術(shù)的工具三、三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體載體 “分子運(yùn)輸車(chē)分子運(yùn)輸車(chē)”1.1.作用：作用： 將將目的基因（外源基因）送入受體目的基因（外源基因）送入受體細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)粒：質(zhì)粒：能能自主復(fù)制自主復(fù)制的小的小型環(huán)狀型環(huán)狀DNADNA分子分子；存在于許多細(xì)菌及酵母存在于許多細(xì)菌

15、及酵母菌等菌等生物中；生物中；質(zhì)粒的存在對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)影響質(zhì)粒的存在對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)影響，但但復(fù)制復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)成；只能在宿主細(xì)胞內(nèi)成；質(zhì)粒上具有抗性基因。質(zhì)粒上具有抗性基因。2.2.載體應(yīng)載體應(yīng)同時(shí)具備三個(gè)條件同時(shí)具備三個(gè)條件能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定保存保存并大量并大量復(fù)制復(fù)制具有多個(gè)具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因，以便與外源基因 連接連接含插入位點(diǎn)含插入位點(diǎn)具有某些具有某些標(biāo)記基因標(biāo)記基因，便于進(jìn)行，便于進(jìn)行篩選篩選 含可識(shí)別標(biāo)志含可識(shí)別標(biāo)志 如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。應(yīng)的基因等。載體是否導(dǎo)入載體是否導(dǎo)入目的基因是否插入目的基因是否插入質(zhì)粒（常用）質(zhì)粒（常用） 噬菌體衍生物噬菌體衍生物動(dòng)植物病毒動(dòng)植物病毒最常用