第二章 天然藥物化學(xué)成分提取分離鑒定方法與技術(shù)(色譜法)

1、 碳酸鈣碳酸鈣（固定相）（固定相）色素混合液色素混合液石油醚石油醚 (流動相）流動相）1906年，年，Tsweet發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象色譜柱色譜柱2分離混合物分離混合物精制化合物精制化合物鑒定化合物鑒定化合物 利用混合物中各成分在固定相和移動相利用混合物中各成分在固定相和移動相中中吸附吸附、分配分配及其及其親和力親和力的差異而達到分離。的差異而達到分離。固定相固定相移動相移動相被分離被分離 物質(zhì)物質(zhì)三者相互關(guān)系三者相互關(guān)系 利用吸附劑對混合物中各成分分子利用吸附劑對混合物中各成分分子吸附吸附能力能力的差異而達到分離的色譜法。的差異而達到分離的色譜法。物理吸附物理吸附 化學(xué)吸附化學(xué)吸

2、附 半化學(xué)吸附半化學(xué)吸附“相似者易吸附相似者易吸附”避免避免氫鍵形成氫鍵形成能力能力固定相固定相（吸附劑）（吸附劑）移動相移動相（溶劑溶劑）被分離被分離 物質(zhì)物質(zhì)溶溶解解能能力力流動相流動相溶質(zhì)溶質(zhì)吸附吸附劑劑吸附作用吸附作用競爭競爭吸附作用吸附作用a a、吸附劑（固定相）、吸附劑（固定相）硅膠（硅膠（silica） SiO2 XH2O 注意：注意：活化溫度不宜高，不宜分離堿性物質(zhì)?；罨瘻囟炔灰烁?，不宜分離堿性物質(zhì)。 極性吸附劑，極性吸附劑，最適于分離植物中的堿最適于分離植物中的堿性或中性的親脂性成分性或中性的親脂性成分。 吸附特性與硅膠類似，但吸附特性與硅膠類似，但堿性氧化鋁堿性氧化鋁不宜分

3、離酸性物質(zhì)不宜分離酸性物質(zhì)。結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)：-CH2-CO-NH-n原理原理：氫鍵吸附學(xué)說氫鍵吸附學(xué)說 酰氨基與化合物（羥酰氨基與化合物（羥基、羧基及醌基）形基、羧基及醌基）形成氫鍵吸附。成氫鍵吸附。用途用途：分離黃酮類、酚類、醌類、有機酸類及鞣質(zhì)。分離黃酮類、酚類、醌類、有機酸類及鞣質(zhì)。影響吸附強弱的因素影響吸附強弱的因素：1 1、流動相：水甲醇或乙醇丙酮氯仿、流動相：水甲醇或乙醇丙酮氯仿稀氨水甲酰胺稀氨水甲酰胺; ;2 2、分子結(jié)構(gòu)：、分子結(jié)構(gòu)：a a、形成氫鍵數(shù)目多，吸附、形成氫鍵數(shù)目多，吸附能力強。能力強。b b、形成分子內(nèi)氫鍵，吸附力減弱。、形成分子內(nèi)氫鍵，吸附力減弱。C C、芳香化合物中

4、，共軛雙鍵多，吸附牢。、芳香化合物中，共軛雙鍵多，吸附牢?；钚蕴炕钚蕴浚╝ctivated carbon） 非極性吸附劑，非極性吸附劑，對非極性物質(zhì)具有較強對非極性物質(zhì)具有較強的親和力，在的親和力，在水中對溶質(zhì)表現(xiàn)出強的吸附能力水中對溶質(zhì)表現(xiàn)出強的吸附能力。 從活性炭上洗脫被吸附的物質(zhì)時，溶劑的從活性炭上洗脫被吸附的物質(zhì)時，溶劑的極性越小，洗脫能力越強。極性越小，洗脫能力越強。特別適合水溶性物質(zhì)的分離特別適合水溶性物質(zhì)的分離。b b、溶、溶 劑劑 （移動相）（移動相）遵循遵循“相似相溶相似相溶”及及“相似者易吸附相似者易吸附”原理：原理：極性吸附劑，溶劑的介電常數(shù)愈大，洗脫能力愈強；極性吸附劑

