患腹水綜合癥肉雞的肺動(dòng)脈轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

1、JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY本 科 畢 業(yè) 論 文（設(shè) 計(jì)）題目： 患腹水綜合癥肉雞的肺動(dòng)脈轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究 學(xué) 院： 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 姓 名： 學(xué) 號(hào)： 專 業(yè)： 動(dòng)物醫(yī)學(xué) 年 級(jí)： 二0 15 年 5 月摘要 為了探討肉雞腹水綜合癥與肺動(dòng)脈生物學(xué)變化的關(guān)系，從轉(zhuǎn)錄組生物信息的水平上對(duì)肉雞肺動(dòng)脈進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)選取了75羽15日齡健康A(chǔ)A肉雞隨機(jī)分成對(duì)照組（20羽）和造病組（55羽），造病組（D）飼喂含0.3% Nacl的高鹽水，對(duì)照組（N）飲正常水。在飼養(yǎng)過(guò)程中肉雞出現(xiàn)明顯腹水綜合癥臨床癥狀后頸靜脈放血致死，并取RV/TV>0.29的雞肺動(dòng)脈于液氮速凍

2、，再放置-80保存，備用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）檢測(cè)。結(jié)果表明：（1）腹水雞和正常雞相比，發(fā)現(xiàn)了895個(gè)差異表達(dá)基因。（2）根據(jù)GO富集分析，895個(gè)差異表達(dá)基因主要參與Ribosome，Translation，Chemokine and cytokine activity，Immune system等多個(gè)代謝通路以及可導(dǎo)致它們發(fā)生生物學(xué)變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了患腹水綜合癥肉雞的肺動(dòng)脈與正常的肉雞相比，基因轉(zhuǎn)錄水平現(xiàn)出了顯著的差異。因此，其結(jié)果為肉雞腹水綜合癥的發(fā)病機(jī)制提供了更新的信息，也為研發(fā)肉雞腹水綜合癥新的藥物靶點(diǎn)篩選提供一定依據(jù)和臨床價(jià)值。關(guān)鍵詞：肉雞；肉雞腹水綜合癥；RNA-

3、seqIIIAbstract An experiment was carried out to investigate the pulmonary artery changes of broilers with Ascites Syndrome on transcriptome biological level. 75 15-days Arbor Acre commercial broilers were randomly divided into control group (20) and disease group (55), and the control group broilers

4、 (N) was raised with tap water while disease group broilers(D) was given 0.3% Nacl water. During the trail, birds were killed when they showed obvious clinical symptoms, and the pulmonary arterys were collected and stored in -80 for RNA-seq test if the RV:TV of the bird was over 0.29 . Results prese

5、nted that: compared to control group, (1) the disease groups have 895 differential expressed genes. (2)According to GO analysis, 895 differential expressed genes enriched to these biological progress such as Ribosome, Translation, Cytokinecytokine etcr multiple metabolic pathways and cause them to o

6、ccur biological changes. The experiment demonstrated that gene transcript level of pulmonary artery of the broiler with ascites syndrome had a remarkable difference compared to the normal broiler. Therefore, our results provided updated information for the pathogenesis research of broiler ascites sy

7、ndrome, and also offered evidence and clinical value for exploiting new drug targets against ascites syndrome.Key words：broiler; Ascites syndrome; RNA-seqIV目 錄摘要IIAbstractIII前 言11 實(shí)驗(yàn)材料與方法21.1 試驗(yàn)動(dòng)物和分組管理21.2 試驗(yàn)日糧21.3 樣品收集與保存21.4 主要儀器和試劑21.5 實(shí)驗(yàn)耗材31.6 RNA-seq 檢測(cè)樣品的收集與準(zhǔn)備31.6.1 RNA提取操作步驟31.6.2 DEG測(cè)序的實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備

8、41.6.3 序列分析51.6.4 RNA-seq 檢測(cè)數(shù)據(jù)分析52 結(jié)果72.1 RNA樣品檢測(cè)結(jié)果72.1.1 RNA電泳結(jié)果72.2 樣本間相關(guān)性102.3 基因表達(dá)Density圖112.4 差異表達(dá)基因篩選112.5 差異基因GO Terms分析123 討論143.1 RNA樣品質(zhì)量143.2 樣本選擇的可靠性143.3 差異基因GO Terms富集分析154 結(jié)論15參考文獻(xiàn)16附錄18致謝19V前 言 肉雞腹水綜合癥(Ascites syndrome，AS）也稱為肺動(dòng)脈高壓綜合癥(改為中文格式pulmonary hypertension，PH），是由多種致病因子共同作用而引起的一

