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文檔簡介
1、環(huán)境微生物學實驗指導 目 錄1. 顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察2-32 顯微鏡直接計數(shù)法4-53培養(yǎng)基的配制和滅菌6-104微生物接種技術11-135微生物大小的測定14-156水中細菌總數(shù)的檢測16實驗一 顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察一、 目的1.掌握顯微鏡的使用方法。2.通過實驗學習觀察微生物形態(tài)的基本方法,了解細菌、真菌和放線菌的形態(tài)特征。二、 原理微生物都是個體微小的生物,用肉眼不能看到它們的個體,所以觀察它們的形態(tài)必須在顯微鏡下進行,另外微生物細胞具有較高的透明性,所以有些微生物(尤其是細菌和放線菌)需經(jīng)過染色后才能觀察清楚,細菌個體很小,其大小以微米計,所以需要在油鏡下觀察。放線菌
2、和霉菌的個體一般呈絲狀,并且明顯地分為基質(zhì)菌絲和氣生菌絲。成熟的個體還具有各種形態(tài)的孢子。因此觀察內(nèi)容包括基質(zhì)菌絲、氣生菌絲和孢子的形態(tài),并注意它們的區(qū)別。三、 材料和用品1、 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、解剖針、刀片2、 細菌和真菌玻片標本、霉菌試管培養(yǎng)物3、 染色液:石炭酸復紅染色液 呂氏美蘭染色液 乳酸石炭酸棉蘭染色液四、 微生物形態(tài)觀察(一) 細菌形態(tài)觀察1、 將細菌示范片置于鏡臺上,用標本夾住。2、 在低倍鏡下,調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器和細調(diào)節(jié)器,使物像清楚;然后調(diào)節(jié)推進器,使觀察對象處于接物鏡的正下方,調(diào)節(jié)入射光強度,使明亮度適宜,認真觀察標本。最后將觀察對象移至視野中心,準備在高倍鏡下觀
3、察。3、 將高倍接物鏡頭轉(zhuǎn)至正下方,轉(zhuǎn)換接物鏡時,需用眼睛在側(cè)面觀察,避免鏡頭與玻片相接損壞鏡頭。調(diào)節(jié)入射光強度,使明亮度適宜,再用調(diào)節(jié)器調(diào)至物像清楚,認真觀察標本。再將觀察部位移至視野中心,準備油鏡觀察。4、 油鏡觀察方法(1)用粗調(diào)節(jié)器將鏡頭提起約1厘米,將油鏡頭轉(zhuǎn)至正下方。 (2)在玻片標本的鏡檢部位滴一滴香柏油(3)一面從側(cè)面觀察,一面用粗調(diào)節(jié)器將鏡頭器小心調(diào)節(jié)至幾乎與標本相接觸。調(diào)節(jié)時應特別小心,注意不能使鏡頭接觸標本片,用力過猛不僅會壓碎玻片,也會損壞鏡頭。 (4)一邊從目鏡觀察,一邊調(diào)節(jié)光線強度,使明亮度適宜;然后用細調(diào)節(jié)器校正焦距,直至能清楚地觀察到物像,再認真觀察,記下觀察結(jié)
4、果。 (二) 真菌形態(tài)觀察 1. 玻片標本觀察 2. 霉菌試管培養(yǎng)物觀察(1)于潔凈的載玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉蘭染色液,用解剖針從菌落的邊緣處取少量帶有孢子的菌絲于染液中,再細心地把菌絲挑散開,然后用蓋玻片蓋上,注意不要產(chǎn)生氣泡。(2)置顯微鏡下觀察,先在低倍鏡下觀察,必要是再換高倍鏡觀察。(3)記錄觀察結(jié)果。五、實驗報告1、繪圖說明所觀察的細菌和霉菌的形態(tài)特征,并比較細菌和霉菌形態(tài)上的異同。 實驗二 顯微鏡直接計數(shù)法一、 目的1.明確顯微鏡計數(shù)的原理2.學習使用血球計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法二、 原理利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù),是一種常用的微生物計數(shù)方法。將經(jīng)過適當稀釋的菌懸液(或孢
5、子懸液)放在血球計數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計數(shù)室中,在顯微鏡下進行計數(shù)。計數(shù)室的容積一定(0.1mm3),可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。此法計得的是活菌體和死菌體的總和。血球計數(shù)板有兩個方格網(wǎng),每個方格網(wǎng)共分9個大方格,中間的大方格為計數(shù)室,微生物的計數(shù)在計數(shù)室中進行。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格,一種為16*25型,一種為25*16型。三、 器材和用品顯微鏡、血球計數(shù)板、蓋玻片 無菌毛細管 釀酒菌懸液四、操作步驟1. 稀釋 將釀酒酵母菌懸液進行適當稀釋,菌液如不濃,可不必稀釋。2. 鏡檢記數(shù)室在加樣前,先對記數(shù)板的記數(shù)室進行鏡檢。若有污物,則需清洗后才能