5、，溶劑的介電常數(shù)愈大，洗脫能力愈強；非極性吸附劑，溶劑的介電常數(shù)愈大，洗脫能力愈弱。非極性吸附劑，溶劑的介電常數(shù)愈大，洗脫能力愈弱。c、被分離物質(zhì)、被分離物質(zhì)對于極性吸附劑而言：對于極性吸附劑而言：被分離成分極性大，吸附牢，難以洗脫；被分離成分極性大，吸附牢，難以洗脫；被分離成分極性小，吸附力弱，容易洗脫。被分離成分極性小，吸附力弱，容易洗脫。一般化合物的極性按下列官能團的順序增強：CH2CH2，CH2=CH2，OCH3，COOR，C=O，CHO，NH2，OH，COOH四、操作方式四、操作方式 1、薄層色譜法（、薄層色譜法（TLC）* 定義：定義：將吸附劑均勻的鋪在平板上，把要分離將吸附劑均勻

6、的鋪在平板上，把要分離分析的樣品點加到薄層色譜板上，然后用適當?shù)娜芊治龅臉悠伏c加到薄層色譜板上，然后用適當?shù)娜軇┫到y(tǒng)展開，在一定的條件下顯色或直接在日光或劑系統(tǒng)展開，在一定的條件下顯色或直接在日光或紫外光下觀察所獲得的斑點，從而達到紫外光下觀察所獲得的斑點，從而達到分離、分析、分離、分析、鑒定鑒定的目的。的目的。1）薄層色譜的吸附劑和支持劑：）薄層色譜的吸附劑和支持劑： 在選用吸附劑或支持劑時，一般是根據(jù)在選用吸附劑或支持劑時，一般是根據(jù)被分離物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)來選用。當不了解被被分離物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)來選用。當不了解被分離物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)時，可以先選用分離物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)時，可以先選用最常用最常用的硅膠

7、或氧化鋁的硅膠或氧化鋁，如果分離效果不好，可再，如果分離效果不好，可再改用其他的吸附劑或支持劑。改用其他的吸附劑或支持劑。 正己烷、環(huán)己烷正己烷、環(huán)己烷 、四氯化碳、甲苯、氯仿、四氯化碳、甲苯、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、水乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、水2）薄層色譜的一般操作）薄層色譜的一般操作a a、制板、制板b b、活化、活化c c、點樣、點樣d d、展開、展開e e、顯色、顯色f f、計算比移值、計算比移值 C、展開、展開預(yù)飽和中預(yù)飽和中展開中展開中預(yù)防預(yù)防 邊緣效應(yīng)邊緣效應(yīng)定義：定義：樣品經(jīng)色譜分離后，某成分從原點至該樣品經(jīng)色譜分離后，某成分從原點至該成分斑點中心

8、的距離與從原點至展開劑前沿的成分斑點中心的距離與從原點至展開劑前沿的距離的比值稱為該成分的比移值（距離的比值稱為該成分的比移值（RfRf值）。值）。 原點至色譜斑點中心的距離原點至色譜斑點中心的距離 比移值（比移值（Rf值）值） 原點至展開劑前沿的距離原點至展開劑前沿的距離上樣量大上樣量大，常用于制，常用于制備分離，是分離天然化備分離，是分離天然化學(xué)成分最常用的方法。學(xué)成分最常用的方法。柱色譜是一種將柱色譜是一種將分離材料裝入柱狀容器中分離材料裝入柱狀容器中, ,以適當?shù)南疵搫┻M行洗脫以適當?shù)南疵搫┻M行洗脫而使不同成分得到分離的而使不同成分得到分離的色譜方法。色譜方法。2、柱色譜、柱色譜*其原

