第十六章 沉淀分離法

1、第十六章第十六章沉淀分離法沉淀分離法 沉淀法沉淀法： 利用某種沉淀劑或改變條件，使所需提取利用某種沉淀劑或改變條件，使所需提取的物質(zhì)或雜質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成的物質(zhì)或雜質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成無(wú)定形固體沉淀的過(guò)程。無(wú)定形固體沉淀的過(guò)程。 具有濃縮和分離的雙重作用。具有濃縮和分離的雙重作用。 在蛋白質(zhì)、酶、多肽、核酸和其他細(xì)胞組在蛋白質(zhì)、酶、多肽、核酸和其他細(xì)胞組分的回收和分離中應(yīng)用的很多。分的回收和分離中應(yīng)用的很多。鹽析沉淀法鹽析沉淀法有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法成鹽沉淀法成鹽沉淀法高分子聚合物沉淀高分子聚合物沉淀選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法 一、鹽析沉淀法一

2、、鹽析沉淀法 鹽析法鹽析法： 在在高濃度高濃度中性鹽存在下，欲分離物質(zhì)在中性中性鹽存在下，欲分離物質(zhì)在中性鹽水溶液中的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀。鹽水溶液中的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀。 早在早在19世紀(jì)鹽析法就被用于從血液中分離蛋世紀(jì)鹽析法就被用于從血液中分離蛋白質(zhì)，目前該方法仍廣泛用來(lái)回收或分離蛋白白質(zhì)，目前該方法仍廣泛用來(lái)回收或分離蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)。質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)。 （一）基本原理（一）基本原理 蛋白質(zhì)的溶解特性取決于其組成、構(gòu)象、周蛋白質(zhì)的溶解特性取決于其組成、構(gòu)象、周圍環(huán)境的物理化學(xué)性質(zhì)以及溶劑的可利用度。圍環(huán)境的物理化學(xué)性質(zhì)以及溶劑的可利用度。 這些性質(zhì)就本質(zhì)而言是水分子

3、間的這些性質(zhì)就本質(zhì)而言是水分子間的氫鍵氫鍵和蛋白和蛋白質(zhì)表面所暴露出的質(zhì)表面所暴露出的N、O原子的相互作用原子的相互作用，所以，所以易受溶液溫度、易受溶液溫度、pH值、介電常數(shù)和離子強(qiáng)度等值、介電常數(shù)和離子強(qiáng)度等參數(shù)的影響。參數(shù)的影響。 蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶可溶的，的， 表面：大部分是親水基團(tuán)表面：大部分是親水基團(tuán) 內(nèi)部：大部分是疏水基團(tuán)內(nèi)部：大部分是疏水基團(tuán)蛋白質(zhì)呈穩(wěn)定蛋白質(zhì)呈穩(wěn)定的分散狀態(tài)的分散狀態(tài)兩性物質(zhì)，一定兩性物質(zhì)，一定pHpH下表面帶有一定的下表面帶有一定的電荷，電荷，靜電斥力作用靜電斥力作用使分子間相互排斥使分子間相互排斥蛋白質(zhì)周圍的水分子有序排列

4、，在表面蛋白質(zhì)周圍的水分子有序排列，在表面形成形成水化膜水化膜，這一層能保護(hù)蛋白質(zhì)粒子，這一層能保護(hù)蛋白質(zhì)粒子避免因碰撞而聚沉。避免因碰撞而聚沉。 當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽中性鹽時(shí)：時(shí)：低鹽低鹽-鹽溶鹽溶( (低鹽情況下，隨著中性鹽離子強(qiáng)度的低鹽情況下，隨著中性鹽離子強(qiáng)度的增加，蛋白質(zhì)溶解度增大增加，蛋白質(zhì)溶解度增大) )高鹽高鹽-鹽析鹽析( (高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度隨之減小高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度隨之減小) )鹽離子部分中和蛋白鹽離子部分中和蛋白質(zhì)的電性，使分子間質(zhì)的電性，使分子間排斥作用減弱排斥作用減弱中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，鹽離子在水中

5、發(fā)生水化作用鹽離子在水中發(fā)生水化作用從而使從而使蛋白質(zhì)脫去水化膜蛋白質(zhì)脫去水化膜，暴露出疏水區(qū)域暴露出疏水區(qū)域H+OH-+ +pHpI,pHpI,pHpI,帶負(fù)電，帶負(fù)電，有水膜，是穩(wěn)定有水膜，是穩(wěn)定的親水膠體的親水膠體_+ _pH=pIpH=pI時(shí)時(shí), , 有水膜，有水膜，是不穩(wěn)定的親水是不穩(wěn)定的親水膠體膠體中性鹽中性鹽破壞水膜破壞水膜+ +中性鹽中性鹽破壞水膜破壞水膜_+ _中性鹽中性鹽破壞水膜破壞水膜_中性鹽中性鹽中和電荷中和電荷SOSO4 42-2-中性鹽中性鹽中和電荷中和電荷NHNH4 4+ +或或NaNa+ +蛋白質(zhì)的鹽析機(jī)制示意圖蛋白質(zhì)的鹽析機(jī)制示意圖蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)沉淀 蛋白質(zhì)