6、進行記數(shù)。3. 加樣品將清潔干燥的血球記數(shù)板蓋上蓋波片,再用無菌的細口滴管將稀釋的釀酒酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴(不宜過多),讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自行進行計數(shù)室,一般進行計數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。 4. 顯微鏡計數(shù)靜止五分鐘后,將血球計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上,先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置,然后換成高倍鏡進行計數(shù)。在計數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀,需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5-10個菌體為宜。每個計數(shù)室選5個中格(可選4個角和中央的中格)中的菌體進行計數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽,芽體大小達到母細胞的一半時,即作兩個菌
7、體計數(shù)。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的值來計算樣品的含菌量。5. 清洗血球計數(shù)板使用完畢后,將血球計數(shù)板在水龍頭上用水柱沖洗,洗完后晾干。鏡檢,觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈,則必須重復洗滌至干凈為止。五、實驗報告和思考題1.結(jié)果將結(jié)果記于下表。A表示中方格中的總菌數(shù);B表示菌液稀釋倍數(shù)。AB菌數(shù)/ml二室平均值12345第一室第二室2.思考題根據(jù)你實驗的體會,說明用血球計數(shù)板的誤差主要來自那些方面?應如何盡量減少誤差,力求準確? 實驗三 培養(yǎng)基的制備與滅菌一、目的學會一般培養(yǎng)基的制備原理、方法、掌握培養(yǎng)基及器皿的滅菌方法二、原理培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)
8、物配置而成的基質(zhì)。其中除含有水份、碳水化合物、含氮化合物和無機鹽外,有的還需要維生素。以提供微生物新陳代謝所需要的能源、碳源、N源和其它化合物,由于不同微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的要求不同,因此,需提供不同種類的培養(yǎng)基。一般培養(yǎng)基細菌常用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,培養(yǎng)放線菌常用淀粉培養(yǎng)基,培養(yǎng)霉菌常用馬鈴薯培養(yǎng)基,培養(yǎng)酵母菌常用麥芽汁培養(yǎng)基。培養(yǎng)基除了要滿足微生物所要求的各種營養(yǎng)條件外,還應保證微生物所需要的其它生活條件,如適宜的酸堿度,滲透壓等,因此,對不同種類的微生物,應將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到一定的pH范圍,如細菌、放線菌培養(yǎng)基為中性;霉菌、酵母菌培養(yǎng)基為弱酸性。根據(jù)研究目的的不同,可以將培養(yǎng)基制成固體,半固體和
9、液體三種形式。固體培養(yǎng)基的成分與液體相同僅在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑作支持物。通常加入1.52.0的瓊脂,半固體加入0.30.5的瓊脂作支持物,有時也可用明膠或硅膠。三、材料與用具(一) 材料:牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、NaCl;1mol/L NaOH,,1mol/L HCL(二) 用具:試管、錐形瓶、漏斗、量筒、移液管、燒杯、紗布、棉花、玻璃棒、pH試紙、漏斗架、止水夾、臺秤、硫酸紙、藥匙、防潮紙、線繩、標簽紙、剪刀、解剖刀、鑷子、白瓷盤、鐵絲筐。四、方法(一) 培養(yǎng)基的制作方法1、 稱量:按照培養(yǎng)基的配方,準確稱取各成分于燒杯中。2、 溶化:向上述燒杯中加入所需要的水量,攪動,然后加熱使其溶解。
