臨檢培訓(xùn)基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班

1、臨檢培訓(xùn)基因擴增技臨檢培訓(xùn)基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診斷術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班第二頁，共84頁。中心法則中心法則 復(fù) 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯 DNADNA RNARNA 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 蛋白蛋白 制制 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄 糖蛋白糖蛋白 脂蛋白脂蛋白 酶類酶類 激素激素 細(xì)胞因子細(xì)胞因子 第三頁，共84頁?；蛑亟M技術(shù)基因重組技術(shù) 基因探針技術(shù)基因探針技術(shù) 基因重組藥物 基因診斷 基因治療 PKUPKU 尿毒癥（口服尿毒癥（口服artificial cells)artificial cells)第四頁，共84頁?；蛟\斷基因診斷 運用基因探針， PCR技術(shù)等探測特定靶基因的存在

2、與否，或是否有基因突變等缺陷，從而對疾病或病原體感染作出診斷叫基因診斷。 基因型 表 型 基 臨 血 生 細(xì) 影 病 因 床 清 化 菌 像 理 診 學(xué) 學(xué) 學(xué) 學(xué) 學(xué) 斷 診 診 診 診 診 診 斷 斷 斷 斷 斷 斷第五頁，共84頁?；蛟\斷的特點基因診斷的特點靈敏度高（早期）靈敏度高（早期）特異性強特異性強操作簡便操作簡便取材大多不受組織器官限制取材大多不受組織器官限制可進(jìn)行早期診斷，癥狀前診斷及產(chǎn)前診斷可進(jìn)行早期診斷，癥狀前診斷及產(chǎn)前診斷檢測細(xì)菌內(nèi)病毒等微生物時不需培養(yǎng)檢測細(xì)菌內(nèi)病毒等微生物時不需培養(yǎng)第六頁，共84頁。聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)Polymerase Chain React

3、ionPolymerase Chain Reaction（PCRPCR） Kary B. Mullis1984 年問世, 成為分子生物學(xué)和生命科學(xué)發(fā)展史上的里程碑1993 榮獲諾貝爾獎 Mendocin 128號公路附近一棵七葉樹下的突發(fā)奇想專利官司之戰(zhàn): DuPont 與Cetus對薄公堂第七頁，共84頁。 PCR PCR 原理示意圖原理示意圖第八頁，共84頁。PCRPCR技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用一、在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用、在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用二、遺傳病的基因診斷和產(chǎn)前基因診斷：二、遺傳病的基因診斷和產(chǎn)前基因診斷： 血友病、血友病、 地中海貧血、地中海貧血、DMD、PKU等等等等三、細(xì)菌、

4、支原體、衣原體、立克次體等三、細(xì)菌、支原體、衣原體、立克次體等四、病毒四、病毒五、白血病、腫瘤五、白血病、腫瘤六、骨髓移植、器官移植供體配型選擇六、骨髓移植、器官移植供體配型選擇七、法醫(yī)學(xué)七、法醫(yī)學(xué)八、動植物學(xué)八、動植物學(xué)九、古人類學(xué)、古生物學(xué)九、古人類學(xué)、古生物學(xué) 第九頁，共84頁。第十頁，共84頁。第十一頁，共84頁。 PCR原理示意圖第十二頁，共84頁。熱變性：從外周血白細(xì)胞或絨毛、羊水細(xì)胞提取的DNA約1ug，在含有適當(dāng)緩沖液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反應(yīng)混合物中，在94下熱變性4分鐘，使之解為單鏈。 第十三頁，共84頁。退火：然后置反應(yīng)混合物于5

5、5，使引物與解為單鏈的DNA上互補序列雜交在一起，稱之為退火。并迅速加入2單位耐熱的Taq DNA聚合酶，混勻、離心10秒鐘。為防止在整個PCR過程中，水份的蒸發(fā)影響PCR效果，通常加入35ul石蠟油封蓋液面。 第十四頁，共84頁。引物延伸：置上述反應(yīng)混合物于70水浴中1-2分鐘，在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs為原料（底物），從引物的3端A開始, 沿著53的方向，合成每條模板的互補鏈，此稱引物延伸。結(jié)果，DNA拷貝數(shù)增加了一倍。 第十五頁，共84頁。接著，將上述熱變性退火引物延伸（稱為一個循環(huán)）反復(fù)進(jìn)行30-35次。只是熱變性的時間縮短為1分鐘左右。每經(jīng)過一個循環(huán)，DNA拷貝數(shù)便增加一