6、在水中的溶解度不僅與中性鹽離子的濃蛋白質(zhì)在水中的溶解度不僅與中性鹽離子的濃度有關(guān)，還與度有關(guān)，還與離子所帶電荷數(shù)離子所帶電荷數(shù)有關(guān)，高價(jià)離子影有關(guān)，高價(jià)離子影響更顯著。響更顯著。 通常用通常用離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度表示對(duì)鹽析的影響。表示對(duì)鹽析的影響。1 2 3 4 5 61.02.52.00.5-0.5-1.0-1.5 01.5碳氧血紅蛋白的碳氧血紅蛋白的lgS與與(NH4)2SO4離子強(qiáng)離子強(qiáng)度度的關(guān)系的關(guān)系S0(離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度)lgS鹽析鹽析鹽溶鹽溶鹽析區(qū)鹽析區(qū):lgS = - Ks 蛋白質(zhì)溶解度蛋白質(zhì)溶解度常數(shù)常數(shù)鹽析常數(shù)鹽析常數(shù) 鹽離子強(qiáng)度鹽離子強(qiáng)度蛋白質(zhì)溶解度蛋白質(zhì)溶解度起始蛋白起始蛋白

7、濃度濃度 （二）無(wú)機(jī)鹽的選擇（二）無(wú)機(jī)鹽的選擇 在蛋白質(zhì)鹽析中，常用的鹽析劑有在蛋白質(zhì)鹽析中，常用的鹽析劑有(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4, , Na2SO4， MgSO4，NaH2PO4，NaCl， Na3PO4, K3PO4。(NH4)2SO4原因原因廉價(jià)廉價(jià)在水中溶解度大，且溶解度隨溫度變?cè)谒腥芙舛却螅胰芙舛入S溫度變化小，低溫下仍具有較大的溶解度化小，低溫下仍具有較大的溶解度對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)的活力無(wú)損害對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)的活力無(wú)損害0 20 40 60 80 100中性鹽中性鹽溫度（溫度（oC）(NH4)2SO4Na2SO4MgSO4NaH2PO470.6 75.4 81.0

8、 88.0 95.3 1034.9 18.9 48.3 45.3 43.3 42.2 - 34.5 44.4 54.6 63.6 70.81.6 7.8 54.1 82.6 93.8 101 常用鹽析劑在水中的溶解度（常用鹽析劑在水中的溶解度（g/100ml水）水）鹽析效果：陰離子鹽析效果：陰離子 陽(yáng)離子陽(yáng)離子尤其以尤其以高價(jià)陰離子高價(jià)陰離子更為明顯。更為明顯。常見陰離子常見陰離子的鹽析作用順序：的鹽析作用順序：PO43- SO42- CH3COO Cl NO3 ClO4 I SCN陽(yáng)離子陽(yáng)離子對(duì)鹽析效果的影響：對(duì)鹽析效果的影響：Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb+ N

9、H4+ K+ Na+ Li+無(wú)機(jī)鹽可按兩種方式加入溶液中：無(wú)機(jī)鹽可按兩種方式加入溶液中：直接加入固體直接加入固體(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4粉末粉末工業(yè)生產(chǎn)工業(yè)生產(chǎn) ( (分批加入，充分?jǐn)嚢璺峙尤?，充分?jǐn)嚢? )加入加入(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4飽和溶液飽和溶液實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模生產(chǎn) ( (防止溶液局部過(guò)濃，但加量較多時(shí)溶液會(huì)被稀釋防止溶液局部過(guò)濃，但加量較多時(shí)溶液會(huì)被稀釋) ) （三）影響鹽析的各種因素（三）影響鹽析的各種因素 無(wú)機(jī)鹽的加入量無(wú)機(jī)鹽的加入量蛋白質(zhì)的濃度蛋白質(zhì)的濃度溫度溫度pHpH操作方式操作方式1.1.無(wú)機(jī)鹽加入量的影響無(wú)機(jī)鹽

10、加入量的影響1 2 3 4 5 61.02.52.00.5-0.5-1.0-1.5 01.5S0(離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度)lgS鹽析鹽析蛋白質(zhì)溶解度蛋白質(zhì)溶解度0 2 4 6 8 10-0.500.50-1.00(離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度)lgS蛋白質(zhì)溶解度蛋白質(zhì)溶解度 0不同蛋白質(zhì)溶解度與離子強(qiáng)度的關(guān)系不同蛋白質(zhì)溶解度與離子強(qiáng)度的關(guān)系蛋白質(zhì)種類不同，鹽析所用的無(wú)機(jī)鹽量也不同蛋白質(zhì)種類不同，鹽析所用的無(wú)機(jī)鹽量也不同 對(duì)于特定的蛋白質(zhì)，一定操作條件下產(chǎn)生沉對(duì)于特定的蛋白質(zhì)，一定操作條件下產(chǎn)生沉淀時(shí)的無(wú)機(jī)鹽濃度范圍都是一定的，即具有一淀時(shí)的無(wú)機(jī)鹽濃度范圍都是一定的，即具有一定的蛋白質(zhì)鹽析分布曲線。定的蛋白質(zhì)鹽析