10、3、 調(diào)節(jié)pH值:用0.1N NaOH或1N HCl調(diào)至合適的范圍。4、 過濾:用濾紙或雙層紗布(中間夾一層脫脂棉花)趁熱過濾。5、 分裝:根據(jù)不同的需要,可將制好的培養(yǎng)基分裝入試管后三角瓶內(nèi),管(瓶)口塞上塞子。(1)液體:分裝高度以試管高度的四分之一左右為宜;(2)固體:分裝試管,每管為管高的五分之一,滅菌后制成斜面,分裝三角瓶的容量以不超過三角瓶的一半為宜。(3)半固體:分裝試管一般以管高的三分之一為宜。滅菌后垂直待凝成半固體深層瓊脂。6、 塞:培養(yǎng)基分裝完畢后,在試管口或三角燒瓶口上塞上棉花,以阻止外界微 生物進入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染,并保證有良好的通氣性能。7、 滅菌:高壓蒸汽滅菌,一
11、般培養(yǎng)基1.05公斤/厘米2 ,滅菌2030分鐘。圖 31 培養(yǎng)基的分裝 (二)培養(yǎng)基配制的步驟,按下列培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基。肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(培養(yǎng)細菌用)牛肉膏 5g 瓊脂 20g蛋白胨 10g 蒸餾水 1000mlNaCl 5g pH 7.27.4 (三)、培養(yǎng)基制作注意事項1、加熱溶化過程中,要不斷地攪拌,以免瓊脂或其它固體物質(zhì)粘在燒杯底上燒焦,以致燒杯破裂。加熱過程中所蒸發(fā)的水分應補足。2、pH值須按各種不同培養(yǎng)基的要求而準確測定。1、 所用器皿要潔凈,勿用鐵制或銅制器皿。2、 分裝培養(yǎng)基時,注意不得使培養(yǎng)基在瓶口或管口壁上端沾染,以免浸濕棉塞引起染菌污染;3、 培養(yǎng)基的滅菌時間和溫度
12、,需按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進行,以保證殺菌效果和不損壞培養(yǎng)基的必要成分。 圖32 棉 塞圖33 斜面的擺法(四)、滅菌1、 培養(yǎng)基的高壓蒸汽滅菌(1)需滅菌的物品、棉塞等用防潮紙包好(防止鍋內(nèi)水蒸汽把棉塞淋濕),放入滅菌鍋內(nèi),放入鍋內(nèi)的材料要擺的疏松,不可太擠,否則阻礙蒸汽流通,影響殺菌效果。 (2)關閉滅菌鍋蓋,切勿漏氣。(3)慢慢打開蒸汽口,不要使蒸汽過猛地沖入鍋內(nèi),排除一部分冷氣,關閉排氣開關,先使夾套升溫至壓力表為0.5公斤/厘米2,再使內(nèi)層壓力升至0.5公斤/厘米2,然后開啟排氣開關,使夾套及鍋內(nèi)冷氣除盡。 (4)關閉排氣開關后,整個滅菌鍋成為密閉狀態(tài),而蒸汽又不斷增多,這時溫度和壓力
13、都上升,當溫度升至121,壓強達到1.05公斤/厘米2時,保持2030分鐘,即達到滅菌目的。 (5)滅菌完畢,關閉進汽開關,或切斷電源,待壓力降至“0”時,打開排氣開關,注意不能打開過早,否則突然降壓致使培養(yǎng)基沸騰,使棉塞玷污,甚至沖出容器以外。 (6)打開滅菌鍋蓋,取出已滅菌的器皿及培養(yǎng)基。2、 干熱滅菌法常用于空玻璃器皿的滅菌,但凡帶有膠皮的物品,液體及固體培養(yǎng)基等都不能用干熱法滅菌,進行滅菌時,先將要滅菌器皿(培養(yǎng)皿、移液管的包裝方法見示范)包好,放入烘箱內(nèi)。調(diào)節(jié)溫度至160170維持12小時(當溫度升至80以上后切勿打開烘箱門,以免引起玻璃器皿破裂和火災)。滅菌后當溫度降至3040時,
14、打開箱門,取出滅菌器皿。五、實驗報告思考題1.培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基應該具備哪些條件?為什么2.培養(yǎng)基為什么要滅菌后再用?如何檢查所配好的培養(yǎng)基是無菌的? 實驗四 微生物接種技術一、 目的:1.掌握微生物的接種技術 二、材料與用具材料:菌種,牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基,酒精燈,接種環(huán),火柴等三、操作步驟1.平板的制作和培養(yǎng)將已滅菌的固體培養(yǎng)基融化后(水浴融化)冷到45-50(溫度過高,培養(yǎng)皿蓋上凝結(jié)水太多,菌易被沖掉或燙死;溫度過低,則培養(yǎng)基凝固,不易倒出)。右手拿培養(yǎng)基,左手把皿蓋打開一逢傾入培養(yǎng)基15-20毫升迅速蓋妥,平放桌上,輕輕旋轉(zhuǎn),使培養(yǎng)基與土壤稀釋液充分混勻,凝固后,即成平板,將培養(yǎng)皿倒置于培