6、倍（2）。因此，如進(jìn)行n次循環(huán)，則拷貝數(shù)將增加2n倍！進(jìn)行25個循環(huán)，則拷貝數(shù)將增加225倍，即上百萬倍。在瓊脂糖凝膠電泳上可看到特異性長度的擴增帶?？梢奝CR之所以高速擴增的關(guān)鍵是因為每次新合成的DNA鏈在后來的循環(huán)中都可以作模板，猶如滾雪球，數(shù)量迅速增加。 第十六頁，共84頁。如果引物5端有幾個與模板DNA不配對的堿基，仍可能與模板DNA退火、延伸，對PCR效果影響不大。這一特點，可使PCR產(chǎn)物兩端帶上限制酶的Linker，或造成DNA順序的缺失、插入、堿基替代等。大大增大了PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍。 第十七頁，共84頁。影響PCR效果的重要因素及注意事項：PCR技術(shù)的原理似乎非常簡單明了，P

7、CR反應(yīng)的操作也并不復(fù)雜；但要取得好的結(jié)果和良好的可重復(fù)性并非易事。必須徹底弄通其分子生物學(xué)的奧妙之處，并把握其各種影響因素，規(guī)范操作。以下列出影響PCR擴增效果的主要因素 第十八頁，共84頁。引物設(shè)計一定要科學(xué)合理，序列的特異性要高。長度一般在18-25個堿基，Tm值可按公式（G+C總數(shù)x4）+（A+T總數(shù)x2）（）估算。盡可能避開4個以上G或C等相同堿基串聯(lián)重復(fù)。盡可能避免引物內(nèi)部形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物之間形成二聚體（Dimer）的可能性。G、C與A、T的比例盡可能1:1左右。同一反應(yīng)管中的引物（甚至同一個Lab的所有引物）Tm值設(shè)計的相同。 第十九頁，共84頁。引物在反應(yīng)體系中的濃度要經(jīng)過優(yōu)

8、化。雙重PCR及多重PCR對各引物濃度間的比例要求更嚴(yán)。 基因組DNA制備液純度要好。其用量也并非越多越好。 各種試劑小量分裝保存，避免多次凍融。dNTP濃度要優(yōu)化。 第二十頁，共84頁。退火溫度參考Tm值進(jìn)行優(yōu)化。其對PCR的成敗，非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)與否關(guān)系最大。Taq DNA聚合酶的廠牌、批號和用量均要合適。對擴增難度較大的PCR，Mg2+濃度要適當(dāng)增加。操作者的手法也有影響，要在實踐中總結(jié)提高技術(shù)。 第二十一頁，共84頁。熒光定量PCR行HLA-DrB1位點分型法的建立及與血清學(xué)方法的比較第二十二頁，共84頁。HLA分型技術(shù)HLA（人類白細(xì)胞抗原）MHC區(qū)基因（主要組織相容性復(fù)合物基因區(qū)）

9、 高度多態(tài)性的基因區(qū)第二十三頁，共84頁。HLA分型技術(shù)一、淋巴細(xì)胞微量細(xì)胞毒試驗一、淋巴細(xì)胞微量細(xì)胞毒試驗 1964年，年，Paul Terasaki, LA, USA二、二、DNA分型法分型法 優(yōu)點：優(yōu)點： 1. 血樣不要求新鮮血樣不要求新鮮; 2. 白血病患者白血病患者WBC表面抗原被破壞表面抗原被破壞, 只只 能用能用DNA分型法分型法; 3. 結(jié)果更準(zhǔn)確可靠結(jié)果更準(zhǔn)確可靠第二十四頁，共84頁。HLA分型技術(shù)nDNA-RPLP, 1982nPCR/SSOnPCR/反向斑點雜交nPCR/SSCPnPCR/SSPnPCR/SBTnR-Q-PCR/SSPnPCR/dHPLC等第二十五頁，共8