9、種營(yíng)養(yǎng)代謝病，在肉雞養(yǎng)殖業(yè)中頻繁發(fā)生，據(jù)統(tǒng)計(jì)，其發(fā)病率為5-10%，并且照成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失1要上標(biāo)，所有參考文獻(xiàn)。肉雞腹水綜合癥的發(fā)病表現(xiàn)為呼吸困難，精神沉郁，并且很快死亡，解剖發(fā)現(xiàn)腹腔和心包有大量積液，并且右心室顯著腫大2.。 去掉對(duì)于肉雞腹水綜合癥的發(fā)病原因，國(guó)內(nèi)外一些研究發(fā)現(xiàn)，肉雞腹水綜合癥發(fā)病的主要原因是肺動(dòng)脈高壓。由于肉雞生長(zhǎng)速度過(guò)快，在短時(shí)間內(nèi)就可以達(dá)到一定的體重，尤其是快大型肉雞，但是這時(shí)肉雞的器官并沒有發(fā)育完成，特別是心血管系統(tǒng)。為了維持機(jī)體的活動(dòng)以及對(duì)氧氣的需求，心臟就會(huì)泵出足夠的血液來(lái)維持，這時(shí)過(guò)多的血液流到有限的肺血管中，血液壓力過(guò)大，肺動(dòng)脈高壓情況就出現(xiàn)。此時(shí)，血液流

10、速過(guò)快，并沒有攜帶足夠的氧氣，造成了體內(nèi)氧氣供求不平衡。為了緩解這一情況，右心室會(huì)代償出更多的血液，出現(xiàn)了右心室壁顯著增厚的情況3。實(shí)際上，國(guó)內(nèi)外很多報(bào)道已經(jīng)證實(shí)缺氧，低溫，高能量日糧等外界因素都會(huì)使肉雞發(fā)生肉雞腹水綜合癥4。很多研究把肉雞心臟指數(shù)AHI超過(guò)0.29和血容量升高當(dāng)作指示肉雞腹水綜合癥的重要指標(biāo)5, 6.研究報(bào)道通過(guò)限飼，長(zhǎng)時(shí)間基因選育以及藥物預(yù)防等方法來(lái)來(lái)緩解肉雞腹水綜合癥對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成的損失的效果并不顯著，故對(duì)于肉雞腹水綜合癥的研究值得眾多科研工作者投更多的精力7。事實(shí)上，對(duì)于肉雞腹水綜合癥的研究，目前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)都是停留在水平和生化水平上，對(duì)于基因水平研究少之又少，有基因方面

11、的研究也是個(gè)別基因，并不全面。故下一步的研究應(yīng)當(dāng)從整個(gè)基因組水平來(lái)分析。隨著科學(xué)的進(jìn)步，高通量測(cè)序方法深受研究者的青睞，特別是在人醫(yī)研究中，其優(yōu)點(diǎn)是能鑒別組疾病發(fā)生過(guò)程中差異基因的表達(dá)以及差異基因參與的代謝通路，這就為后續(xù)的研究提供了非常好的鋪墊。本實(shí)驗(yàn)的研究目的就是用seq-RNA的方法在整個(gè)基因水平來(lái)分析肉雞腹水綜合癥的發(fā)病機(jī)理。據(jù)報(bào)道，肺動(dòng)脈血管的變化與肉雞腹水綜合癥的發(fā)生有關(guān)，已經(jīng)證實(shí)發(fā)生肉雞腹水綜合癥時(shí)肉雞的肺動(dòng)脈血管會(huì)發(fā)生重塑，而且肺動(dòng)脈中的缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)會(huì)顯著增高8。故改為：因此，本實(shí)驗(yàn)選取的是發(fā)生肉雞腹水綜合癥的肉雞肺動(dòng)脈做轉(zhuǎn)錄組分析，找出與肉雞腹水綜合癥相關(guān)的所有差異表達(dá)基

