基于微流控的細(xì)胞操縱技術(shù)

1、基于微流控的細(xì)胞操縱技術(shù) 專業(yè)： 集成電路工程 課程： 微型電子機(jī)械系統(tǒng) 學(xué)號： 2014021628 姓名： 老師： 秦水介 中國貴州貴陽2015年 4月基于微流控的細(xì)胞操縱技術(shù)摘 要： 細(xì)胞操縱技術(shù)是目前細(xì)胞生物學(xué)、微系統(tǒng)科學(xué)及藥物篩選等學(xué)科交叉領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，能夠?qū)Σ煌N類的細(xì)胞進(jìn)行有效的操縱，一直是學(xué)術(shù)界所面臨的重要問題。隨著微流體技術(shù)的不斷發(fā)展，微流體芯片正在越來越廣泛地應(yīng)用在細(xì)胞操縱的領(lǐng)域。本文從微流體的技術(shù)特點(diǎn)出發(fā)，結(jié)合現(xiàn)有的傳統(tǒng)細(xì)胞操縱技術(shù)，以及其與微流體技術(shù)的對比，對微流體在細(xì)胞操縱領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展作綜述性介紹關(guān)鍵詞：細(xì)胞操縱；微流控芯片；介電泳；免疫磁珠；光鑷引 言細(xì)胞

2、是生物體和生命活動(dòng)的基本單位，細(xì)胞操縱對于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的研究、生命活動(dòng)規(guī)律和本質(zhì)的探索、疾病的診斷與治療、藥物的篩選與設(shè)計(jì)等都具有十分重要的意義。針對細(xì)胞研究應(yīng)用而生的細(xì)胞操縱技術(shù)一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，其中包括諸如介電泳法、電阻抗法、免疫磁珠法、力學(xué)特性法等一系列有效方法。然而，現(xiàn)存的方法或儀器中，或多或少都存在著各種各樣的缺點(diǎn)。隨著微納米技術(shù)和微流體技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞操縱技術(shù)正在朝著更精細(xì)的操作方式發(fā)展。微流體是一種可以操作微量級至10-9到10-18升液體的微小器件，在微流體芯片上往往集成有許多細(xì)小的流道，以便液體通過以及進(jìn)行操作。由于在微流控芯片中對于細(xì)胞的研究更接近細(xì)胞在體內(nèi)的真實(shí)狀

3、態(tài)；同時(shí)，微流控芯片具有分離效率高、分析速度快、分離模式多、所需樣品少、應(yīng)用范圍廣、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。這一系列的優(yōu)點(diǎn)都使得它在時(shí)間和空間上為分子和細(xì)胞的分離、純化、分析提供了更好的方法。1 細(xì)胞操縱技術(shù)難點(diǎn)及要求：歸納起來，對細(xì)胞操縱主要有如下要求：1) 對細(xì)胞本身的傷害比較小，確保細(xì)胞的原生性狀；2) 對細(xì)胞的分離精確，分離識別率高；3) 所需要的細(xì)胞數(shù)目少，或者是在一種較大量的細(xì)胞中分離出較小量的細(xì)胞；4) 成本低，操作簡便，易于臨床使用。2 傳統(tǒng)細(xì)胞操縱方法類型方法概述細(xì)胞粘性利用細(xì)胞表面糖蛋白的變化進(jìn)行檢測和分離化學(xué)方法免疫磁珠MACS Microbeads 特異性標(biāo)記牽拉形變通過對