10、4頁。 在序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP）技術(shù)基礎(chǔ)上，將熒光定量PCR（FQ-PCR）技術(shù)與SSP結(jié)合起來，建立了自動化程度更高的熒光定量PCR- HLA分型技術(shù)，完成了46例尸腎供受者的HLA-DBR1分型。 FQ-PCR不需走電泳，減少了污染的機會，提高了自動化程度。同時又開展了以DNA測序為基礎(chǔ)的HLA分型（SBT）技術(shù)。第二十六頁，共84頁。三、主要方法： 1、HLA血清學(xué)分型。 2、常規(guī)PCR-SSP反應(yīng)。 3、SBT分型法： (1)PCR擴增DRB1片段。 (2)用ABI-373型自動測序儀測序。 (3)測序數(shù)據(jù)分析及分型。第二十七頁，共84頁。 結(jié)果和討論一、進(jìn)行PC

11、R-SSP法HLA-DRB1位點分型：第二十八頁，共84頁。第二十九頁，共84頁。第三十頁，共84頁。4、熒光定量PCR技術(shù)原理： 第三十一頁，共84頁。圖3、熒光定量PCR中反應(yīng)前的模板濃度與Ct值成反比第三十二頁，共84頁。n圖4、15 R-II號樣本熒光定量分型結(jié)果第三十三頁，共84頁。n圖5、SSP分型結(jié)果與上述一致第三十四頁，共84頁。FQ-PCR分型的優(yōu)點： (1)熒光定量分型法省去了電泳分析、UVP成像的操作，簡化步驟，提高自動化程度，減少了工作量。 (2)判讀結(jié)果與擴增由儀器同時完成，節(jié)省了PCR后處理的時間，結(jié)果更客觀。 (3)將引物的特異性和探針的特異性結(jié)合，提高了準(zhǔn)確性。

12、第三十五頁，共84頁。(4)只需在反應(yīng)前打開離心管一次，即可完成所有的操作，減少了污染的機會，進(jìn)一步提高了特異性和靈敏性。(5)本FQ-PCR HLA DRB1配型較常規(guī)FQ-PCR減少了合成的熒光探針數(shù)量。(6)可得出起始模板拷貝數(shù)定量結(jié)果。第三十六頁，共84頁?；驍U增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用特點：PCR技術(shù)一問世，首先就應(yīng)用于珠蛋白生成障礙性貧血等遺傳病的基因診斷。不但要查特定基因是否存在，而且要查出相應(yīng)功能基因的缺陷：突變？缺失？插入？倒位？等等。采用的技術(shù)更復(fù)雜、多樣，與檢測病毒、細(xì)菌的要求不完全相同。實驗室的驗收。第三十七頁，共84頁。基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用技術(shù)：

13、PCR/凝膠電泳 PCR/RFLP PCR/SSCP PCR/ASO(Allile-specific oligoprobe) PCR/sequencing ASA(Allile-specific Amplification) m-PCR(multiplex PCR) F-Q-PCR(Real-Time PCR)第三十八頁，共84頁。 血友病甲基因診斷劉敬忠，梁燕，王立榮，肖白，朱章菱，周艷，劉亮，張晶 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 北京基因診斷實驗室 北京朝陽醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所第三十九頁，共84頁。甲型血友病因子基因倒位的研究及檢測新技術(shù)： 血友病甲（HA）是常見的X-連鎖遺傳性出血性疾病

14、，是由于凝血因子（F）基因缺陷所致。約半數(shù)重型HA的患者，是由于F基因第22內(nèi)含子（IVS22）發(fā)生基因倒位所致。迄今，國際上檢測這種基因倒位都是用Southern印跡雜交技術(shù)。雖然這種技術(shù)能夠準(zhǔn)確的查出這種基因倒位，但操作步驟多，流程長，出結(jié)果慢，難度大，需要DNA樣品量大以及操作放射性同位素標(biāo)記的探針等。我們從1996年開始在國際上率先研究利用長距離DNA擴增技術(shù)（LD-PCR），替代Southern雜交進(jìn)行F基因倒位的診斷。經(jīng)過近二年的努力終獲成功，并進(jìn)行了推廣應(yīng)用。主要完成了以下幾方面工作：第四十頁，共84頁。第四十一頁，共84頁。自行設(shè)計合成了長距離PCR的四個引物P、Q、A、B。預(yù)