11、分布曲線。 30lgS蛋白質(zhì)溶解度蛋白質(zhì)溶解度20 30 40 50 60 702040100P不同不同(NH4)2SO4 飽和度飽和度C0蛋白質(zhì)沉淀的速度可用蛋白質(zhì)沉淀的速度可用 - - 對(duì)鹽飽和度（對(duì)鹽飽和度（P P）作圖來(lái)表示：作圖來(lái)表示：dSdP 620 30 40 50 60 704820dSdP 蛋白質(zhì)溶解度隨蛋白質(zhì)溶解度隨(NH4)2SO4 飽和度而變化的速率飽和度而變化的速率P利用不同利用不同蛋白質(zhì)鹽析分布蛋白質(zhì)鹽析分布曲線曲線在橫軸上的位置不同，在橫軸上的位置不同，可采取可采取先后加入不同量無(wú)先后加入不同量無(wú)機(jī)鹽機(jī)鹽的辦法來(lái)分級(jí)沉淀蛋的辦法來(lái)分級(jí)沉淀蛋白質(zhì)。白質(zhì)。2.2.蛋白

12、質(zhì)濃度的影響蛋白質(zhì)濃度的影響 蛋白質(zhì)濃度不同，沉淀所需無(wú)機(jī)鹽用量也不同。蛋白質(zhì)濃度不同，沉淀所需無(wú)機(jī)鹽用量也不同。 隨濃度提高，鹽用量減少隨濃度提高，鹽用量減少。 640 50 60 70 804820dSdP P不同濃度碳氧肌紅蛋白的鹽析分布曲線不同濃度碳氧肌紅蛋白的鹽析分布曲線3g/L30g/L分級(jí)沉淀分級(jí)沉淀：將溶液稀釋，使重將溶液稀釋，使重疊曲線拉開距離疊曲線拉開距離制取成品制取成品：提高蛋白質(zhì)濃度提高蛋白質(zhì)濃度3.3.溫度的影響溫度的影響低鹽濃度：溫度升高，溶解度升高低鹽濃度：溫度升高，溶解度升高高鹽濃度：溫度升高，溶解度降低高鹽濃度：溫度升高，溶解度降低 溫度適當(dāng)提高有利于蛋白質(zhì)沉

13、淀。溫度適當(dāng)提高有利于蛋白質(zhì)沉淀。 高溫容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。高溫容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。 蛋白質(zhì)鹽析一般在蛋白質(zhì)鹽析一般在室溫室溫下進(jìn)行，某些溫下進(jìn)行，某些溫度敏感性的蛋白質(zhì)鹽析最好在低溫下進(jìn)行。度敏感性的蛋白質(zhì)鹽析最好在低溫下進(jìn)行。 4.pH 4.pH的影響的影響 蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)在pIpI時(shí)的溶解度最小，最容易從時(shí)的溶解度最小，最容易從溶液中析出，因此選擇在被鹽析的蛋白質(zhì)溶液中析出，因此選擇在被鹽析的蛋白質(zhì)的的pIpI附近。附近。 耗鹽少，蛋白質(zhì)收率也高耗鹽少，蛋白質(zhì)收率也高 5. 5.操作方式的影響操作方式的影響 10 50 60 70 飽和度（飽和度（%）52.51 酶活性酶活性 U/ml操

14、作方式對(duì)延胡索酸酶鹽析的影響操作方式對(duì)延胡索酸酶鹽析的影響固體，固體，間歇間歇12h12h飽和溶液，飽和溶液，間歇間歇12h12h飽和溶液，飽和溶液，連續(xù)連續(xù)12h飽和溶液，飽和溶液，連續(xù)連續(xù)1.6min采用間歇方式所需鹽量比連續(xù)方式少；采用間歇方式所需鹽量比連續(xù)方式少；間歇操作中，用飽和溶液的需鹽量比用固體鹽的高。間歇操作中，用飽和溶液的需鹽量比用固體鹽的高。 6. 6.鹽析法的優(yōu)缺點(diǎn)鹽析法的優(yōu)缺點(diǎn)（1 1）優(yōu)點(diǎn)：）優(yōu)點(diǎn)： 室溫下沉淀物在硫酸銨鹽析溶液中長(zhǎng)時(shí)間放室溫下沉淀物在硫酸銨鹽析溶液中長(zhǎng)時(shí)間放置不會(huì)失活，且無(wú)機(jī)鹽不容易引起蛋白質(zhì)變性失置不會(huì)失活，且無(wú)機(jī)鹽不容易引起蛋白質(zhì)變性失活；活；