4、細(xì)胞施加梯度切應(yīng)力改變細(xì)胞遷移速度非電學(xué)物大小、體積不同細(xì)胞的基本物理屬性，圖像法判別理方法運(yùn)動(dòng)特性細(xì)胞在層流中的運(yùn)動(dòng)特性的不同密度梯度離心percoll連續(xù)密度梯度分離法流式細(xì)胞儀熒光標(biāo)記法電學(xué)方法阻抗法高頻交流電下細(xì)胞阻抗的特異性介電泳介電常數(shù)較低的物體在非勻強(qiáng)電場中的受力現(xiàn)象3 微流控細(xì)胞操縱技術(shù)3.1 微流控技術(shù)簡介微流體系統(tǒng)是微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)技術(shù)的關(guān)鍵領(lǐng)域之一，是指能在微觀尺寸下實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜流體的控制、操作和檢測的系統(tǒng)，包括微傳感器、微通道、微泵、微閥等元件，是微流控技術(shù)的核心部件。由于釆用微流體系統(tǒng)的控制單元可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞探測物的原位分析，與傳統(tǒng)檢測方法相比，有更短的響應(yīng)時(shí)間，并且

5、所用的待測細(xì)胞溶液與反應(yīng)試劑用量更低，現(xiàn)已成為用于細(xì)胞狀態(tài)分析、基因研究、藥物蹄選等方面研究非常重要的一種分析手段。此外，由于在現(xiàn)有技術(shù)水平下的微流道尺寸與細(xì)胞的特征尺寸有良好的相容性，可利用微流體系統(tǒng)高度模擬及還原一個(gè)體內(nèi)細(xì)胞生存的微環(huán)境，這大大提高了細(xì)胞探測的準(zhǔn)確度和可靠性。因此，微流體系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)對研究細(xì)胞形態(tài)及疾病病理研究有重要的現(xiàn)實(shí)意義，成為細(xì)胞及單細(xì)胞實(shí)時(shí)檢測的新研究方向。3.2 微流體運(yùn)動(dòng)的主要限制因素在MEMS結(jié)構(gòu)器件中，牛頓力學(xué)理論仍適用于多個(gè)物理場分析中，然而隨著尺寸的縮小，宏觀與微觀領(lǐng)域的物理規(guī)律卻不盡相同，使影響宏觀系統(tǒng)中比較重要的參數(shù)、物理性質(zhì)在微觀領(lǐng)域不再是主導(dǎo)

6、因素，其影響因素的相對重要性在兩種領(lǐng)域發(fā)生了變化。從而在微尺度下，微流體系統(tǒng)的特性與宏觀情況下相差甚遠(yuǎn)。下面總結(jié)了幾點(diǎn)影響微流體流動(dòng)的主要限制因素。3.2.1 尺度效應(yīng)在微流體系統(tǒng)中,作用于流體上的力不再是宏觀物理現(xiàn)象中的長度等特征因素，而是體積力與表面力。隨著尺度的減小，微流體的體積不斷縮小，起主導(dǎo)作用的體積力變換為表面力，在表面力作用不斷加強(qiáng)的情況下，表面力將起主要作用，在微小機(jī)械器件中，這一特性可能會(huì)使流體的連續(xù)性幾乎完全失效。從而導(dǎo)致了作用于宏觀和微觀系統(tǒng)的各影響因素對流體產(chǎn)生的影響程度主次排列順序會(huì)有較大差異，如受幾何力而產(chǎn)生的尺寸和形狀變化、材料的物理特性、幾何結(jié)構(gòu)的變化等因素的影

7、響程度會(huì)在不同情況下發(fā)生變化，從而使所運(yùn)用的物理規(guī)律也就不同。3.2.2 表面張力液體表面的分子受氣體分子的作用，有向內(nèi)部收縮的趨勢，從而表現(xiàn)出表面張力特性，表面張力的大小用表面張力系數(shù)表示，在宏觀條件下，通?？梢院雎圆挥?jì)，但在微觀條件下，表面張力是一個(gè)重要影響因素。以水在毛細(xì)管流動(dòng)為例，當(dāng)毛細(xì)管中進(jìn)入一個(gè)氣泡，為了使水能沿毛細(xì)管流動(dòng)，需施加壓強(qiáng)(指克服沿程損失所需施加的壓強(qiáng)，不包括在出口處的凈壓強(qiáng))，當(dāng)氣泡在毛細(xì)管運(yùn)動(dòng)時(shí)，產(chǎn)生的兩個(gè)表面張力水平分量是不等的，這樣需要由兩邊的壓力差來平衡，從而大大增加了沿程損失，因此，在微米尺度條件下，表面張力是影響微流體特性的一個(gè)主要因素。3.2.3 流體粘