9、理、吸附劑及洗脫劑的選擇與薄層色譜其原理、吸附劑及洗脫劑的選擇與薄層色譜法相同。法相同。操作步驟：操作步驟：注意點：上柱的樣品須經(jīng)過注意點：上柱的樣品須經(jīng)過純化處理純化處理（過濾、（過濾、萃取、脫色、沉淀等）萃取、脫色、沉淀等）1）裝柱）裝柱實驗室常用的柱內(nèi)徑與柱長之比實驗室常用的柱內(nèi)徑與柱長之比通常為通常為1:151:151:201:20。 若柱粗而短，則分離效果較差。若柱粗而短，則分離效果較差。 若柱過長而細，分離效果雖好，若柱過長而細，分離效果雖好，但流速慢，消耗時間太長。但流速慢，消耗時間太長。a a、干法、干法b b、濕法：、濕法：因濕法裝柱容易趕走硅膠內(nèi)的氣泡，因濕法裝柱容易趕走硅

10、膠內(nèi)的氣泡，故一般以濕法裝柱較好。故一般以濕法裝柱較好。2）上樣）上樣 梯度洗脫：洗脫劑極性從小到大。梯度洗脫：洗脫劑極性從小到大。 洗脫劑液面高度始終要高于柱面。洗脫劑液面高度始終要高于柱面。 控制洗脫劑流速為勻速。控制洗脫劑流速為勻速。 有色成分收集各色帶洗脫液。有色成分收集各色帶洗脫液。 無色成分則采用等分收集。無色成分則采用等分收集。 濃縮洗脫液，薄層檢識后合并相同流分?；旌蠞饪s洗脫液，薄層檢識后合并相同流分?；旌?成分則進一步分離。成分則進一步分離。3）洗脫）洗脫植物色素分離圖示植物色素分離圖示41 分配色譜法是以液體做固定相，用與其不分配色譜法是以液體做固定相，用與其不相混溶的的溶

11、劑做流動相的相混溶的的溶劑做流動相的液液- -液色譜法液色譜法。利用被分離成分在固定相和流動相中的利用被分離成分在固定相和流動相中的溶解度溶解度不同。不同。易溶于流動相的成分，移動速度快。易溶于流動相的成分，移動速度快。易溶于固定相的成分，移動速度慢。易溶于固定相的成分，移動速度慢。溶溶解解能能力力流動相流動相溶質(zhì)固定相固定相競爭競爭二、分二、分配色譜中的固定相和配色譜中的固定相和流動相流動相支持劑支持劑固定相固定相流動相流動相待分離物質(zhì)待分離物質(zhì)分配色譜分配色譜四要素四要素 在在分配色譜中起到支持和吸著一定量固定分配色譜中起到支持和吸著一定量固定相的作用，相的作用，本身無吸附作用本身無吸附作

12、用。常用支持劑：常用支持劑： 含水含水硅膠硅膠、硅藻土、纖維素、硅藻土、纖維素、濾紙濾紙正相分配色譜：親水性成分和弱親脂性成分正相分配色譜：親水性成分和弱親脂性成分反相分配色譜：強親脂性成分反相分配色譜：強親脂性成分1 1、正相分配色譜、正相分配色譜 2 2、反相分配色譜、反相分配色譜 48類型類型固定相固定相極性極性流動相流動相極性極性分離速度分離速度正相分配正相分配大大小小極性小的分離速度快極性小的分離速度快反相分配反相分配小小大大極性大的分離速度快極性大的分離速度快先將支持劑和固定相拌勻先將支持劑和固定相拌勻抽濾，除去多余的固定相抽濾，除去多余的固定相將含有固定相的支持劑倒入流動相中飽和

13、將含有固定相的支持劑倒入流動相中飽和濕法裝柱濕法裝柱洗脫用的流動相在使用前用固定相溶劑飽和洗脫用的流動相在使用前用固定相溶劑飽和v支持劑：惰性物質(zhì)支持劑：惰性物質(zhì)v固定相：支持劑吸附的溶劑固定相：支持劑吸附的溶劑v流動相：流動相：事先要用固定相飽和事先要用固定相飽和v裝置及操作同吸附薄層色譜，裝置及操作同吸附薄層色譜，區(qū)別在于制板區(qū)別在于制板用的是支持劑不是吸附劑。用的是支持劑不是吸附劑。 系以紙為載體，以紙上所含水分為固定相，系以紙為載體，以紙上所含水分為固定相，用展開劑進行展開的分配色譜。用展開劑進行展開的分配色譜。 v支持支持劑：劑：濾紙（纖維素）濾紙（纖維素）v固定相：固定相：水水v流