15、期擴增產(chǎn)物長度P/Q為12Kb，A/B為10Kb，P/B及A/Q為11Kb。第四十二頁，共84頁。 四引物及三引物L(fēng)D-PCR體系的比較第四十三頁，共84頁。 系統(tǒng)優(yōu)化了引物濃度，酶用量，deaza-dGTP的比例，DMSO濃度，基因組DNA的質(zhì)量和用量，退火及延伸溫度、時間，低濃度瓊脂糖凝膠電泳條件及操作方法等。使10-12Kb DNA擴增及檢測倒位終獲成功。這充分體現(xiàn)了該成果的科學(xué)性和先進(jìn)性第四十四頁，共84頁。不同量模板不同量模板DNADNA對對LD-PCR LD-PCR 的影響的影響1-51-5號的號的DNADNA量分別為量分別為0.250.25，0.50.5，0.750.75，1.0

16、1.0，1.25g1.25g第四十五頁，共84頁。不同量不同量deaza-dNTPdeaza-dNTP對對LD-PCRLD-PCR的影響的影響1-51-5號號dNTPdNTP濃度分別為濃度分別為200200，300300，400400，500500，600M600M第四十六頁，共84頁。 53份重型HA患者及家系成員DNA標(biāo)本，分別用經(jīng)典的Southern印跡雜交和本LD-PCR技術(shù)在雙盲條件下進(jìn)行F基因倒位檢測。兩者得出的診斷結(jié)論完全一致。表明用LD-PCR技術(shù)診斷該基因倒位，檢出攜帶者的特異性和靈敏度均達(dá)到百分之百。而且具有操作步驟較簡便，需DNA量少，出結(jié)果快，不需操作放射性同位素標(biāo)記探

17、針，在無法取得先癥者患兒血樣的情況下，也可直接查攜帶者是否攜帶倒位基因，如果是可直接做產(chǎn)前診斷等優(yōu)點。第四十七頁，共84頁。雙盲實驗（53份DNA）結(jié)果證明：LD-PCR可獨立用于重型HA基因倒位的檢測第四十八頁，共84頁。應(yīng)用實驗成功的LD-PCR技術(shù)，對來自北京、天津、江蘇、湖北、廣西、四川、山東、福建等省市的108 個重型HA患者及數(shù)目不等的家系成員進(jìn)行了檢測，共查出F基因倒位47例，占44%，與國際上用Southern雜交技術(shù)查出的基因倒位引起的HA約占重型HA的40-50%一致。另外，檢出30余位倒位基因攜帶者，為將來開展產(chǎn)前基因診斷，杜絕新的HA患兒出生打下了基礎(chǔ)，對優(yōu)生、提高人口

18、素質(zhì)有重要意義。第四十九頁，共84頁。第五十頁，共84頁。14個個DNA標(biāo)本標(biāo)本LD-PCR電泳結(jié)果電泳結(jié)果M：DNA/Hind酶解產(chǎn)物，三條帶分別為酶解產(chǎn)物，三條帶分別為23.1kb，9.4kb，6.6kb第五十一頁，共84頁。第五十二頁，共84頁。美國Steve.S.Sommer去年與我們同期發(fā)表了一篇類似技術(shù)方法的摘要文章。但我們較他們有兩個顯著不同特點：一是我們強調(diào)了運用P、Q和B這三個引物就完全可以滿足診斷的需要，省去一個引物A，減少一條10Kb擴增帶。這條10Kb帶是多余的，且使11Kb及12Kb帶出現(xiàn)的難度增大。二是我們研究成功方法后，立即迅速應(yīng)用于患者及其家系的診斷和攜帶者檢出

19、，現(xiàn)已達(dá)一百余家系，產(chǎn)生了很大社會效益和一定的經(jīng)濟效益，并開始向兄弟單位推廣應(yīng)用。第五十三頁，共84頁。 HA8家系家系 PCR/Bcl酶解分析結(jié)果酶解分析結(jié)果M: pBR322/Msp；0:-2（酶解前）擴增帶長（酶解前）擴增帶長374bp，圖中圖中211bp和和163bp為酶解后產(chǎn)物為酶解后產(chǎn)物 M 3 1 2 1 2 0 第五十四頁，共84頁。 HA15家系家系 St14位點位點VNTR多態(tài)基因連鎖分析結(jié)果多態(tài)基因連鎖分析結(jié)果M: X174/Hae M 12321第五十五頁，共84頁。HA18家系內(nèi)含子家系內(nèi)含子13（A）和內(nèi)含子）和內(nèi)含子22（B）可變串聯(lián)重復(fù)數(shù)目多態(tài)性分）可變串聯(lián)重復(fù)