15、非蛋白的雜質(zhì)很少被夾帶沉淀；非蛋白的雜質(zhì)很少被夾帶沉淀； 適用范圍廣，幾乎所有蛋白質(zhì)和酶都能采用適用范圍廣，幾乎所有蛋白質(zhì)和酶都能采用 設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便。設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便。 （2 2）缺點(diǎn)：）缺點(diǎn)： 沉淀物中含有大量鹽析劑沉淀物中含有大量鹽析劑 硫酸銨容易分解產(chǎn)生氨的惡臭味，產(chǎn)品不能硫酸銨容易分解產(chǎn)生氨的惡臭味，產(chǎn)品不能直接用于醫(yī)藥上直接用于醫(yī)藥上 鹽析法可以作為初始的提取方法，再與多種精鹽析法可以作為初始的提取方法，再與多種精制手段結(jié)合起來(lái)，如采用超濾、凝膠色譜、透析制手段結(jié)合起來(lái)，如采用超濾、凝膠色譜、透析等方法將無(wú)機(jī)鹽去除，就可制得高純度產(chǎn)品。等方法將無(wú)機(jī)鹽去除，就可制得高純度產(chǎn)品。

16、-n取上一步的沉淀溶于PBS中使體積達(dá)100 mL并轉(zhuǎn)移至250 mL燒杯中攪拌15 min 二、有機(jī)溶劑沉淀法二、有機(jī)溶劑沉淀法 在蛋白質(zhì)等生物大分子的水溶液中加入一定量在蛋白質(zhì)等生物大分子的水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，能顯著降低蛋白質(zhì)等生物大親水性的有機(jī)溶劑，能顯著降低蛋白質(zhì)等生物大分子的溶解度，使其沉淀析出。分子的溶解度，使其沉淀析出。 不同蛋白質(zhì)沉淀時(shí)所需有機(jī)溶劑的濃度不同，不同蛋白質(zhì)沉淀時(shí)所需有機(jī)溶劑的濃度不同，因此調(diào)節(jié)有機(jī)溶劑的濃度，可以使混合物中的蛋因此調(diào)節(jié)有機(jī)溶劑的濃度，可以使混合物中的蛋白質(zhì)分段析出，達(dá)到分離純化的目的。白質(zhì)分段析出，達(dá)到分離純化的目的。 不僅適于蛋白

17、質(zhì)的分離純化，還常用于酶、核不僅適于蛋白質(zhì)的分離純化，還常用于酶、核酸、多糖等的分離純化。酸、多糖等的分離純化。 （一）基本原理（一）基本原理 加入有機(jī)溶劑后，會(huì)使系統(tǒng)（水和有機(jī)溶劑的加入有機(jī)溶劑后，會(huì)使系統(tǒng)（水和有機(jī)溶劑的混合液）的混合液）的介電常數(shù)減小介電常數(shù)減小，而使溶質(zhì)分子（如，而使溶質(zhì)分子（如蛋白質(zhì)分子）之間的蛋白質(zhì)分子）之間的靜電引力增加靜電引力增加，從而促使，從而促使它們互相聚集，并沉淀出來(lái)。它們互相聚集，并沉淀出來(lái)。水溶性有機(jī)溶劑的親水性強(qiáng)，它會(huì)搶奪本來(lái)與水溶性有機(jī)溶劑的親水性強(qiáng)，它會(huì)搶奪本來(lái)與溶質(zhì)結(jié)合的自由水，使其表面的溶質(zhì)結(jié)合的自由水，使其表面的水化層破壞水化層破壞，導(dǎo)致溶

18、質(zhì)分子之間的相互作用增大而發(fā)生凝聚，導(dǎo)致溶質(zhì)分子之間的相互作用增大而發(fā)生凝聚，沉淀析出。沉淀析出。 常用于生物大分子沉淀的有機(jī)溶劑：常用于生物大分子沉淀的有機(jī)溶劑： 甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮等，甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮等， 其中其中乙醇乙醇是工業(yè)上最常用的是工業(yè)上最常用的 （二）影響沉淀效果的因素（二）影響沉淀效果的因素 溫度溫度pHpH中性鹽濃度中性鹽濃度金屬離子金屬離子1.1.溫度的影響溫度的影響 有機(jī)溶劑存在下，有機(jī)溶劑存在下，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度降低而顯著的減小降低而顯著的減小，因此低溫下（最好低于，因此低溫下（最好低于0 0o oC C）沉淀得完全，有機(jī)溶

19、劑用量可減少。沉淀得完全，有機(jī)溶劑用量可減少。 實(shí)際操作中：實(shí)際操作中： 有機(jī)溶劑與水混合時(shí)，會(huì)放出大量的熱量，使有機(jī)溶劑與水混合時(shí)，會(huì)放出大量的熱量，使溶液的溫度顯著升高，從而增加對(duì)溶液的溫度顯著升高，從而增加對(duì)蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性作用。作用。 整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)在整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)在低溫低溫下進(jìn)行。下進(jìn)行。 具體操作時(shí)：具體操作時(shí)： 將待分離溶液和有機(jī)溶劑分別進(jìn)行將待分離溶液和有機(jī)溶劑分別進(jìn)行預(yù)冷預(yù)冷： 蛋白質(zhì)溶液冷卻到蛋白質(zhì)溶液冷卻到0 0o oC C左右，左右， 有機(jī)溶劑預(yù)冷到有機(jī)溶劑預(yù)冷到-10-10o oC C以下以下 為避免溫度驟然升高損失蛋白質(zhì)活力，操作為避免溫度驟然升高損失蛋白質(zhì)