12、因和這些基因參與的生物過(guò)程，從而為更好的治療和預(yù)防肉雞腹水綜合癥做出鋪墊。1 實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和分組管理本實(shí)驗(yàn)選取的是AA肉雞（Arbor Acre commercial broiler chickens）75羽。所有肉雞按常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫。所有肉雞人工籠養(yǎng)至21日齡，然后隨機(jī)分為，造病組55羽和對(duì)照組20羽。在21日齡前均正常飼喂和飲水，第22日齡，其中造病組飼喂含0.3%的Nacl水，對(duì)照組正常飲水。對(duì)照組和造病組都給予相同飼料，自由采食。所有肉雞均按規(guī)定免疫程序進(jìn)行免疫，驅(qū)蟲。對(duì)照組、造病組隔離籠養(yǎng)。試驗(yàn)持續(xù)6周。1.2 試驗(yàn)日糧本試驗(yàn)中肉雞基礎(chǔ)日糧來(lái)源于南昌某公司肉仔

13、雞飼料。字體不一樣1.3 樣品收集與保存 在造病組出現(xiàn)精神沉郁，呼吸困難，采食和飲水廢絕的肉雞時(shí)采樣，每次采樣挑選健康狀況最差的造病組雞5只，隨機(jī)挑選照組雞3只，剩余肉雞在第50日齡一次采完。采樣前一夜禁水禁料，采樣當(dāng)天空腹稱重，頸靜脈放血致死，觀察組織病理變化。迅速取每羽雞肺動(dòng)脈，用DEPC水清洗多次后，放于DEPC水處理過(guò)的1.5mLEP管中，迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移到-80超低溫冰箱冷凍保存，用于RNA-seq檢測(cè)。段前空格多了，只要兩個(gè)漢字空格就可以了，字體大小不一致1.4 主要儀器和試劑ZDX-35BI型座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；DW-86L388海爾立式

14、超低溫冷凍冰箱（青島海爾特種電器有限公司）；電熱恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械七廠）；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮科學(xué)儀器有限公司）；全自動(dòng)生化分析儀BS-380檢測(cè)（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；各種規(guī)格微量移液槍（芬蘭Labsystem公司）DF206電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京醫(yī)療設(shè)備二廠）普通冰箱（南昌齊洛瓦電器集團(tuán)）；分析電子天平（Sartorius Groupe，Germany）；100萬(wàn)單位鏈霉素，80萬(wàn)單位青霉素，肝素鈉、NaCl、去掉等均為市售。字體不一1.5 實(shí)驗(yàn)耗材 各種規(guī)格托盤，手術(shù)剪，眼科剪，眼科鑷，組織鑷，手術(shù)刀片，PE手套，封口膜，一次性口罩，保鮮膜，無(wú)脂紗布，

15、自封袋，牛皮紙，7.5cm濾紙，脫脂棉，稱量紙，擦鏡紙，蓋玻片，載玻片，玻片架，中性樹膠等。10mL、1mL和5mL注射器，1.5mL，5mL和10mLEP管，200L和1000L槍頭，50mL與100mL燒杯，100量筒和500mL量筒，液氮罐；。與上同樣的問(wèn)題1.6 RNA-seq 檢測(cè)樣品的收集與準(zhǔn)備 建庫(kù)測(cè)序的流程一般包括以下步驟（圖1）：總RNA樣品的檢測(cè)，mRNA的富集，雙鏈cDNA的合成，末端的修復(fù)、加poly-A和接頭，片段的選擇和PCR富集，文庫(kù)質(zhì)量的檢測(cè)，上機(jī)測(cè)序15。從RNA樣品的提取到最終獲得數(shù)據(jù)，每一個(gè)環(huán)節(jié)（樣品檢測(cè)、建立文庫(kù)、測(cè)序）都會(huì)對(duì)最終數(shù)據(jù)的好壞產(chǎn)生巨大影響，

16、而后續(xù)信息分析又直接受到數(shù)據(jù)的好壞的影響。因此要對(duì)每一個(gè)生產(chǎn)步驟嚴(yán)格把控，產(chǎn)生高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，從而從源頭上確保結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。與上同樣的問(wèn)題圖1 RNA-seq主要技術(shù)流程Fig要加點(diǎn).1 The main technical process 1.6.1 RNA提取操作步驟 （1）取用液氮研磨后樣本20mg 左右加入1mL Trizol 中，震蕩，室溫靜置5min，12000rpm，離心10min，然后將上清轉(zhuǎn)移至新管。 （2）按照Trizol：氯仿=5:1 的比例加入氯仿，蓋緊管蓋，漩渦振蕩器上振蕩混勻，室溫靜置3-5min，自然分相。 （3）4ºC，12000×g 離心1