14、動相流動相：水飽和有機溶劑：水飽和有機溶劑用作微量分析，特別適合于用作微量分析，特別適合于親水性較強的成分。親水性較強的成分?；衔飿O性越小，化合物極性越小，RfRf值越大；極性越大，值越大；極性越大，RfRf值越小。值越小。離子交換色譜法離子交換色譜法（Ion exchange chromatography）離子交換樹脂上有可解離的陽離子或陰離子交換樹脂上有可解離的陽離子或陰離子基團，能離子基團，能可逆性可逆性的與被分離成分上的離的與被分離成分上的離子基團發(fā)生交換，使混合成分中子基團發(fā)生交換，使混合成分中離子型與非離子型與非離子型物質(zhì)離子型物質(zhì)或或具有不同離解度的離子化合物具有不同離解度的離

15、子化合物得到分離。得到分離。液液- -固色譜法固色譜法固定相：離子交換樹脂固定相：離子交換樹脂流動相：含強離子的水溶液流動相：含強離子的水溶液 分離具有解離能力的酸性、堿性及兩性化合分離具有解離能力的酸性、堿性及兩性化合物，如生物堿物，如生物堿、有機酸、酚酸、有機酸、酚酸、氨基酸等。氨基酸等。陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂：強酸性（強酸性（-SO-SO3 3-H-H+ +） 弱酸性（弱酸性（-COO-H-COO-H+ +） 陰離子交換樹脂：陰離子交換樹脂：強堿性（強堿性（-N+-N+（CHCH3 3）3 3ClCl- -） 弱堿性（弱堿性（-NH-NH2 2OHOH，-NH-NH-，-N=-N=

16、） 原理：原理：分子篩。分子篩。固定相：凝膠固定相：凝膠（具多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）（具多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)） 葡聚糖凝膠（葡聚糖凝膠（sephadex Gsephadex G） 羥丙基葡聚糖凝膠（羥丙基葡聚糖凝膠（ sephadex LH-20sephadex LH-20）流動相：流動相： 水或有機溶劑水或有機溶劑59 利用利用大孔樹脂具有大孔樹脂具有吸附性吸附性和和分子篩分子篩作用，作用，使天然藥物中相對分子量大小及吸附力強弱不使天然藥物中相對分子量大小及吸附力強弱不同的化學(xué)成分得以同的化學(xué)成分得以分離。分離。液液- -固色譜法固色譜法固定相：大孔吸附樹脂固定相：大孔吸附樹脂流動相：溶劑流動相：溶劑多孔網(wǎng)狀

17、結(jié)構(gòu)多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)吸附能力：分子間作用力吸附能力：分子間作用力 氫鍵氫鍵分子篩作用：多孔性質(zhì)分子篩作用：多孔性質(zhì) 對極性吸附劑來說，成分極性越大，越難對極性吸附劑來說，成分極性越大，越難洗脫；洗脫劑的極性越大，越易洗脫。洗脫；洗脫劑的極性越大，越易洗脫。在在經(jīng)典柱色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種經(jīng)典柱色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種具有高效、快速、高靈敏特點的色譜分離方法。具有高效、快速、高靈敏特點的色譜分離方法。二、氣相色譜法二、氣相色譜法流動相：氣體流動相：氣體固定相：液體或固體固定相：液體或固體基本原理：基本原理： 利用利用化學(xué)成分在氣體與固定相之間吸化學(xué)成分在氣體與固定相之間吸附能力不同或分配系數(shù)不同的差異而分離的附能力不同或分配系數(shù)不同的差異而分離的色譜分離方法。色譜分離方法。適用范圍：適用范圍：沸點低、易揮發(fā)的揮發(fā)油類沸點低、易揮發(fā)的揮發(fā)油類成分。成分。1 1、薄層色譜中，吸附劑、被分離物質(zhì)及溶劑、薄層色譜中，吸附劑、被分離物質(zhì)及溶劑三者之間的關(guān)系如何？三者之間的關(guān)系如何？2、聚酰胺分離下列黃酮類化合物時（以聚酰胺