微生物實(shí)驗(yàn)第一次實(shí)驗(yàn)用講義

1、實(shí)驗(yàn)一 普通光學(xué)顯微鏡的使用一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、基本原理、維護(hù)和保養(yǎng)方法。2. 掌握普通光學(xué)顯微鏡的正確使用方法。3. 學(xué)習(xí)微生物個(gè)體形態(tài)圖的畫法。二實(shí)驗(yàn)原理1. 普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)普通光學(xué)顯微鏡由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)組成。圖3-2 普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)示意圖（1）機(jī)械裝置（圖3-2）鏡座上顯微鏡的基座，起穩(wěn)定和支持整個(gè)機(jī)身的作用，使顯微鏡能平穩(wěn)放置在平面上，有的顯微鏡在鏡座內(nèi)裝有照明光源等。鏡柱是連接鏡座和鏡臂的短柱。鏡臂用以支持鏡筒，也是移動(dòng)顯微鏡時(shí)用手握住的部分。直筒顯微鏡的鏡座和鏡臂之間有一傾斜關(guān)節(jié)，可以使鏡臂傾斜一定的角度，便于觀察。但傾斜度一般不超過(guò)45

2、76;，避免顯微鏡失去重心而翻倒。鏡筒傾斜式顯微鏡無(wú)此關(guān)節(jié)。鏡筒是連接目鏡與物鏡的金屬筒。鏡筒上端插入目鏡，下端與物鏡轉(zhuǎn)換器相連。根據(jù)鏡筒的數(shù)目，光學(xué)顯微鏡可以分為單筒式和雙筒式兩類。單筒式又分為直筒式和傾斜式兩種；雙筒式均為傾斜式。鏡臺(tái)又被稱為載物臺(tái)，在鏡筒下方，是放置標(biāo)本的地方，為方形或圓形。鏡臺(tái)中央有一圓形通光孔，兩側(cè)各有一個(gè)用于固定被檢標(biāo)本片的壓片夾。有的顯微鏡則有標(biāo)本移動(dòng)器，移動(dòng)器上裝有彈簧夾，可固定標(biāo)本片。轉(zhuǎn)動(dòng)螺旋可以使標(biāo)本片前后和左右移動(dòng)。有的標(biāo)本移動(dòng)器上還帶有游標(biāo)尺，可指明標(biāo)本所在的位置。物鏡轉(zhuǎn)換器安裝在鏡筒的下端，其上裝有35個(gè)不同放大倍數(shù)的物鏡，使用時(shí)可通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器選

3、用合適的物鏡。為使用方便，物鏡應(yīng)按從低倍到高倍的順序安裝。轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)，必須用手按住圓盤旋轉(zhuǎn)，切勿用手指直接推動(dòng)物鏡，以免使物鏡和轉(zhuǎn)換器間的螺旋松脫而損壞顯微鏡。調(diào)節(jié)器安裝在鏡臂基部或鏡柱兩側(cè)的粗、細(xì)螺旋上，可調(diào)節(jié)物鏡與被檢標(biāo)本片之間的距離，以便清晰地觀察標(biāo)本。粗調(diào)螺旋旋轉(zhuǎn)一周可使鏡筒升降約10 mm，一般用于低倍鏡調(diào)焦；細(xì)調(diào)螺旋旋轉(zhuǎn)一周可使鏡筒升降約0.1 mm的距離，用于高倍鏡、油鏡或分辨物像清晰度的調(diào)焦。（2）光學(xué)部分物鏡安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上，是顯微鏡中很重要的光學(xué)部件，是由多塊透鏡組成的一個(gè)鏡頭組。根據(jù)物鏡的放大倍數(shù)和使用方法的不同，物鏡可以被分為低倍鏡、高倍鏡和油鏡三類。低倍鏡的放大倍數(shù)

4、常為4´、10´、20´；高倍鏡的放大倍數(shù)常為40´、45´；油鏡的放大倍數(shù)常為90´、95´、100´，油鏡鏡筒上刻有OI或HI或oil字樣，也有刻一圈紅線或黑線為標(biāo)記的，借以區(qū)別于其他物鏡。物鏡上標(biāo)出了物鏡的重要參數(shù)，包括放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑（NA）、鏡筒高度（物鏡底面到目鏡頂面的距離，單位是mm）及要求蓋玻片的厚度等。現(xiàn)舉例說(shuō)明其含義如下（圖3-3）： 圖3-3顯微鏡物鏡上的重要參數(shù)及大致的工作距離目鏡呈短圓筒狀，裝在顯微鏡上端。目鏡的功能是把物鏡放大的物像再次放大。目鏡由兩片透鏡組成，上面一塊為接目透鏡，下面