17、0min，混合物會(huì)分成三層。 （4）將上層水相轉(zhuǎn)入一新管，加入等體積氯仿，振蕩混勻，室溫靜置3-5min，自然分相，4ºC，13000×g 離心15min。 （5）將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5mL EP 管（約400-500L），加入等體積的異丙醇，混勻后，80放置20min。 （6）4ºC，13000rpm 離心15min，棄掉上清。 （7）RNA 沉淀用1.0mL 75乙醇漂洗，4ºC，13000rpm 離心5min。 （8）重復(fù)步驟7。 （9）將沉淀置于超凈工作臺(tái)吹干，用適量DEPC 處理水溶解RNA 沉淀。RNA的定值與定量，瓊脂糖凝膠電泳分析RNA

18、降解程度以及是否有污染，Nanodrop檢測(cè)RNA的純度（OD260/280比值），Qubit對(duì)RNA濃度進(jìn)行精確定量，Agilent 2100精確檢測(cè)RNA的完整性。 1.6.2 DEG測(cè)序的實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備 每個(gè)RNA樣品輸入3g。按照NEBNext® Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina® （NEB, USA）使用說(shuō)明書建立序列庫(kù)，并在每個(gè)樣品的屬性序列中加入索引編碼。方法是用多聚T微鏈接磁珠將mRNA 從總RNA中純化出來(lái)。將碎片用二價(jià)離子在高溫NEBNext首鏈合成反應(yīng)液（5X）中提取出來(lái)。首鏈cDNA 用隨機(jī)六聚體引物和M-M

19、uLV 反轉(zhuǎn)錄酶（RNase H-）合成。隨后，次鏈cDNA用DNA聚合酶I和RNA酶H合成。末端通過(guò)核酸外切酶/聚合酶活性轉(zhuǎn)換成鈍端。DNA碎片3末端腺苷?；饔煤?，綁結(jié)上帶發(fā)夾結(jié)構(gòu)的NEBNext Adaptor 為雜交做準(zhǔn)備。用AMPure XP system （Beckman Coulter, Beverly，USA）純化庫(kù)碎片，以選擇150200 bp長(zhǎng)度cDNA 碎片。在大小適當(dāng)，并加入適配器的cDNA中加入3 l應(yīng)是L，全文要統(tǒng)一 USER Enzyme （NEB，USA）， 37°C，15分鐘，95°C，5分鐘，然后在Phusion High-Fidelit

20、y DNA 聚合酶，通引和指引下進(jìn)行PCR，最后，用AMPure XP系統(tǒng)純化PCR產(chǎn)物，并用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)評(píng)定建庫(kù)質(zhì)量。 獲得Sequenced Reads 后，在有相關(guān)物種參考序列或基因組的情況下，進(jìn)行生物信息分析，其流程如圖2。GO富集分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析原始測(cè)序數(shù)據(jù)參考序列比對(duì)分析基因表達(dá)水平分析RNA-seq整體質(zhì)量評(píng)估基因差異表達(dá)分析測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估圖 2 生物信息分析流程Fig. 2 Bioinformatic analysis process1.6.3 序列分析空格按照使用說(shuō)明書，在cBot 集群生成系統(tǒng)上使用TruSeq

21、PE Cluster Kit v3-cBot-HS （Illumia）進(jìn)行引物編碼樣本的聚類，集群生成后，在Illumina Hiseq 2000/2500平臺(tái)上進(jìn)行庫(kù)準(zhǔn)備工作和并制定100 bp/50bp單端磁珠。1.6.4 RNA-seq 檢測(cè)數(shù)據(jù)分析1.6.4.1 RNA質(zhì)量檢測(cè)項(xiàng)目RNA質(zhì)量檢測(cè)項(xiàng)目如表1。表 1 RNA檢測(cè)項(xiàng)目Table 1 RNA test items樣品類型RNA備注檢測(cè)項(xiàng)目初步檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳定量；Nanodrop初步檢測(cè)是必檢環(huán)節(jié)，合格后才可以進(jìn)行濃度、完整性、純度的檢測(cè)。濃度Nanodrop完整性Agilent 2100純度Nanodrop 1.6.4.2

