植物細(xì)胞組織培養(yǎng)的基本技術(shù)(總結(jié)版)

1、本章主要內(nèi)容l 商業(yè)性組織培養(yǎng)實驗室和小工廠的設(shè)計與主要設(shè)備l 培養(yǎng)基及其配制l 外植體的選擇與培養(yǎng)l 試管苗的馴化與移載第一節(jié) 商業(yè)性組織培養(yǎng)實驗室和小工廠的設(shè)計與主要設(shè)備l 培養(yǎng)皿的清洗；l 培養(yǎng)基的配制、分裝和高壓滅菌；l 無菌操作材料的表面滅菌和接種；l 將培養(yǎng)物放到培養(yǎng)室培養(yǎng)；l 試管苗的馴化、移栽和初期管理。(一)、洗滌室(cleaning room)l 洗滌室用于完成玻璃器皿等儀器的清洗、干燥和貯存。l 室內(nèi)配備：l 大型水槽，最好是白瓷水槽。為防止碰壞玻璃器皿，可鋪墊橡膠。上下水道要暢通。l 備有塑料筐，用于運(yùn)輸培養(yǎng)器皿。l 備有干燥架，用于放置干燥涮凈的培養(yǎng)器皿。(二)、準(zhǔn)備

2、室(repairing room)l 完成培養(yǎng)基制備以及試管苗出瓶、清洗與整理工作。準(zhǔn)備室要求明亮、通風(fēng)。l 如果房間較多，可將準(zhǔn)備室分為洗滌室和配置室兩部分。洗滌室專門負(fù)責(zé)試管苗出瓶與培養(yǎng)器皿的清洗工作；配置室則負(fù)責(zé)培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。 (三)、緩沖室l 進(jìn)入無菌室前要在緩沖室里換上經(jīng)過滅菌的衛(wèi)生服、拖鞋，戴上口罩。l 應(yīng)當(dāng)在此室內(nèi)安裝滅菌用的紫外燈?？刂茻o菌室及培養(yǎng)室的配電板等。(四)、無菌操作室(transfering room)l 接種室是進(jìn)行植物材料的分離接種及培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移的一個重要操作室。其無菌條件的好壞對組織培養(yǎng)成功與否起重要作用。l 配置：l 在工作方便的前

3、提下，接種室宜小不宜大，一般7-8m2，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動門，以減少開關(guān)門時的空氣擾動。l 接種室要求干爽安靜，清潔明亮。在適當(dāng)位置吊裝1-2盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對流。(五)、培養(yǎng)室(culturing room)l 培養(yǎng)室是將接種的材料進(jìn)行培養(yǎng)生長的場所。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其他附屬設(shè)備而定。l 設(shè)計原則：l 充分利用空間和節(jié)省l 能源l 高度比培養(yǎng)架略高為l 宜l 周圍墻壁要求有絕熱 防火的性能。(五)、培養(yǎng)室(culturing room)l 培養(yǎng)

4、架大多由金屬制成。l 規(guī)格：l 一般設(shè)5層，最低一層離地高約10 cm，其他每層間隔30cm左右，培養(yǎng)架即高1.7m左右。培養(yǎng)架長度都是根據(jù)日光燈的長度而設(shè)計，如采用40W日光燈，則長1.3 m，30 W的長1m，寬度一般為60cm。l 培養(yǎng)室最重要的因子是溫度，一般保持在20-27左右，具備產(chǎn)熱裝置，并安裝窗式或立式空調(diào)機(jī)。由于熱帶植物和寒帶植物等不同種類要求不同溫度，最好不同種類有不同的培養(yǎng)室。室內(nèi)濕度也要求恒定，相對濕度以保持在70-80為好，可安裝加濕器。l 控制日光照時間可安裝定時開 關(guān)鐘，一般需要每天光照10-16h。也有的需要連續(xù)照明?，F(xiàn)代組培實驗室大多設(shè)計為采用天然太陽光照作為

5、主要能源，這樣不但可以節(jié)省能源，而且組培苗接受太陽光生長良好，馴化易成活。(六)、馴化室l 馴化室要求清潔無菌，配有空調(diào)機(jī)、加濕器、恒溫恒濕控制儀、噴霧器、光照調(diào)節(jié)裝置、通風(fēng)口以及必要的殺菌劑。(七)、溫室l 應(yīng)配有空調(diào)機(jī)、通風(fēng)口、加濕器、恒溫恒濕控制裝置、噴霧裝置、光照調(diào)節(jié)裝置以及必要的殺菌殺蟲裝置及相應(yīng)藥劑。二、儀器設(shè)備和器皿用具l 常見儀器設(shè)備l 1、超凈臺l 2、無菌箱l 3、空調(diào)機(jī)l 4、除濕機(jī)l 5、恒溫箱l 6、烘箱l 7、高壓滅菌鍋l 8、冰箱l 9、電子分析天平和托盤天平l 10、顯微鏡及解剖鏡l 11、水浴鍋l 12、搖床與轉(zhuǎn)床l 13、磁力攪拌器l 14、電蒸餾水器l 1