20、數(shù)目多態(tài)性分析結(jié)果析結(jié)果A為內(nèi)含子為內(nèi)含子13中（中（CA）重復(fù)分型結(jié)果：）重復(fù)分型結(jié)果：-1為為21/-，-2為為21/20，-2為為22/20，-1為為21/-，-1為為21/21，她是攜帶者；，她是攜帶者；B為內(nèi)含子為內(nèi)含子22中（中（GT）（AG）重復(fù)分型結(jié)果：）重復(fù)分型結(jié)果：-1為為26/-，-2為為26/26，-2為為27/26，-1為為26/25，-1為為25/- 1 2 2 1 1 1 2 2 1 1第五十六頁，共84頁。血友病乙的基因診斷，攜帶者檢出和產(chǎn)前診斷劉敬忠 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 北京基因診斷實驗室 北京朝陽醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所第五十七頁，共84頁。血友病乙

21、的基因診斷，攜帶者檢出和產(chǎn)前診斷第五十八頁，共84頁。缺失型-地中海貧血基因診斷技術(shù)的改進(jìn)劉敬忠，周桔，王立榮，周艷 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 北京基因診斷實驗室 北京朝陽醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所第五十九頁，共84頁。第六十頁，共84頁。臨床診斷Barts（-/-/-）n基因型n臨床分型靜止型靜止型（- -/）-SEA-3.7-4.2標(biāo)準(zhǔn)型標(biāo)準(zhǔn)型（-/-/）HbH病?。?/-/-）第六十一頁，共84頁。 問題：PCR技術(shù)可重復(fù)性差, 難度大， 結(jié)果判斷復(fù)雜， 引物設(shè)計有待改進(jìn) 措施：1、重新設(shè)計引物 2、改進(jìn)和優(yōu)化PCR反應(yīng)體系 酶、deaza-dGTP、DMSO、 退火溫度、gradien

22、t gel等 第六十二頁，共84頁。A B C A B C GE S1 S2 S3 M1 1 2 3 4 5 6 M2 7 8 9 M2 10 11 12 M31.2%/2.0%濃度梯度瓊脂糖凝膠1，4，正常（/）；2，5，-3.7/；3，6，-3.7/-SEA；7，/；8，-4.2/；9，12，-4.2/-SEA；10，/；11，-SEA/-SEA；12，9，-4.2/-SEA1.58Kb287 bp173 bp1.9 Kb1.7 Kb第六十三頁，共84頁。根據(jù)本試劑盒三個根據(jù)本試劑盒三個PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖譜反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖譜作出基因診斷作出基因診斷第六十四頁，共84頁。單管四重PCR試

23、劑盒檢測-珠蛋白的基因三種缺失類型及引物設(shè)計示意圖 第六十五頁，共84頁。10種DNA的四重PCR圖譜M N -3.7/aa -4.2/aa -3.7/-3.7 -4.2/-4.2-3.7/-4.2-/-3.7/-4.2/-aa/-all M運運 用用 單單 管管 四四 重重 PC R檢檢 測測 導(dǎo)導(dǎo) 致致 -地地 中中 海海 貧貧 血血 的的 -珠珠 蛋蛋 白白 基基 因因 3種種 缺缺 失失-3.7(-3.7),右 缺 ； -4.2(-4.2),左 缺 ;-(-SE A),東 南 亞 缺 失 ;M : D N A /EcoR I+H indK b1.91.61.50.8第六十六頁，共84頁

24、。25個海南黎族人DNA的擴增圖譜第六十七頁，共84頁。 20個廣西、廣東-地貧68標(biāo)本的多重PCR擴增圖第六十八頁，共84頁。根據(jù)圖譜作出診斷 擴增帶電擴增帶電電泳圖電泳圖 及診斷及診斷序號序號 0.8Kb 1.6Kb1.9Kb1.5Kb診診 斷斷1-+-正常正常(/);但不排除但不排除/T的可能性的可能性2-+-3.7攜帶者攜帶者(-3.7/)3-+-4.2攜帶者攜帶者(-4.2/) 4-+-3.7純合子純合子(-3.7/-3.7) 5-+-4.2純合子純合子(-4.2/-4.2) 6-+-+-3.7/-4.2雙重雜合子雙重雜合子 7+-SEA/- -SEA巴氏水腫胎兒巴氏水腫胎兒 8+-SEA /-3.7 (缺失型缺失型HbH病病) 9+-+-SEA /-4.