22、 Reads質(zhì)量控制 Fastq形式的數(shù)據(jù)首先通過(guò)原始數(shù)據(jù)內(nèi)部腳本編程，去掉帶接頭的reads，包含多聚N的reads，以及低質(zhì)量的reads得到clean reads。同時(shí)，計(jì)算clean data的Q20，Q30和 GC含量。所有的后續(xù)分析都基于高質(zhì)量的clean data。1.6.4.3 Reads比對(duì)參考基因 基因組和基因模型注釋文件直接從基因組站點(diǎn)下載。參考基因組索引用Bowtie v2.0.6建造和單端clean reads用TopHat v2.0.9匹配參考基因組。選擇 TopHat 作為比對(duì)工具，對(duì)于unigene DGE，單端clean reads用Bowtie v0.12.

23、9匹配the unigene序列。1.6.4.4 基因表達(dá)水平的定量分析 用HTSeq v0.6.1計(jì)算比對(duì)到每個(gè)基因的reads數(shù)。然后基于基因的長(zhǎng)度比對(duì)到這個(gè)基因的reads數(shù)計(jì)算每個(gè)基因的RPKM。對(duì)于unigene DGE，用RSEM 計(jì)算比對(duì)到每個(gè)unigene的reads數(shù)。1.6.4.5 差異表達(dá)分析 對(duì)于有生物重復(fù)的DESeq，兩種條件/兩組（每種條件下兩個(gè)個(gè)生物重復(fù)）的差異表達(dá)分析用DESeq R 包（1.10.1）進(jìn)行。結(jié)果P-values用Benjamini 和Hochbergs 方法調(diào)整以控制錯(cuò)誤率。DESeq中調(diào)整后P-value <0.05的基因被認(rèn)為是差異基

24、因。1.6.4.6 差異表達(dá)基因的GO分析 差異表達(dá)基因的GO富集分析通過(guò)GOseq R包進(jìn)行，同時(shí)糾正基因長(zhǎng)度的偏差，修正后P值小于0.05的GO terms 被認(rèn)為顯著富集差異表達(dá)基因。2 結(jié)果2.1 RNA樣品檢測(cè)結(jié)果2.1.1 RNA電泳結(jié)果從圖3可以看出28s和18s條帶的亮度差不多，無(wú)雜帶。樣品的濃度分別達(dá)到N1：172ng/L，N2：284ng/L，D1：252ng/L，D2：274ng/L，RIN均為7以上，樣品質(zhì)量均達(dá)到A級(jí)（表2）。 圖3 肺動(dòng)脈總RNA PCR電泳結(jié)果M：Marker（Trans 2K Plus）；D1，D2：造病組；N1，N2：正常組 Fig. 3 RN

25、A electrophoretic results of the pulmonary arteryM：Marker（Trans 2K Plus）；D1，D2：Disease group；N1，N2：control group表 2 兩組（N/D）的總RNA檢測(cè)結(jié)果Table 2 Total RNA testing result of two group (N/D)樣品編號(hào)濃度（ng/L）OD260/280OD260/23028S/18SRIN值檢測(cè)結(jié)果N11721.871.5930.97.5AN22841.8931.5270.97.7AD12521.9381.1051.17AD22741,.8

26、772.0451.27.2AA:樣品質(zhì)量滿足建庫(kù)測(cè)序要求，且總量滿足2次或者2次以上建庫(kù)需要2.1.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量及Reads與參考基因組比對(duì)情況樣品測(cè)序產(chǎn)出數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估情況：從圖4、5可以看出四個(gè)樣本都只有前6個(gè)堿基錯(cuò)誤率偏高，之后的堿基錯(cuò)誤率均在0.01%以下。從表3也說(shuō)明單個(gè)堿基位置的測(cè)序錯(cuò)誤率均為0.01%，Q20，Q30值分別得到97%，95%以上，GC含量均在50%左右。圖4 對(duì)照組測(cè)序錯(cuò)誤率分布Fig 4. The testing result of error rate distribution of control group圖5 造病組測(cè)序錯(cuò)誤率分布Fig 5. The