8、度特性在宏觀條件下，若溫度相差不大，流體粘度一般不變，粘度只與流體本身性質(zhì)有關(guān)，在微觀條件下，流體粘度受多方面因素的影響。流體在不同截面形狀的微管道中流動(dòng)時(shí)，粘度各不相同，而且粘度與溫度、壓強(qiáng)有關(guān)。目前尚不能用量化方式準(zhǔn)確表達(dá)粘度與各種因素的關(guān)系，但由于粘度成為管道尺寸、截面形狀、溫度、壓強(qiáng)等的函數(shù)，在N-S方程中，不能把粘度認(rèn)為是常量，用N-S方程來解釋微流體特性需要嚴(yán)格限制其應(yīng)用條件。3.2.4 表面粗糙度表面粗糙度是影響微流體流動(dòng)的又一重要因素，宏觀流體中管道側(cè)壁的粗糙度對流動(dòng)特性影響甚小，起主要影響作用的是流體中的分子間作用力，有為了簡化分析模型，甚至可以將粗糙度對流體的作用忽略不計(jì)。

9、但是，對于微觀流體而言，由于尺寸的減小，不平整的側(cè)壁會(huì)對流體間分子相互作用產(chǎn)生影響進(jìn)而對流動(dòng)效果造成影響。因此，對于微觀流體要考慮管壁粗糙度對流體運(yùn)動(dòng)的影響，隨著微流動(dòng)的流體分子與管壁面的作用力增大，這一因素成為影響微流體、流動(dòng)性質(zhì)的主導(dǎo)參數(shù)。3.2.5 邊界層滑移在流體動(dòng)力學(xué)中，由于滿足管壁的無滑移邊界條件，通常認(rèn)為運(yùn)動(dòng)在管道中的流體的速度分布是沿著管道的巾心軸方向依次增加的。微觀尺度不同于宏觀流體情況，側(cè)壁邊界會(huì)對微流體產(chǎn)生顯著影響。在微觀范圍內(nèi)，固體的邊界無滑移條件應(yīng)分情況討論：1nm1m的尺寸之間，靜電力起主導(dǎo)作用；1m1mm的尺寸之間，流體與側(cè)壁的相互影響和擠壓而造成的沿程損失起主導(dǎo)

10、作用。3.3 微流控技術(shù)在細(xì)胞操縱領(lǐng)域的應(yīng)用3.3.1 基于介電泳的細(xì)胞操縱微流控技術(shù)介電泳(DEP)，也稱雙向電泳，是介電常數(shù)較低的物體在非勻強(qiáng)電場中受力的現(xiàn)象。介電力大小與物體是否帶電無關(guān)，與物體的大小、電學(xué)性質(zhì)、周圍介質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)，以及外加電場的場強(qiáng)、場強(qiáng)變化率、頻率有關(guān)。由于介電泳成本低，科學(xué)上正在研究用介電泳來操作細(xì)胞、DNA、蛋白質(zhì)等，以此來取代光探針(optical tweezer)或磁探針(magnetic tweezer)。該方法非常適用于具有明顯臨界頻率特征的兩種類型生物粒子分離，即在臨界頻率下，一種類型的粒子受到正的介電泳力，粒子向電極方向移動(dòng)；另一種類型的粒子受負(fù)的介電