5、一塊為聚透鏡，在兩塊透鏡之間或聚透鏡的下方有一視野光闌。在進(jìn)行顯微鏡測(cè)量時(shí)目鏡測(cè)微尺要放在視野光闌上。目鏡上刻有放大倍數(shù)，如5´、10´、15´、20´等，可以根據(jù)需要選擇合適的目鏡。聚光鏡又稱聚光器，安裝在鏡臺(tái)下，由多塊透鏡組成，其作用是把平行的光線聚焦到標(biāo)本上，增強(qiáng)亮度。一般在鏡柱一側(cè)有一旋紐，可使聚光鏡升降。聚光鏡與物鏡配合使用，通常用低倍鏡時(shí)聚光鏡應(yīng)下降，而當(dāng)使用油鏡時(shí)聚光鏡應(yīng)升到最高位置。在聚光鏡的上方是虹彩光闌，俗稱光圈。光圈由十幾張金屬游片組成，通過(guò)調(diào)節(jié)光闌孔徑的大小，可以調(diào)節(jié)進(jìn)入物鏡的光線的強(qiáng)弱。在觀察較透明的標(biāo)本時(shí)，光圈宜小一些，這時(shí)分

6、辨率雖然降低，但反差增強(qiáng)，從而使透明的標(biāo)本看得更清楚；但不宜將光圈關(guān)得太小，以免由于光干涉現(xiàn)象而導(dǎo)致成像模糊。當(dāng)使用油鏡時(shí)，把光圈完全打開(kāi)，增強(qiáng)射入光線的強(qiáng)度。在光圈下常裝有濾光片架，可以放置不同顏色的濾光片。在聚光鏡下方的鏡座上，安裝有反光鏡。反光鏡是一個(gè)有平、凹兩個(gè)面的雙面鏡，可以在水平與垂直兩個(gè)方向上任意旋轉(zhuǎn)，其作用是采集光線并將光線射向聚光鏡。凹面鏡還能起到聚光的作用。因此，未安裝聚光鏡的顯微鏡及光源較弱時(shí)可應(yīng)用凹面鏡，而在光源較強(qiáng)及用聚光鏡時(shí)一般可用平面鏡。有的顯微鏡安裝有電光源，使用時(shí)不用通過(guò)反光鏡就可以進(jìn)行觀察。2. 普通光學(xué)顯微鏡的光學(xué)原理由單透鏡構(gòu)成的放大鏡和由幾塊透鏡組成的

7、實(shí)體顯微鏡稱單式顯微鏡。現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡是利用兩組透鏡系統(tǒng)來(lái)放大成像，故又被稱為復(fù)式顯微鏡。其光學(xué)原理是：由外界入射的光線經(jīng)反光鏡反射向上，或由內(nèi)光源發(fā)射的光線經(jīng)聚光鏡向上匯聚在被檢標(biāo)本上，由標(biāo)本反射或折射出的光線經(jīng)物鏡進(jìn)入，使光軸與水平面傾斜45°角的棱鏡在目鏡的視場(chǎng)光闌處，成放大的側(cè)光實(shí)像，該實(shí)像再經(jīng)目鏡的接目透鏡放大成虛像。（1）顯微鏡的放大倍數(shù)被檢標(biāo)本經(jīng)顯微鏡的物鏡和目鏡放大后的總放大倍數(shù)是：標(biāo)本放大倍數(shù)物鏡的放大倍數(shù)´目鏡的放大倍數(shù)。如：用40´的物鏡和10´的目鏡，總放大倍數(shù)是400´。（2）分辨率評(píng)價(jià)一臺(tái)顯微鏡的精密程度，不僅要

8、看其放大倍數(shù)，更重要的是看其分辨率。分辨率是指顯微鏡能夠辨別發(fā)光的兩個(gè)點(diǎn)的最小距離的能力，該最小的距離被稱為鑒別距離或分辨距離（R）。R的計(jì)算公式如下：R l（2NA）；其中，l代表入射光的波長(zhǎng)，NA代表物鏡的數(shù)值孔徑。 圖3-4 物鏡的進(jìn)口角1. 物鏡；2. 進(jìn)口角；3. 標(biāo)本面。NA的計(jì)算公式如下：NA= n´ sinq。其中，n代表光線進(jìn)入物鏡前所在介質(zhì)的折射率，q代表進(jìn)口角a（圖3-4）的半數(shù)。q的最大值不可能達(dá)到90°，故sinq<1。當(dāng)介質(zhì)為空氣時(shí)，n 1。所以干燥系下物鏡的數(shù)值孔徑都小于1。使用油鏡時(shí)，物鏡與標(biāo)本片之間的介質(zhì)是香柏油（n= 1.515）或