27、testing result error rate distribution of disease group 表.3 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況Table 3 Quality status of the sequencing dataSample nameRaw readsClean readsClean basesError rate(%)Q20(%)Q30(%)GC content(%)N113172095129218320.650.0197.9395.9148.61N215908860156746750.780.0197.9495.9349.01D113818353134937940.670.0

28、198.2496.6050.26D213992954137353610.690.0198.2396.6050.42注：Sample name: 樣品名；Raw reads: 統(tǒng)計(jì)原始序列數(shù)據(jù)，以四行為一個(gè)單位，統(tǒng)計(jì)每個(gè)文件的測(cè)序序列的個(gè)數(shù)；Clean reads: Clean reads的個(gè)數(shù)乘以長(zhǎng)度，并轉(zhuǎn)化為以G為單位；Error rate: 通過(guò)公式：Qphred = -10log10(e) 計(jì)算得到；Q20，Q30：分別計(jì)算Phred數(shù)值大于20、30的堿基占總體堿基的百分比；GC content: 計(jì)算堿基G和C的數(shù)量總和占總的堿基數(shù)量的百分比。 Reads與參考基因組比對(duì)情況：如果參

29、考基因組選擇合適并且相關(guān)實(shí)驗(yàn)不存在污染的情況下，實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的測(cè)序序列的定位的百分比正常情況下會(huì)高于70%，其中具有多個(gè)定位的測(cè)序序列占總體的百分比通常不會(huì)超過(guò)10%。在本實(shí)驗(yàn)中，total reads 與參考基因組的比對(duì)均達(dá)到89%以上，Multiple mapped 均在2%以下（表4）。表4 Reads與參考基因組比對(duì)情況Table 4 The situation of reads mapping to reference genomeSample nameN1N2D1D2Total reads12921832156746751349379413735361Total mapped1168

30、7676(90.45%)14161568(90.35%)12120029(89.82%)12315378(89.66%)Multiple mapped218094(1.69%)228240(1.46%)210695(1.56%)250856(1.83%)Uniquely mapped11469582(88.75%)13933328(88.89%)11909334(88.26%)12064522(87.84%)Reads map to +5734482(44.38%)6963551(44.43%)5955487(44.14%)6029451(43.9%)Reads map to -5735100

31、(44.38%)6969777(44.47%)5953847(44.12%)6035071(43.94%)Non-splice reads9790044(75.76%)11774512(75.12%)10000081(74.11%)10074221(73.35%)Splice reads1679538(13%)2158816(13.77%)1909253(14.15%)1990301(14.49%)注：Total reads: 測(cè)序序列經(jīng)過(guò)測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾后的數(shù)量統(tǒng)計(jì)（Clean data）；Total mapped: 能定位到基因組上的測(cè)序序列的數(shù)量的統(tǒng)計(jì)；Multiple mapped：在參考

32、序列上有多個(gè)比對(duì)位置的測(cè)序序列的數(shù)量統(tǒng)計(jì)；Uniquely mapped: 在參考序列上有唯一比對(duì)位置的測(cè)序序列的數(shù)量統(tǒng)計(jì)；Reads to+，Reads to-：測(cè)序序列比對(duì)到基因組上正鏈和負(fù)鏈的統(tǒng)計(jì)；Splice reads：分段比對(duì)到兩個(gè)外顯子上的測(cè)序序列的統(tǒng)計(jì)，Non-splice reads為整段比對(duì)到外顯子的測(cè)序序列的統(tǒng)計(jì)。2.2 樣本間相關(guān)性樣本間皮爾遜關(guān)聯(lián)顯示：對(duì)照組和造病組各組內(nèi)比較R2均大于0.9，而兩組組間比較則都小于0.9（圖6）圖6樣本間相關(guān)性檢測(cè)Fig 6 Correlation test of RNA-seq2.3 基因表達(dá)Density圖圖7 樣本差異基因表達(dá)d

33、ensity圖Fig.7 The density figure of sample differential expressed genes從圖7可以看出對(duì)組和正常組的基因表達(dá)不能完全吻合，說(shuō)明了腹水雞和正常雞基因表達(dá)有差異。2.4 差異表達(dá)基因篩選通過(guò)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)一步篩選出顯著差異基因，從火山圖可以看出造病組和正常組差異表達(dá)的基因共有895個(gè)，其中上調(diào)基因有437個(gè)，下調(diào)基因458個(gè)（圖8）。圖8 差異表達(dá)基因篩選Fig. 8 Volcano plot of differential expressed genes2.5 差異基因GO Terms分析 差異基因GO Terms富集柱狀圖，直觀