11、泳力，粒子向遠(yuǎn)離電極的方向移動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)生物粒子的分離。DEP的優(yōu)點(diǎn)是易與流體系統(tǒng)結(jié)合、不須標(biāo)定、對少見的細(xì)胞有高選擇性。但傳統(tǒng)的DEP分離系統(tǒng)的步驟操作是非連續(xù)的，且受限于DEP作用范圍小，主要應(yīng)用在流場中偏移細(xì)胞，往往限制了其操作效率及需要復(fù)雜的流體裝置，且目標(biāo)細(xì)胞因DEP力作用容易困在電極上，不易將其釋放，進(jìn)而造成了目標(biāo)細(xì)胞長期暴露在高電場的作用之下。為改進(jìn)傳統(tǒng)DEP細(xì)胞分離的缺點(diǎn)，許多研究以交替的流體系統(tǒng)、鞘流、改變電極形狀、柱狀數(shù)組與三維分布的電極為基礎(chǔ)，發(fā)展了連續(xù)的細(xì)胞分離裝置，雖然目標(biāo)細(xì)胞的釋放問題因此有所改善，但仍需復(fù)雜的流體裝置，也限制了其分離的產(chǎn)率。3.3.2 使用免疫磁珠

12、進(jìn)行細(xì)胞操縱的微流控技術(shù)免疫磁珠細(xì)胞分選方法可以在幾分鐘內(nèi)從復(fù)雜的細(xì)胞混合物中分離出很高純度的細(xì)胞。把細(xì)胞用超級順磁性的MACS微型磁珠(MACS Micro Beads)特異性地標(biāo)記，磁性標(biāo)記完后，把這些細(xì)胞通過一個(gè)放在強(qiáng)而穩(wěn)定磁場中的分選柱。分選柱里的基質(zhì)造成一個(gè)高梯度磁場。被磁性標(biāo)記的細(xì)胞滯留在柱里而未被標(biāo)記的細(xì)胞則流出。當(dāng)分選柱移出磁場后，滯留柱內(nèi)的磁性標(biāo)記細(xì)胞就可以被洗脫出來，這樣就完全可以獲得標(biāo)記和未標(biāo)記的兩個(gè)細(xì)胞組份。免疫磁珠法分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接

13、著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細(xì)胞得以分離。此外，這一磁性分離系統(tǒng)除了具有抗原抗體特異性配對的優(yōu)點(diǎn)之外，還具有收集待測物的功能，標(biāo)定的細(xì)胞在外加磁場消失之后，可以隨流體流出并且進(jìn)行收集。免疫磁珠的方法目前已經(jīng)發(fā)展成為大型平臺。然而，此方法不能同時(shí)收集多種細(xì)胞，而且磁力對細(xì)胞的傷害較大，是該種方法的缺點(diǎn)。3.3.3 利用激光光鑷進(jìn)行細(xì)胞操縱光子具有動(dòng)量，當(dāng)一束高度匯聚的激光束照射在微粒上時(shí)，由于微粒對光的折射、反射和吸收將產(chǎn)生一個(gè)非常小的梯度力，這個(gè)梯度力將微粒束縛在激光焦點(diǎn)附近，起到了一個(gè)光學(xué)陷阱的作用。Ashkin.A首次報(bào)道了用該項(xiàng)技術(shù)無損傷地捕獲細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，并稱

14、之為“光鑷”。初步研究表明：由于光鑷的特點(diǎn)，其在分子生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞工程、基因工程等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。利用光鑷技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對活細(xì)胞細(xì)胞器固定、懸浮和分選，對染色體的捕捉，對活的細(xì)胞內(nèi)部的微粒進(jìn)行精確的重新定位；光鑷技術(shù)還可以用來進(jìn)行基因?qū)?，進(jìn)行細(xì)胞融合等操作。激光光鑷操作技術(shù)具有非接觸、對樣品無污染、操作精度高等優(yōu)點(diǎn)。然而，在光鑷直接用于捕獲和操作生物細(xì)胞時(shí)，對被捕獲細(xì)胞施加的光學(xué)損傷阻礙了光鑷的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，可以通過選擇一些近紅外激光，如Nd:YAG (波長1064 nm)，Nd:YLF，二極管或Ti:sapphire作為激光源來減小光鑷對細(xì)胞的光學(xué)損傷作用。除了這些方法，在光