15、養(yǎng)箱中培養(yǎng),細菌即在所固定的位置長成肉眼可見的菌落。2.接種方法I斜面接種技術(1) 試管先貼上標簽,注明菌名,日期和姓名,然后將菌種斜面和欲接種斜面試管放在左手食指.中指和無名指之上,大拇指按在二管中央,菌種管口在外方,斜面稍朝上(圖41(a)(2) 先將棉塞用右手扭轉(zhuǎn)松動,以利接種時拔出(3) 右手拿接種環(huán)末端,使其垂直于火焰中,燒紅滅菌(4) 用右手小指,無名指和手掌拔下棉塞(圖41(b)(5) 以火焰燒管口,燒時應不斷轉(zhuǎn)動試管口,使試管口沾染的少量雜菌被燒死(圖41(c)(6) 將燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi),先將環(huán)接觸沒有長菌的培養(yǎng)基部分,使其冷卻,以免燙死被接種的菌體,然后輕輕接觸菌體
16、取出少許,慢慢將接種環(huán)抽出試管圖(41(d)(7) 迅速將接種環(huán)在火旁伸進欲接種試管,在培養(yǎng)基上輕輕劃線,劃線時要由底部到頂部,由下而上,但不要把培養(yǎng)基劃破,也不要使菌種污染管壁(41(e)(8) 燒試管口,并在火旁將塞塞上,塞棉塞時,不要用試管去通棉塞,以免試管在運動時污染雜菌(圖(41(f,g)(9) 將接種環(huán)在火焰上再燒紅滅菌,放下接種環(huán)后,再騰出手將棉塞塞緊(圖(41(h)II液體接種(由斜面培養(yǎng)基接入液體培養(yǎng)基內(nèi))(1)操作方法與前相同,但要使試管向上略斜,以免液體培養(yǎng)液流出。(2)將取有菌種的接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基時,要使環(huán)在液體表面與管壁接觸的部分輕輕打動,使菌體在培養(yǎng)基中分散出來
17、,放置于37 溫箱中培養(yǎng)。III穿刺接種 將取有菌種的接種針自固體培養(yǎng)基的中心刺入,直到管底,但不可刺穿,然后拔出,塞棉塞,置37 溫箱培養(yǎng)。圖41 斜面接種 四、思考題:1. 微生物接種應注意的問題? 2.培養(yǎng)微生物應考慮哪些原則?培養(yǎng)時,為什么要把已接種的培養(yǎng)皿倒置保溫培養(yǎng)。實驗五 微生物大小的測定一、目的掌握用顯微測微尺測量微生物大小的基本方法。二、原理微生物細胞大小,是微生物的形態(tài)特征之一,也是分類鑒定的依據(jù)之一。由于菌體很小,只能在顯微鏡下測量。用來測量微生物細胞大小的工具有目鏡測微尺和鏡臺測微尺。鏡臺測微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片。一般將1mm等分為100格(2mm等分為2
18、00格),每格長度等于0.01mm .是專用于校正目鏡測微尺每格長度的。目鏡測微尺是一塊可放在接目鏡內(nèi)的隔板上的圓形小玻片,其中央刻有精確的刻度,有等分50小格或100小格兩種,每五小格有一長線相隔。由于所用接目鏡放大倍數(shù)和接物鏡放大倍數(shù)的不同,目鏡測微尺每小格所代表的實際長度也就不同,因此,目鏡測微尺不能直接用來測量微生物的大小,在使用前必須用鏡臺測微尺進行校正,以求得在一定放大倍數(shù)的接目鏡和接物鏡下該目鏡測微尺每小格的相對值,然后才可用來測量微生物的大小。 三、器材枯草芽孢桿菌染色玻片標本,目鏡測微尺,鏡臺測微尺,顯微鏡,擦鏡紙,香柏油等。四、操作步驟1.目鏡測微尺的標定(1)放置目鏡測微
19、尺 取出接目鏡,旋開接目鏡透鏡,將目鏡測微尺的刻度朝下放在 接目鏡筒內(nèi)的隔板上,然后旋上接目鏡,最后將此接目鏡插入鏡筒內(nèi)。(2)放置鏡臺測微尺 將鏡臺測微尺置于顯微鏡的載物臺上,使刻度面朝上。(3)校正目鏡測微尺 先用低倍鏡觀察,對準焦距,當看清鏡臺測微尺后,轉(zhuǎn)動接目鏡,使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度平行,移動推動器,使目鏡測微尺和鏡臺測微尺的某一區(qū)間的兩對刻度線完全重合,然后計數(shù)出兩對重合線之間各自所占的格數(shù)。 根據(jù)計數(shù)得到的目鏡測維尺和鏡臺測微尺重合線之間各自所占的格數(shù),通過如下公式換算出目鏡測微尺每小格所代表的實際長度。目鏡測微尺每小格長度。 目鏡測微尺每小格長度=兩對重合線間鏡臺測微尺格數(shù)10兩對重合線間目鏡測微尺格數(shù) 同法校正在高倍鏡和油鏡下目鏡測微尺每小格所代表的長度。2 菌體大小的測定 目鏡測微尺校正后,移去鏡臺測微尺,換上枯草芽孢桿菌染色玻片標本,校正 焦距使菌體清晰,轉(zhuǎn)動目鏡測微尺(或轉(zhuǎn)動染色標本),測出枯草芽孢桿菌的長和寬各占幾格,然后換算出單個菌體的大小值,最后,求出平均值。五、實驗報告1、 結(jié)果(1) 將目鏡測微尺校正結(jié)果填入下表。接物鏡接物鏡倍數(shù)目鏡
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