34、的反映出在生物過(guò)程（Biological process）、細(xì)胞組分（Cellular component）和分子功能（Molecular function）富集的GO term上差異基因的個(gè)數(shù)分布情況。我們挑選了富集最顯著的30個(gè)GO term在圖中展示，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)照組與造病組之間所有差異基因GO富集柱狀圖中顯著富集到2個(gè)參與生物過(guò)程，3個(gè)參與細(xì)胞組分，7個(gè)參與分子功能的差異基因；顯著富集到1個(gè)生物過(guò)程，8個(gè)細(xì)胞組分及2個(gè)參與分子功能的下調(diào)差異基因；顯著富集到2個(gè)參與生物過(guò)程，5個(gè)參與分子功能的上調(diào)差異基（圖10）。圖 10 GO富集柱狀圖A，B：分別表示下調(diào)基因及上調(diào)基因GO富集柱

35、狀圖，縱坐標(biāo)為富集的GO term，橫坐標(biāo)為該term中差異基因個(gè)數(shù)；不同顏色用來(lái)區(qū)分生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能；帶“”的為顯著富集的GO+termsFig. 10 GO enrichment histogramA, B represent the down and up regulated gene GO enrichment histogram, the enrichment term is in vertical coordinates and the number of differential genes of the term is in horizontal axis; the

36、 classify Of biological process, cellular Component and molecular Function is depended on the color, the terms with a “” is notable enrichment GO terms.3 討論3.1 RNA樣品質(zhì)量 從RNA電泳圖可以看出28s和18s條帶的亮度差不多一樣，無(wú)雜帶（圖3）。樣品的濃度分別達(dá)到N1：172ng/L，N2：284ng/L，D1：252ng/L，D2：274ng/L，RIN均為7以上，樣品質(zhì)量均達(dá)到A級(jí)（表2），表明樣品質(zhì)量滿足建庫(kù)測(cè)序要求，且總量滿

37、足2次或者2次以上建庫(kù)需要。數(shù)據(jù)質(zhì)量與Reads對(duì)比情況一般情況下，單個(gè)堿基位置的測(cè)序錯(cuò)誤率應(yīng)低于0.01%，前6個(gè)堿基測(cè)序錯(cuò)誤率較高的原因?yàn)殡S機(jī)引物和RNA模版的不完全結(jié)合，最高在0.06%左右可以接受。Reads的GC含量指標(biāo)的警告閾值為15%的reads的GC含量偏離正態(tài)分的標(biāo)準(zhǔn)差13。本實(shí)驗(yàn)中單個(gè)堿基位置的測(cè)序錯(cuò)誤率均為0.01%，Q20，Q30值分別得到97%，95%以上，GC含量均在50%左右（表3），因此，本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。Reads與參考基因組比對(duì)情況：如果參考基因組選擇合適并且相關(guān)實(shí)驗(yàn)不存在污染的情況下，實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的測(cè)序序列的定位的百分比正常情況下會(huì)高于70%，其中具有多

38、個(gè)定位的測(cè)序序列占總體的百分比通常不會(huì)超過(guò)10%。在本實(shí)驗(yàn)中，total reads 與參考基因組的比對(duì)均達(dá)到89%以上，有多個(gè)比對(duì)位置的測(cè)序序列的定位的百分均在2%以下（表4），表明選擇的參考基因組可靠。3.2 樣本選擇的可靠性樣品間基因表達(dá)水平相關(guān)性是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標(biāo)，相關(guān)系數(shù)越接近1，表明樣品之間的表達(dá)模式相似度越高14。從皮爾遜相關(guān)性可以看出在兩個(gè)對(duì)照組和兩個(gè)造病組之間相關(guān)性均大于0.9，而在對(duì)照組和造病組之間的相關(guān)系數(shù)則小于0.9，表明本實(shí)驗(yàn)造病成功和樣本選擇合理；基因表達(dá)韋恩圖表達(dá)了各組表達(dá)的基因個(gè)數(shù)，以及其重疊關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)基因表達(dá)韋恩圖顯示對(duì)照組和造病組