15、學(xué)捕獲中，可以使用兩個(gè)發(fā)散光束而不是一個(gè)高度集中的光束來減少光學(xué)損傷。3.3.4 其他微流控細(xì)胞操縱技術(shù)機(jī)械操縱法：機(jī)械操縱法主要是指利用微機(jī)械加工技術(shù)，在芯片上刻蝕出各種結(jié)構(gòu)，如微篩、微阱、微溝、梳狀、堰狀、沙袋等，根據(jù)細(xì)胞尺寸的差異進(jìn)行物理分離的一種方法。它具有工作原理簡單，不需要特殊的緩沖液等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是制作微結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，而且要求目標(biāo)細(xì)胞和雜質(zhì)細(xì)胞必須有明顯的尺寸差異，分辨率低。體積細(xì)胞篩選：細(xì)胞是低頻電流的絕緣體，當(dāng)細(xì)胞在一個(gè)容量固定的腔體里發(fā)生體積變化時(shí)，會(huì)減少整個(gè)腔體內(nèi)的溶液數(shù)量，因而改變整個(gè)腔體的電阻。根據(jù)這個(gè)原理，Ateya等設(shè)計(jì)了一種硅芯片，可以檢測到1 mOsm(即2.35

16、73 Pa)滲透壓引起的細(xì)胞體積的變化，導(dǎo)致溶液電阻的變化，實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞的同時(shí)檢測和篩選。庫爾特計(jì)數(shù)法：庫爾特技術(shù)是同樣是以電阻的變化作為區(qū)分參數(shù)，用于芯片上的細(xì)胞分選。Chun等在玻璃芯片內(nèi)聚合高分子化合物作為鹽橋，令細(xì)胞通過鹽橋，引起阻抗響應(yīng)值變化，這種變化與細(xì)胞大小有關(guān)，因此可用于人紅細(xì)胞和白細(xì)胞的分選。4 總 結(jié)利用微流體芯片的有效細(xì)胞分離和篩選方法一直是研究者們的重點(diǎn)和熱點(diǎn)研究方向，本文先介紹了細(xì)胞操縱的要求和一般的操縱方法，然后對目前已有的常見微流體細(xì)胞操縱技術(shù)進(jìn)行了較為詳細(xì)的介紹和綜述，并且對各個(gè)技術(shù)的應(yīng)用范圍、優(yōu)勢和存在的問題進(jìn)行了分析和比較?？梢钥吹?，每種方法都有自己的優(yōu)勢，

17、也有自己的缺陷。在實(shí)際應(yīng)用的過程中，往往會(huì)把多種方法相結(jié)合，來獲得更加有效的分離和篩選效果，并盡可能減輕對細(xì)胞的損害。目前能夠完全精確將細(xì)胞分離的方法幾乎不存在，從這方面來講，過往的研究方法仍需要改進(jìn)，特別是新的檢測理念和方法在未來的研究中至關(guān)重要。為了更簡單的實(shí)現(xiàn)細(xì)胞操縱，在研究過程中應(yīng)將多種方法加以結(jié)合，實(shí)現(xiàn)多模式的操作。研究方法在組合上，可以起到一加一大于二的效果，也令整個(gè)過程更加準(zhǔn)確。該領(lǐng)域的最終目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)將細(xì)胞進(jìn)行更加精確的操縱，并將其應(yīng)用在疾病的早期診斷和治療方面，從而緩解乃至解決人類所面臨的重大疾病難題。參考文獻(xiàn)：1 杜少博. 一種應(yīng)用于生物細(xì)胞檢測的微流體陣列設(shè)計(jì)與仿真D.太原理工大 學(xué),2013.2 鮑小凡,劉冉,劉靜. 面向細(xì)胞分離的微流控技術(shù)J. 中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào),2013,02:226-238.3 王瑞金. 微通道中流體擴(kuò)散和混合機(jī)理及其微混合器的研究D.浙江大學(xué),2005.4 邵建波,金慶輝,趙建龍.細(xì)胞微系統(tǒng)技術(shù)及其應(yīng)用J. 細(xì)胞生物學(xué)雜志,2007,06:859-863.5 楊秀娟,李想,童艷麗,李偶連,劉翠,陳纘光. 微流控芯片在細(xì)胞分析中的