20、活力，操作時(shí)應(yīng)不斷時(shí)應(yīng)不斷攪拌攪拌、少量多次加入少量多次加入。 使沉淀在低溫下短時(shí)間處理后即進(jìn)行過(guò)濾或使沉淀在低溫下短時(shí)間處理后即進(jìn)行過(guò)濾或離心分離，接著真空抽去剩余溶液或?qū)⒊恋砣苋腚x心分離，接著真空抽去剩余溶液或?qū)⒊恋砣苋氪罅烤彌_溶液中以稀釋有機(jī)溶劑，旨在大量緩沖溶液中以稀釋有機(jī)溶劑，旨在減少有機(jī)減少有機(jī)溶劑與目的物的接觸溶劑與目的物的接觸。 溫度的控制應(yīng)根據(jù)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性而不同，穩(wěn)溫度的控制應(yīng)根據(jù)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性而不同，穩(wěn)定性較差的物質(zhì)，冷卻至低溫是必要的；但對(duì)于定性較差的物質(zhì)，冷卻至低溫是必要的；但對(duì)于穩(wěn)定性較好的物質(zhì)，如淀粉酶，溫度不需過(guò)低，穩(wěn)定性較好的物質(zhì)，如淀粉酶，溫度不需過(guò)低，10

21、-1510-15o oC C。2.pH2.pH的影響的影響 在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最低，因此有機(jī)溶劑在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最低，因此有機(jī)溶劑沉淀時(shí)溶液沉淀時(shí)溶液pHpH多控制在蛋白質(zhì)多控制在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近等電點(diǎn)附近。 pHpH的控制必須的控制必須考慮蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性考慮蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性： 某些酶的等電點(diǎn)在某些酶的等電點(diǎn)在pH4-5pH4-5之間，比其穩(wěn)定的之間，比其穩(wěn)定的pHpH范范圍低，因此圍低，因此pHpH應(yīng)首先滿足蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的條件。應(yīng)首先滿足蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的條件。 控制控制pHpH時(shí)應(yīng)使大多數(shù)蛋白質(zhì)分子時(shí)應(yīng)使大多數(shù)蛋白質(zhì)分子帶相同電荷帶相同電荷，不要讓目的物與主要雜質(zhì)分子帶相反電荷，以免不

22、要讓目的物與主要雜質(zhì)分子帶相反電荷，以免共沉。共沉。 3.3.無(wú)機(jī)鹽的離子強(qiáng)度無(wú)機(jī)鹽的離子強(qiáng)度 少量的中性鹽少量的中性鹽能夠減少蛋白質(zhì)變性。在有機(jī)溶能夠減少蛋白質(zhì)變性。在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)中性鹽濃度以劑沉淀時(shí)中性鹽濃度以0.01-0.05 mol/L為宜。為宜。 常用中性鹽常用中性鹽: : 乙酸鈉、乙酸銨、氯化鈉乙酸鈉、乙酸銨、氯化鈉 中性鹽濃度較高時(shí)（中性鹽濃度較高時(shí)（0.2 mol/L以上以上），由于鹽），由于鹽溶作用會(huì)增大蛋白質(zhì)的溶解度，此時(shí)需增加有機(jī)溶作用會(huì)增大蛋白質(zhì)的溶解度，此時(shí)需增加有機(jī)溶劑的用量才能使沉淀析出。溶劑的用量才能使沉淀析出。 對(duì)鹽析后的上清液或沉淀物，如進(jìn)一步用有機(jī)對(duì)鹽析

23、后的上清液或沉淀物，如進(jìn)一步用有機(jī)溶劑沉淀法純化，必須先脫鹽。溶劑沉淀法純化，必須先脫鹽。4.4.金屬離子金屬離子 一些一些金屬離子金屬離子，如，如CaCa2+2+、ZnZn2+2+能與蛋白質(zhì)結(jié)合能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)溶解度大大降低而不影形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉淀形成，并減少有機(jī)溶響生物活性，有利于沉淀形成，并減少有機(jī)溶劑用量。劑用量。 使用時(shí)避免能與這些金屬離子形成難溶鹽的使用時(shí)避免能與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子存在（如磷酸根）。陰離子存在（如磷酸根）。 常用的鋅鹽：醋酸鋅或硫酸鋅常用的鋅鹽：醋酸鋅或硫酸鋅5.5.有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)有機(jī)

24、溶劑沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)（1 1）優(yōu)點(diǎn)：）優(yōu)點(diǎn)： 乙醇等有機(jī)溶劑易揮發(fā)除去，不會(huì)殘留于成乙醇等有機(jī)溶劑易揮發(fā)除去，不會(huì)殘留于成品中，產(chǎn)品更純凈（不需要脫鹽處理）；品中，產(chǎn)品更純凈（不需要脫鹽處理）； 有機(jī)溶劑密度低，沉淀物與母液間的密度差有機(jī)溶劑密度低，沉淀物與母液間的密度差較大，分離容易，適于用離心分離收集沉淀物。較大，分離容易，適于用離心分離收集沉淀物。（2 2）缺點(diǎn)：）缺點(diǎn)： 容易使蛋白質(zhì)變性容易使蛋白質(zhì)變性，操作需要在低溫下進(jìn)行，操作需要在低溫下進(jìn)行，使用上有一定的局限；使用上有一定的局限； 采用大量有機(jī)溶劑，采用大量有機(jī)溶劑，成本較高成本較高。 為節(jié)省用量，通常將蛋白質(zhì)溶液適當(dāng)濃縮，并回為