6、5、酸度計l 16、離心機(jī)1、超凈臺和無菌箱l 1、超凈臺，優(yōu)點(diǎn)是操作方便自如，比較舒適，工作效率高，準(zhǔn)備時間短。開機(jī)10分鐘即可操作，可進(jìn)行長時間使用。在工廠化生產(chǎn)中，接種工作量很大，需要經(jīng)常長久地工作時，超凈臺是很理想的設(shè)備。l 2、無菌箱，在投資少的情況下，可以用接種箱來代替超凈臺。接種箱依靠密閉、藥劑熏蒸和紫外燈照射來保證內(nèi)部空間無菌。但操作活動受限制，準(zhǔn)備時間長，工作效率低。工作原理l 超凈臺功率在145-260W左右，它裝有小型鼓風(fēng)機(jī)，使空氣穿過一個前置過濾器，在這里把大部分空氣塵埃先過濾掉，然后再使空氣穿過一個細(xì)致的高效過濾器，它除去了大于03um的塵埃、細(xì)菌和真菌孢子等，最后以

7、較潔凈的氣流吹到工作臺面。超凈空氣的流速為每分鐘24-30m，這已足夠防止附近空氣襲擾而引起的污染，這樣的流速也不會妨礙采用酒精燈對器械等的灼燒消毒。在這樣的無菌條件下操作，就可以保證無菌材料在轉(zhuǎn)移接種過程中不受污染。l 根據(jù)風(fēng)幕形成的方式，超凈臺可分為水平式和垂直式二種型號。（二）各類玻璃器皿1、培養(yǎng)器皿 2、分注器 3、離心管4、刻度移液管5、細(xì)菌過濾器6、實驗器皿1、培養(yǎng)器皿l 1、培養(yǎng)器皿：在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基和進(jìn)行培養(yǎng)需大量的玻璃器皿。要求由堿性溶解度小的硬質(zhì)玻璃制成，以保證長期貯存藥品及培養(yǎng)的效果；培養(yǎng)用的還要求透光度好，能耐高壓高溫，能方便放入培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的器皿，根據(jù)培養(yǎng)的

8、目的和要求，可以采用不同種類、規(guī)格的玻璃器皿。其中以試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等使用較多。l 最常使用的是l 三角瓶l 培養(yǎng)皿（9、12cm直徑）用于：游離細(xì)胞、原生質(zhì)體、花粉等的靜置培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、無菌種子的發(fā)芽、植物材料的分離等都需采用。l 試管（18mmXl80mm或20mmX200mm）用于：培養(yǎng)較高的試管苗。l 工廠化生產(chǎn)可采用廣口的200ml罐頭瓶，加蓋半透明的塑料蓋，由于瓶口大，所以大量繁殖時操作方便、工作效率高，也減少了培養(yǎng)材料的損傷。但缺點(diǎn)是易引起污染。瓶口封塞l 瓶口封塞可用多種方法，要具有一定的通氣性和密閉性，以防止培養(yǎng)基干燥和雜菌污染。l 以前封口常用棉塞。但這種封口辦法夏季

9、極易污染，且不易保持培養(yǎng)基的濕度。現(xiàn)在多采用聚丙烯塑料薄膜作為封口，以線繩結(jié)扎或橡皮圈箍扎。為了增加通氣性，可在里面襯一層硫酸紙或牛皮紙。這樣經(jīng)濟(jì)方便，且通氣好。也可采用專用的封口膜。5、細(xì)菌過濾器l 用于除去不能采用濕熱滅菌法的液體中的細(xì)菌。一般采用0.22um微孔濾膜進(jìn)行抽濾滅菌。包括濾頭，注射器或采用抽濾裝置：真空泵、吸濾瓶、濾氣玻璃管等。6、實驗器皿l 在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基，貯藏母液，材料的消毒等需要各種化學(xué)實驗用的玻璃器皿，包括:l 100ml、250ml、500ml、1000ml燒杯；l l0ml、l00ml、1000ml量筒；l l00ml、1000ml試劑瓶(棕色)等等。（三

