基因工程基本操作程序

1、 基因工程的基本操作程序蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細菌的毒蛋白基因在棉花細胞中表達，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。想一想需要做哪些關鍵工作？蘇云金芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因毒蛋白基因蘇云金芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌棉花細胞棉花細胞 基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取二、基因表達載體的構建二、基因表達載體的構建三、將目的基因導入受體細胞三、將目的基因導入受體細胞四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定一、一、目的目的基因基因的獲取的獲取主要是主要是編碼蛋白質的結構基因編碼蛋白質的結構基因獲取方法：獲取方法：1、從基因文庫中獲取目的基因、從基因

2、文庫中獲取目的基因2、利用、利用PCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因3、化學方法人工合成、化學方法人工合成外顯子內含子與RNA聚合酶結合位點編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點編碼區(qū)原核生物基因原核生物基因真核生物基因真核生物基因補充補充:1、從基因文庫中獲取目的基因、從基因文庫中獲取目的基因 將含有某種生物不同基因的許多將含有某種生物不同基因的許多DNADNA片斷，導入到片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為同基因，稱為基因文庫基因文庫?；蛭膸旎蛭膸?基因組文庫基因組文庫部分基因文庫部

3、分基因文庫(CDNA文庫文庫)某生物體內某生物體內全部全部DNADNA 許多許多DNADNA片段片段受體菌群體受體菌群體1、從基因文庫中獲取目的基因、從基因文庫中獲取目的基因限制酶限制酶與運載體連接與運載體連接 導入導入基因組文庫基因組文庫某種生物某個時期的某種生物某個時期的mRNAmRNAcDNAcDNA反轉錄反轉錄受體菌群體受體菌群體與運載體連接與運載體連接 導入導入部分基因文庫部分基因文庫（cDNA文庫）文庫）概念：概念：原理：原理：PCRPCR全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定物體外復制特定DNADNA片段的核酸合成技術片段的核酸合成技術 。

4、體外體外DNADNA復制復制一段已知目的基因的核苷酸序列，以便一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。根據(jù)這一序列合成引物。（1 1）模板）模板DNADNA( ( 需含有目的基因需含有目的基因 ) ) （2 2）四種脫氧核苷酸）四種脫氧核苷酸(dNTP)(dNTP) （3 3）耐高溫的）耐高溫的DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）2、利用、利用PCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因3、通過、通過DNA合成儀用化學方法人工合成合成儀用化學方法人工合成推推測測推推測測合合成成 當當基因比較小基因比較小、蛋白質的氨基酸序列可以測得或、蛋白質的氨基酸序列可以測得或核苷核苷酸

5、序列已知酸序列已知時，可采用此種方法。時，可采用此種方法。二、基因表達載體的構建二、基因表達載體的構建-核心核心基因表達載體的構建過程基因表達載體的構建過程質粒質粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理兩個切口兩個切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質粒）分子（重組質粒）同一種同一種一個切口一個切口兩個黏性末端兩個黏性末端復制原點復制原點+啟動子啟動子+目的基因目的基因+終止子終止子+標志基因標志基因基因表達載體的組成三、將目的基因導入受體細胞三、將目的基因導入受體細胞 有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌和

6、動植物細胞等。酵母菌和動植物細胞等。借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。三、將目的基因導入受體細胞三、將目的基因導入受體細胞1.1.將目的基因導入將目的基因導入植物細胞植物細胞農桿菌轉化法農桿菌轉化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法2.2.將目的基因導入將目的基因導入動物細胞動物細胞顯微注射技術顯微注射技術3.3.將目的基因導入將目的基因導入微生物細胞微生物細胞Ca2+處理處理1.1.將目的基因導入將目的基因導入植物細胞植物細胞農桿菌轉化法：農桿菌轉化法：顯微注射技顯微注射技術術提純基因表達載體提純基因表達載體體外顯微注射入受精卵體外顯微注射入受精卵受精卵移植受

7、精卵移植2.2.將目的基因導入將目的基因導入動物細胞動物細胞3.3.將目的基因導入將目的基因導入微生物細胞微生物細胞常用原核生物作為受體細胞的原因：常用原核生物作為受體細胞的原因： 原核生物特點：繁殖快、多為單細胞、遺原核生物特點：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少等傳物質相對較少等方法方法:Ca2+處理處理四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定檢測檢測鑒定鑒定檢測轉基因生物染色體的檢測轉基因生物染色體的DNADNA上是否插上是否插入了目的基因入了目的基因檢測目的基因是否轉錄出了檢測目的基因是否轉錄出了mRNAmRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定

8、、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）（注意與上不同之處）抗原抗原抗體雜交抗體雜交基因探針：目的基因片段用放射性同位素標記基因探針：目的基因片段用放射性同位素標記基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序目的基因的獲取目的基因的獲取基因表達載體的構建基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定1、從基因文庫中獲取目的基因、從基因文庫中獲取目的基因2、利用、利用PCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因3、化學方法人工合成、化學方法人工合成復制原點復制原點 + +

9、 目的基因目的基因 + + 啟動子啟動子 + + 終止子終止子 + + 標記基因標記基因農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、CaCa2+2+處理法處理法DNADNA分子雜交技術、分子雜交技術、抗原分子雜交技術、分子雜交技術、抗原抗體雜交技術抗體雜交技術分子檢測外的個體水平鑒定分子檢測外的個體水平鑒定鞏固練習鞏固練習:1.人們常選用的細菌質粒分子往往帶有一個抗生素抗性基因人們常選用的細菌質粒分子往往帶有一個抗生素抗性基因,該該抗性基因的主要作用是抗性基因的主要作用是 ( )A.提高受體細胞在自然環(huán)境中的耐藥性提高受體細胞在自然環(huán)境中

10、的耐藥性B.有利于對目的基因是否導入進行檢測有利于對目的基因是否導入進行檢測C.增加質粒分子的分子量增加質粒分子的分子量D.便于與外源基因連接便于與外源基因連接2.在遺傳工程技術中在遺傳工程技術中,限制性內切酶主要用于限制性內切酶主要用于 ( )A.目的基因的提取和導入目的基因的提取和導入B.目的基因的提取和檢測目的基因的提取和檢測C.目的基因與載體的結合和導入目的基因與載體的結合和導入D.目的基因的提取與載體結合目的基因的提取與載體結合BD3.在遺傳工程技術中在遺傳工程技術中,下列何種目的基因一般以直接分下列何種目的基因一般以直接分離的方法獲得離的方法獲得 ( )A.人的胰島素基因人的胰島素基因 B.蠶的蠶絲蛋白基因蠶的蠶絲蛋白基因C.芽孢桿菌的抗蟲基因芽孢桿菌的抗蟲基因 D.菜豆儲藏蛋白基因菜豆儲藏蛋白基因4.1976年年,美國的科學家首次將人的生長抑制素釋放美國的科學家首次將人的生長抑制素釋放因子的基因轉移到大腸桿菌因子的基因轉移到大腸桿菌,并獲得了表達并獲得了表達,此文中的此文中的表達是指該基因在大腸桿菌表達是指該基因在大腸桿菌 ( )A.能進行能進行DNA復