25、節(jié)省用量，通常將蛋白質(zhì)溶液適當(dāng)濃縮，并回收溶劑。收溶劑。 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑易燃易爆易燃易爆，工業(yè)生產(chǎn)上車間和設(shè)備，工業(yè)生產(chǎn)上車間和設(shè)備都應(yīng)有防護(hù)措施。都應(yīng)有防護(hù)措施。等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法成鹽沉淀法成鹽沉淀法高分子聚合物沉淀高分子聚合物沉淀選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法 三、其他沉淀方法三、其他沉淀方法 1. 1.等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法 兩性物質(zhì)在兩性物質(zhì)在pH=pIpH=pI時(shí)，分子表面凈電荷為零，分時(shí)，分子表面凈電荷為零，分子間靜電排斥作用減弱，因此吸引力增大，能相子間靜電排斥作用減弱，因此吸引力增大，能相互聚集，發(fā)生沉淀?；ゾ奂?，發(fā)生沉淀。 不同的兩性物質(zhì)，不同的兩性物質(zhì)，pIpI

26、不同，如不同蛋白質(zhì)。根不同，如不同蛋白質(zhì)。根據(jù)這一特性，用據(jù)這一特性，用依次改變?nèi)芤阂来胃淖內(nèi)芤簆HpH的方法可將不同的方法可將不同的蛋白質(zhì)分別沉淀析出的蛋白質(zhì)分別沉淀析出，達(dá)到分離純化的目的。，達(dá)到分離純化的目的。 只適用于水化程度不大、在只適用于水化程度不大、在pIpI時(shí)溶解度很低時(shí)溶解度很低的的兩性物質(zhì)，如酪蛋白。兩性物質(zhì)，如酪蛋白。 對(duì)于親水性很強(qiáng)的兩性物質(zhì)對(duì)于親水性很強(qiáng)的兩性物質(zhì)，在，在pIpI及及pIpI附近仍附近仍有相當(dāng)?shù)娜芙舛?，用該法沉淀不完全，而且許多有相當(dāng)?shù)娜芙舛龋迷摲ǔ恋聿煌耆?，而且許多生物分子的生物分子的pIpI很接近，因此很少單獨(dú)使用。很接近，因此很少單獨(dú)使用。 往

27、往與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀方往往與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀方法結(jié)合起來(lái)。法結(jié)合起來(lái)。 采用該法時(shí)采用該法時(shí)必須注意：必須注意： 溶液溶液pHpH不會(huì)影響到目的物質(zhì)的穩(wěn)定性不會(huì)影響到目的物質(zhì)的穩(wěn)定性。 等電點(diǎn)沉淀法可用于所需物質(zhì)的提取，也可用等電點(diǎn)沉淀法可用于所需物質(zhì)的提取，也可用于沉淀于沉淀除去雜蛋白及其他雜質(zhì)除去雜蛋白及其他雜質(zhì)，實(shí)際工作中普遍，實(shí)際工作中普遍采用該方法作為采用該方法作為去雜手段去雜手段。 如在工業(yè)上生產(chǎn)胰島素時(shí)：如在工業(yè)上生產(chǎn)胰島素時(shí)： 先調(diào)先調(diào)pHpH至至8.08.0去除堿性雜蛋白，再調(diào)去除堿性雜蛋白，再調(diào)pHpH至至3.03.0去去除酸性雜蛋白。粗酶液

28、經(jīng)過(guò)這樣的處理后純度大除酸性雜蛋白。粗酶液經(jīng)過(guò)這樣的處理后純度大大提高，有利于后面的操作。大提高，有利于后面的操作。 2. 2.成鹽沉淀法成鹽沉淀法 某些生化物質(zhì)（如核酸、蛋白質(zhì)、多肽、氨基某些生化物質(zhì)（如核酸、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、抗生素等）能和重金屬、某些有機(jī)酸及無(wú)機(jī)酸、抗生素等）能和重金屬、某些有機(jī)酸及無(wú)機(jī)酸形成難溶性的鹽類復(fù)合物而沉淀。酸形成難溶性的鹽類復(fù)合物而沉淀。金屬離子沉淀法金屬離子沉淀法有機(jī)酸沉淀法有機(jī)酸沉淀法無(wú)機(jī)酸沉淀法無(wú)機(jī)酸沉淀法注意注意：形成復(fù)合鹽后，常使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆：形成復(fù)合鹽后，常使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的沉淀，應(yīng)用時(shí)必須謹(jǐn)慎。的沉淀，應(yīng)用時(shí)必須謹(jǐn)慎。 （1 1）金屬離