9、液體石蠟（n= 1.52），故而數(shù)值孔徑增大。因而油鏡的分辨率要優(yōu)于其他物鏡。（3）工作距離工作距離是指觀察標(biāo)本最清晰時(shí)，物鏡透鏡的下表面與標(biāo)本之間（無(wú)蓋玻片時(shí)）或與蓋玻片之間的距離。物鏡的放大倍數(shù)越大，工作距離越短。油鏡的工作距離最短，約為0.2 mm。不同放大倍數(shù)的物鏡的工作距離不同，但在同一臺(tái)顯微鏡中，不同放大倍數(shù)的物鏡切換時(shí)，只須進(jìn)行細(xì)調(diào)焦便可清晰地觀察到標(biāo)本。三實(shí)驗(yàn)器材普通光學(xué)顯微鏡、擦鏡紙、無(wú)水乙醇、香柏油、微生物標(biāo)本片（包括枯草芽孢桿菌Bacillus substilis、大腸桿菌Escherichia coli、四聯(lián)球菌Tetraggenococcus sp.、釀酒酵母Sacc

10、haromyces cerevisiae）四實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一）觀察前的準(zhǔn)備1顯微鏡的放置置顯微鏡于平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊緣約34 cm。2調(diào)節(jié)光源接通電源后，取下目鏡，直接向鏡筒內(nèi)觀察，調(diào)節(jié)聚光鏡上的孔徑光闌，使光闌孔徑與視野恰好一樣大或略小于視野。該步驟的目的是使入射光展開(kāi)的角度與物鏡的數(shù)值孔徑相一致，既可充分發(fā)揮該物鏡的分辨率，又能把超過(guò)該物鏡可能接受的多余光擋住，避免產(chǎn)生干擾。放回目鏡后，通過(guò)調(diào)節(jié)聚光鏡上的視野光闌或調(diào)節(jié)照明度控制鈕，選擇最佳的照明效果。（二）觀察一般情況下，特別是初學(xué)者，進(jìn)行顯微鏡觀察時(shí)應(yīng)遵循從低倍鏡到高倍鏡再到油鏡的順序，因?yàn)槲镧R的放大倍數(shù)越小，視野相對(duì)也越大，越

11、易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)及確定檢查的位置。1低倍鏡下觀察標(biāo)本（1）放置標(biāo)本：下降鏡臺(tái)或升高鏡筒，將標(biāo)本片放置在鏡臺(tái)上，用壓片夾夾緊，調(diào)節(jié)標(biāo)本移動(dòng)器使標(biāo)本片上有染色劑的部分處于物鏡正下方。（2）調(diào)焦：轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)螺旋，升高鏡臺(tái)或下降鏡筒，使低倍鏡頭的前端接近載玻片。用雙眼在目鏡上觀察，并轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)螺旋，使鏡臺(tái)下降或鏡筒上升直到可看到物像。然后轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)螺旋，使物像清晰。（3）觀察：尋找合適的目的菌，仔細(xì)觀察。2高倍鏡下觀察（1）尋找合適的視野：在低倍鏡下找到合適的目的菌，通過(guò)調(diào)節(jié)標(biāo)本移動(dòng)器使其移至視野中心。（2）轉(zhuǎn)換高倍鏡：用手按住物鏡轉(zhuǎn)換器慢慢旋轉(zhuǎn)，當(dāng)聽(tīng)到“咔嚓”一聲即表明物鏡已轉(zhuǎn)到正確的工作位置上。（3）調(diào)

12、焦：一般情況下，同一臺(tái)顯微鏡上的物鏡是同焦物鏡。也就是說(shuō)，從低倍鏡切換到高倍鏡后，只要稍微調(diào)節(jié)一下細(xì)調(diào)螺旋就可以看清物像。（4）觀察：仔細(xì)觀察標(biāo)本，比較與低倍鏡下的異同。3油鏡下觀察（1）尋找合適的視野：在高倍鏡下找到合適的目的菌，通過(guò)調(diào)節(jié)標(biāo)本移動(dòng)器使其移至視野中心。（2）加香柏油：從小瓶?jī)?nèi)取香柏油12滴，加到欲觀察的涂片上。（3）轉(zhuǎn)換油鏡：將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置，下降鏡筒，使油鏡浸入香柏油中，并從側(cè)面觀察，使鏡頭降至既非常接近標(biāo)本片，又不能與標(biāo)本片相接觸的合適位置。（4）調(diào)節(jié)亮度：調(diào)節(jié)聚光器到最高位置，打開(kāi)光圈到最大位置，使進(jìn)入油鏡的光線最多。（5）調(diào)焦：從目鏡中觀察，同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)粗螺旋，緩慢拉開(kāi)油