39、有明顯的基因表達(dá)差異?；鹕綀D可以反應(yīng)出篩選后的差異基因整體分布情況，從圖7也反應(yīng)出造病組的基因表達(dá)和對(duì)照組有顯著差異。 3.3 差異基因GO Terms富集分析 差異基因GO富集柱狀圖，直觀反應(yīng)出發(fā)病雞和正常雞在生物過(guò)程，細(xì)胞組分和分子功能方面的變化16。下調(diào)差異基因GO富集柱狀圖中顯示，顯著富集到的與生物過(guò)程有關(guān)的下調(diào)GO term翻譯，參與細(xì)胞組分的下調(diào)GO terms 核糖體，核糖核蛋白復(fù)合體，表明在腹水發(fā)生時(shí)機(jī)體的蛋白合成受到嚴(yán)重影響17，這可能是由于機(jī)體缺氧，以及細(xì)胞損傷等造成的；顯著富集到的GO terms無(wú)膜界限的細(xì)胞器，胞內(nèi)無(wú)膜界限的細(xì)胞器，細(xì)胞質(zhì)部分，細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)，核糖

40、體的結(jié)構(gòu)組分以及結(jié)構(gòu)分子活性，胞外蛋白高分子配合物，表明發(fā)生腹水綜合癥時(shí)，機(jī)體的蛋白質(zhì)含量大大減低，并且細(xì)胞核糖體等細(xì)胞器受到損傷，以及細(xì)胞基質(zhì)發(fā)生變化，腹水綜合癥發(fā)生時(shí)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)受到破壞16，富集到的和生物功能有關(guān)的上調(diào)基因GO terms有免疫反應(yīng)和免疫系統(tǒng)過(guò)程，表明機(jī)體發(fā)生腹水綜合癥時(shí)，肉雞的免疫功能代償性上調(diào)，而富集到的和分子功能有關(guān)的上調(diào)基因包括趨化因子活性，趨化因子結(jié)合受體，細(xì)胞因子活性，細(xì)胞因子結(jié)合受體及G-蛋白偶聯(lián)受體，趨化因子是控制細(xì)胞定向遷移的一類細(xì)胞因子，趨化因子系統(tǒng)在清除病原體、炎癥反應(yīng)、等方面都起著重要的作用，其增多可能是腹水發(fā)生時(shí)，機(jī)體的炎癥細(xì)胞大量增加，大量遷移的

41、原因。細(xì)胞因子具有多種生物學(xué)活性，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮重要的功能，機(jī)體細(xì)胞因子有關(guān)的分子功能GO terms 上調(diào)，也顯示機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生了嚴(yán)重的失調(diào)9。4 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高通量測(cè)序的方法在整個(gè)基因水平上研究了肉雞腹水綜合征發(fā)病過(guò)程中其肺動(dòng)脈的變化，通過(guò)與正常雞對(duì)比，腹水雞出現(xiàn)了895個(gè)顯著差異表達(dá)基因，而根據(jù)GO term 的富集發(fā)現(xiàn)顯著下調(diào)的差異基因主要參與了核糖體，核糖體蛋白，轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞外基質(zhì)等生物過(guò)程，上調(diào)的差異基因主要富集到了免疫應(yīng)答反應(yīng)和趨化因子的活動(dòng)等過(guò)程。根據(jù)結(jié)果可以推斷，肉雞在發(fā)生腹水綜合征的過(guò)程中，肺動(dòng)脈細(xì)胞受到損失，為了保護(hù)機(jī)體，其免疫功能代償性上調(diào)。這些研究結(jié)果為肉雞腹水綜合癥的

42、發(fā)病機(jī)制提供了更新的信息，也為研發(fā)肉雞腹水綜合癥新的藥物靶點(diǎn)篩選提供一定依據(jù)和臨床價(jià)值。參考文獻(xiàn)1. Che, XH, Park, EJ, Zhao, YZ, Kim, WH, Sohn, DH. Tanshinone II a Induces Apoptosis and S Phase Cell Cycle Arrest in Activated Rat Hepatic Stellate CellsJ. Basic & clinical pharmacology & toxicology, 2010, 106(1): 30-37.2. Julian, RJ, McMillan

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