29、子沉淀法）金屬離子沉淀法 許多有機(jī)物（包括蛋白質(zhì)）在堿性溶液中帶負(fù)許多有機(jī)物（包括蛋白質(zhì)）在堿性溶液中帶負(fù)電荷，因此能與金屬離子形成金屬?gòu)?fù)合鹽沉淀。電荷，因此能與金屬離子形成金屬?gòu)?fù)合鹽沉淀。 根據(jù)與有機(jī)物作用的機(jī)制不同，可將金屬離根據(jù)與有機(jī)物作用的機(jī)制不同，可將金屬離子分為三類：子分為三類： 能與能與羧基、含氮化合物和含氮雜環(huán)化合物羧基、含氮化合物和含氮雜環(huán)化合物結(jié)合，結(jié)合，如如Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+等等 能與能與羧基羧基結(jié)合，但不能與含氮化合物結(jié)合，結(jié)合，但不能與含氮化合物結(jié)合，如如Ca2+, Ba2+, Mg2+, Pb2+等等 能與能與巰基巰

30、基結(jié)合，如結(jié)合，如Hg2+, Ag+, Pb2+等等 分離出沉淀物后，如何去除金屬離子？分離出沉淀物后，如何去除金屬離子？ 可用可用H H2 2S S使金屬變成硫化物而除去，也可采用使金屬變成硫化物而除去，也可采用離離子交換法子交換法或或金屬螯合劑金屬螯合劑EDTAEDTA等將金屬離子除去。等將金屬離子除去。 金屬離子沉淀法除提取生化物質(zhì)外，金屬離子沉淀法除提取生化物質(zhì)外，還能用于還能用于沉淀去除雜質(zhì)沉淀去除雜質(zhì)： 如錳鹽能選擇性的沉淀發(fā)酵液中的核酸，降低如錳鹽能選擇性的沉淀發(fā)酵液中的核酸，降低發(fā)酵液黏度，以利于后續(xù)操作；發(fā)酵液黏度，以利于后續(xù)操作；ZnSOZnSO4 4能沉淀紅霉能沉淀紅霉素

31、發(fā)酵液中的雜蛋白以提高過(guò)濾速度。素發(fā)酵液中的雜蛋白以提高過(guò)濾速度。 （2 2）有機(jī)酸沉淀法）有機(jī)酸沉淀法 （有機(jī)酸：具有酸性的有機(jī)化合物）（有機(jī)酸：具有酸性的有機(jī)化合物） 某些有機(jī)酸如某些有機(jī)酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸和三氯乙苦味酸、苦酮酸、鞣酸和三氯乙酸酸等，能與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而等，能與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出。沉淀析出。 這些有機(jī)酸與蛋白質(zhì)形成鹽復(fù)合物沉淀時(shí)，常這些有機(jī)酸與蛋白質(zhì)形成鹽復(fù)合物沉淀時(shí)，常發(fā)生不可逆的沉淀反應(yīng)，所以用此法制備蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的沉淀反應(yīng)，所以用此法制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)，需采用和酶時(shí)，需采用較溫和的條件較溫和的條件，有時(shí)還加入一定，有時(shí)還加

32、入一定的穩(wěn)定劑，以防止蛋白質(zhì)變性。的穩(wěn)定劑，以防止蛋白質(zhì)變性。 鞣酸（單寧）鞣酸（單寧）多元酚類化合物多元酚類化合物 分子上有羧基和多個(gè)羥基，分子上有羧基和多個(gè)羥基， 蛋白質(zhì)分子中有氨基、亞氨基和羧基，所以可蛋白質(zhì)分子中有氨基、亞氨基和羧基，所以可與單寧分子形成為數(shù)眾多的與單寧分子形成為數(shù)眾多的氫鍵氫鍵而結(jié)合在一起，而結(jié)合在一起，生成巨大的復(fù)合顆粒而沉淀下來(lái)。生成巨大的復(fù)合顆粒而沉淀下來(lái)。 如何使蛋白質(zhì)游離釋放出來(lái)？如何使蛋白質(zhì)游離釋放出來(lái)？ 單寧與蛋白質(zhì)的結(jié)合比較牢固，不易分開，多單寧與蛋白質(zhì)的結(jié)合比較牢固，不易分開，多采用采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法：用比蛋白質(zhì)更強(qiáng)的結(jié)合劑與單：用比蛋白質(zhì)更強(qiáng)

33、的結(jié)合劑與單寧結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合劑有寧結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合劑有PVPPVP（與單寧形成氫鍵的（與單寧形成氫鍵的能力很強(qiáng)），聚乙二醇、聚氧化乙烯、山梨糖醇能力很強(qiáng)），聚乙二醇、聚氧化乙烯、山梨糖醇甘油酸酯甘油酸酯 三氯乙酸（三氯乙酸（TCATCA） 沉淀蛋白質(zhì)迅速且完全，一般會(huì)引起變性。沉淀蛋白質(zhì)迅速且完全，一般會(huì)引起變性。 低溫下短時(shí)間作用可使某些較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)或低溫下短時(shí)間作用可使某些較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)或酶保持原有活力，多用于目的物較穩(wěn)定且分離雜酶保持原有活力，多用于目的物較穩(wěn)定且分離雜蛋白相對(duì)困難的場(chǎng)合。蛋白相對(duì)困難的場(chǎng)合。 雷凡諾雷凡諾吖啶染料吖啶染料 沉淀機(jī)制比一般有機(jī)酸鹽復(fù)雜，但與蛋白質(zhì)作沉淀