13、鏡和標(biāo)本片的距離，至出現(xiàn)模糊的物像時(shí)再用細(xì)調(diào)螺旋調(diào)節(jié)至物像清晰為止。若按上述操作找不到物像，有可能使開(kāi)始時(shí)油鏡頭下降未到位，也有可能是油鏡上升太快，以至眼睛捕捉不到一閃而過(guò)的物像。遇此情況，應(yīng)重新操作。（6）觀察：仔細(xì)觀察標(biāo)本，比較與低、高倍鏡下的異同，并細(xì)心繪制形態(tài)圖。（三）觀察后對(duì)顯微鏡和標(biāo)本片的處理1處理顯微鏡（1）轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)螺旋，使鏡筒和鏡臺(tái)的距離拉開(kāi)，取出標(biāo)本片。（2）清潔油鏡：先用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，然后用蘸少許無(wú)水乙醇的擦鏡紙擦掉殘留的香柏油，再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的無(wú)水乙醇。若使用液體石蠟作鏡油，可以只用擦鏡紙擦凈，不必使用無(wú)水乙醇。（3）清潔目鏡和其它物鏡：用擦鏡紙擦

14、凈其它的物鏡及目鏡。（4）清潔后應(yīng)將物鏡轉(zhuǎn)成“八字形”，緩慢上升鏡臺(tái)，使物鏡擱置在鏡臺(tái)上。將聚光鏡降至最低位置。在顯微鏡上套上鏡罩后放入顯微鏡柜中。2處理標(biāo)本片：對(duì)標(biāo)本片上的香柏油，要用拉紙法擦試。先把一張小擦鏡紙蓋在油滴上，再滴上23滴無(wú)水乙醇，平拉擦鏡紙，使其輕輕在標(biāo)本片上拖過(guò)。重新?lián)Q上干凈擦鏡紙后重復(fù)。23次后，肉眼觀察標(biāo)本片上無(wú)香柏油殘留即可。五注意事項(xiàng)1取顯微鏡時(shí)應(yīng)該用右手握住鏡臂，左手托住鏡座，使鏡身保持直立。切忌單手拎提顯微鏡。2. 所有鏡面切忌用手指、紗布、普通紙張擦試，以免磨損鏡面，需要時(shí)只能用擦鏡紙擦試。3. 粗、細(xì)調(diào)節(jié)螺旋調(diào)焦時(shí)，切忌采用對(duì)著目鏡邊觀察邊上升鏡臺(tái)的錯(cuò)誤操作

15、，應(yīng)從側(cè)面注視，以免壓壞標(biāo)本片和損壞鏡頭。油鏡的工作距離很短，操作時(shí)要尤其小心謹(jǐn)慎。4. 觀察標(biāo)本片時(shí)注意標(biāo)本片的正面，也就是涂布有微生物的一面向上。5. 觀察完畢后注意用正確的方法擦試標(biāo)本片上的殘余香柏油。動(dòng)作要輕柔，切勿將標(biāo)本片上涂有微生物的部分擦去。六實(shí)驗(yàn)記錄描繪微生物個(gè)體形態(tài)表3-2 微生物個(gè)體形態(tài)圖菌名：菌名：菌名：顯微鏡放大倍數(shù)：顯微鏡放大倍數(shù)：顯微鏡放大倍數(shù)：個(gè)體形態(tài)圖個(gè)體形態(tài)圖個(gè)體形態(tài)圖個(gè)體形態(tài)描述個(gè)體形態(tài)描述個(gè)體形態(tài)描述七預(yù)習(xí)思考題列出顯微鏡的低倍鏡、高倍鏡和油鏡的觀察對(duì)象。八思考題1. 使用油鏡觀察時(shí)為何要在標(biāo)本片和鏡頭之間滴加香柏油？2. 使用油鏡觀察時(shí)應(yīng)如何調(diào)節(jié)顯微鏡的