34、機(jī)制比一般有機(jī)酸鹽復(fù)雜，但與蛋白質(zhì)作用也主要是通過(guò)形成鹽的復(fù)合物而沉淀的。用也主要是通過(guò)形成鹽的復(fù)合物而沉淀的。 提純血漿中提純血漿中-球蛋白有較好效果。球蛋白有較好效果。 （3 3）無(wú)機(jī)酸沉淀法）無(wú)機(jī)酸沉淀法 （無(wú)機(jī)酸：能解離出氫離子的無(wú)機(jī)化合物，如硫酸、鹽（無(wú)機(jī)酸：能解離出氫離子的無(wú)機(jī)化合物，如硫酸、鹽酸、硝酸、次氯酸等；酸、硝酸、次氯酸等； 有機(jī)酸：具有酸性的有機(jī)化合物，最常見是羧酸）有機(jī)酸：具有酸性的有機(jī)化合物，最常見是羧酸） 某些無(wú)機(jī)酸如某些無(wú)機(jī)酸如磷鎢酸、磷鉬酸磷鎢酸、磷鉬酸等能與陽(yáng)離子形等能與陽(yáng)離子形式的蛋白質(zhì)形成溶解度極低的復(fù)合鹽，使蛋白質(zhì)式的蛋白質(zhì)形成溶解度極低的復(fù)合鹽，使蛋

35、白質(zhì)沉淀析出。沉淀析出。 無(wú)機(jī)酸如何去除？無(wú)機(jī)酸如何去除？ 得到沉淀物后，可在沉淀物中加入無(wú)機(jī)酸并用得到沉淀物后，可在沉淀物中加入無(wú)機(jī)酸并用乙醚乙醚萃取萃取，把磷鎢酸、磷鉬酸等移入乙醚中除去；，把磷鎢酸、磷鉬酸等移入乙醚中除去；或用或用離子交換法離子交換法除去。除去。 3. 3.高分子聚合物沉淀高分子聚合物沉淀 某些水溶性的某些水溶性的非離子型高分子聚合物非離子型高分子聚合物是是2020世紀(jì)世紀(jì)6060年代發(fā)展起來(lái)的沉淀劑，近年來(lái)被廣泛用于核年代發(fā)展起來(lái)的沉淀劑，近年來(lái)被廣泛用于核酸、蛋白質(zhì)和酶的分離純化，包括不同分子量的酸、蛋白質(zhì)和酶的分離純化，包括不同分子量的聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPE

36、G）、聚乙烯吡咯烷酮（）、聚乙烯吡咯烷酮（PVPPVP）和葡）和葡聚糖聚糖等。等。 應(yīng)用最多的是應(yīng)用最多的是PEGPEG，原因：無(wú)毒，對(duì)成品影響，原因：無(wú)毒，對(duì)成品影響小小 （1 1）用水溶性非離子聚合物沉淀生物大分子和）用水溶性非離子聚合物沉淀生物大分子和顆粒的兩種方法：顆粒的兩種方法： 選用選用兩種兩種水溶性非離子多聚物組成水溶性非離子多聚物組成液液- -液兩液兩相系統(tǒng)相系統(tǒng)，使生物大分子或顆粒在，使生物大分子或顆粒在兩相系統(tǒng)兩相系統(tǒng)中不等中不等量分配，進(jìn)行分離。量分配，進(jìn)行分離。 機(jī)理：不同生物分子和顆粒表面結(jié)構(gòu)不同，有機(jī)理：不同生物分子和顆粒表面結(jié)構(gòu)不同，有不同分配系數(shù)；且外加離子強(qiáng)度

37、、不同分配系數(shù)；且外加離子強(qiáng)度、pHpH和溫度等的和溫度等的影響，提高分離效果。影響，提高分離效果。 選用選用一種一種水溶性非離子多聚物，使生物大分水溶性非離子多聚物，使生物大分子或顆粒在子或顆粒在同一液相同一液相中，由于被排斥相互凝集而中，由于被排斥相互凝集而沉淀析出。沉淀析出。 （2 2）PEGPEG的沉淀的沉淀 機(jī)理機(jī)理 勞蘭梯提出：通過(guò)空間位置排斥，使液體中的勞蘭梯提出：通過(guò)空間位置排斥，使液體中的生物大分子、病毒和細(xì)菌等微粒被迫擠聚在一起生物大分子、病毒和細(xì)菌等微粒被迫擠聚在一起而引起沉淀的發(fā)生。而引起沉淀的發(fā)生。 影響因素影響因素 PEGPEG濃度：濃度：PEGPEG相對(duì)分子質(zhì)量：相