16、聚光鏡和光圈？3. 油鏡用畢后，為什么必須把油鏡上的香柏油擦凈？用過(guò)多的酒精擦拭會(huì)有什么危害？實(shí)驗(yàn)七 微生物的形態(tài)觀察一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 通過(guò)觀察認(rèn)識(shí)細(xì)菌的基本形態(tài)、細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)和群體形態(tài)；2. 通過(guò)觀察認(rèn)識(shí)放線菌的基本形態(tài)、孢子絲的形態(tài)和群體形態(tài)；3. 通過(guò)觀察認(rèn)識(shí)真菌的基本形態(tài)、特化結(jié)構(gòu)和群體形態(tài)；4. 鞏固光學(xué)顯微鏡的使用方法，重點(diǎn)掌握油鏡的使用方法。二實(shí)驗(yàn)原理微生物種類繁多，不同的微生物其個(gè)體形態(tài)和群體形態(tài)是不同的。因此微生物的形態(tài)是其分類鑒定的依據(jù)之一。最常見(jiàn)的細(xì)菌個(gè)體形態(tài)分為三類，分別為球菌、桿菌和螺旋菌，放線菌和霉菌的個(gè)體形態(tài)都為絲狀菌，酵母菌的個(gè)體形態(tài)為卵圓形。放線菌根據(jù)其孢子絲

17、的不同分為螺旋和直型等，根據(jù)分化的情況分為叢生和輪生等。霉菌的特化型菌絲有青霉菌的青霉穗，曲霉的足細(xì)胞和根霉的假根等。一個(gè)細(xì)胞在固體培養(yǎng)基上繁殖集聚成肉眼可見(jiàn)的集落稱為菌落。各種微生物在一定培養(yǎng)條件下形成的菌落具有一定的特征，包括菌落的大小、形狀、光澤、顏色、氣味、與培養(yǎng)基結(jié)合的牢固度等。一般而言細(xì)菌的菌落較小，表面光滑或粗糙，濕潤(rùn)或干燥，具有臭味，與培養(yǎng)基結(jié)合不牢固（易被挑起）。放線菌的菌落大小與細(xì)菌菌落大小相似，表面大多呈干燥粉狀，具有土腥味，與培養(yǎng)基結(jié)合牢固（不易被挑起）。有些放線菌的基內(nèi)菌絲能產(chǎn)水溶性或脂溶性色素（圖3-14）。 A B圖3-14 放線菌的基內(nèi)菌絲產(chǎn)生的色素（A.水溶性

18、色素，B.脂溶性色素）霉菌的菌落比細(xì)菌和放線菌的菌落大幾倍至幾十倍，菌落疏松呈絨毛狀或絮狀，具有霉味，與培養(yǎng)基結(jié)合牢固（不易被挑起）。酵母菌的菌落形態(tài)與細(xì)菌相似，但比細(xì)菌菌落大且厚，表面光滑、濕潤(rùn)、粘稠，與培養(yǎng)基結(jié)合不牢固（易被挑起）。常見(jiàn)酵母菌大多為乳白色，釀酒酵母具有酒香味。三實(shí)驗(yàn)器材1.微生物基本形態(tài)標(biāo)本片（1）細(xì)菌：四聯(lián)球菌（Tetraggenococcus sp.）、藤黃八疊球菌（Sarcina lutea）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、逗號(hào)弧菌（Vib

19、rio comma）（2）放線菌：林可鏈霉菌（Streptomyces lincolnensis）（3）霉菌：青霉菌（Penicillium sp.）、根霉（Rhizopus sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）、毛霉（Mucor sp.）（4）酵母：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2.微生物特殊結(jié)構(gòu)標(biāo)本片（1）殺螟桿菌（Bacillus cereus）不同生長(zhǎng)階段標(biāo)本片：用于觀察芽孢的形成（2）圓褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）：用于觀察莢膜（3）鏈霉菌（Streptomyces sp.）孢子絲：用于觀察不同鏈霉菌孢子絲的形態(tài)（4）青霉、曲霉、根霉、毛霉特化菌絲：用于觀察霉菌菌絲的不同特化形態(tài)3微生物菌落平板：大腸桿菌、四聯(lián)球菌、枯草芽孢桿菌、林可鏈霉菌、青霉菌、曲霉、毛霉、根霉、釀酒酵母、噬菌斑4儀器和其他材料：顯微鏡，擦鏡紙，香柏油，無(wú)水乙醇四實(shí)驗(yàn)步驟1. 微生物個(gè)體形態(tài)的觀察（1）將需觀察的標(biāo)本片置于光學(xué)顯微鏡載物臺(tái)上，用十字