10、）、器械用具（P13）l 1鑷子類：尖頭和槍形l 2剪刀類l 3解剖刀l 4解剖針l 5、接種工具：接種針、接種鉤及接種鏟（由白金絲或鎳絲制成）l 6、鉆孔器l 7、其它：酒精燈，電爐，試管架，搪瓷盤等第二節(jié) 培養(yǎng)基及其配置l 目的要求：l (1)一般掌握培養(yǎng)基的種類、特點(diǎn)；l (2)掌握基本培養(yǎng)基的配方；l (3)一般掌握培養(yǎng)基的組成成分和適宜的劑量；l (4)掌握培養(yǎng)基母液和常用培養(yǎng)基的配制方法和步驟；l (5)熟練掌握培養(yǎng)基的滅菌方法；l (6)一般掌握培養(yǎng)基的篩選辦法。培養(yǎng)基及其配制l 培養(yǎng)基的種類l 培養(yǎng)基的成分l 培養(yǎng)基配制1.培養(yǎng)基的種類l 按成分分類:l MS,B5,White

11、,NT,KM-8P,N6等。l 按狀態(tài)： 液體，固體。（1）MS培養(yǎng)基（Murashige and Skoog Medium）MS培養(yǎng)基（Murashige and Skoog Medium）l Toshio Murashige, Folke Skoog. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiol. Plant. 1962,15:473-497. l 植物組織培養(yǎng)中常用的一種培養(yǎng)基。l 離子濃度較高，硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基高。l 器官，花藥，細(xì)胞，原生質(zhì)體培養(yǎng)。（

12、2）B5培養(yǎng)基（B5 Medium）l Gamborg, O. L.; Miller, R. A.; Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50:151158; 1968.B5培養(yǎng)基（B5 Medium）l 銨含量較低l 木本植物，十字花科植物（3）White培養(yǎng)基（White Medium）l White, P. R. Handbook of plant tissue culture. New York: The Ronald Press Co.

13、; 1943. White, P. R.; Grove, A. R. Proceedings, International Conference on Plantl Tissue Culture (1963: University Park, PA). Berkeley, CA: McCutchan Pub. Corp.; 1965:553 pp.l 無機(jī)鹽含量低l 生根培養(yǎng)（4）NT培養(yǎng)基（NT Medium）l 1970l 煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)（5）KM-8培養(yǎng)基（KM-8 Medium）l 1974l 有機(jī)成分復(fù)雜，包括所有單糖和維生素，呼吸代謝主要有機(jī)酸l 原生質(zhì)體和融合體培養(yǎng)（6）N

14、6培養(yǎng)基（N6 Medium）l 1974，朱至清等。l 成分簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高l 小麥，水稻及其他植物花藥培養(yǎng)和組織培養(yǎng)2.培養(yǎng)基的成分l 水l 無機(jī)營養(yǎng)成分l 有機(jī)營養(yǎng)成分l 植物生長調(diào)節(jié)劑l 附加成分（1）水l 培養(yǎng)基的主要組分l 水是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒，是生命活動過程中不可缺少的物質(zhì)。l 配制培養(yǎng)基母液時要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止儲藏過程發(fā)霉變質(zhì)。大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。（2）無機(jī)營養(yǎng)組分l 作用l 滿足植物對各礦質(zhì)元素的需求。l 大量元素，6種l 微量元素，7種l 非必須元素，6種鐵采用螯合鐵，F(xiàn)eSO4加

15、EDTA（3）有機(jī)營養(yǎng)成分l 碳源l 蔗糖l 維生素類l 硫胺素（B1），煙酸（B3），吡哆醇（B6），泛酸鈣（B5），肌醇。l 氨基酸l 蛋白質(zhì)組成成分，促進(jìn)細(xì)胞生長。l 其他有機(jī)附加物l 椰子汁，酵母提取物，馬鈴薯，水解酪蛋白等。可以促進(jìn)組織生長。l 椰子汁l 椰子的液體胚乳。它是使用最多、效果最大的一種天然復(fù)合物。一般使用濃度在10%-20%。它在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn)作用。 l 馬鈴薯 去掉皮和芽后，加水煮30分鐘，再經(jīng)過過濾，取其濾液使用。對PH值緩沖作用大。添加后可得到健壯的植株。 其他l 酵母提取物，香蕉，水解酪蛋白等。（4）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)l 生長素l 細(xì)胞分裂素l 赤霉素

16、l 乙烯生長素赤霉素細(xì)胞分裂素脫落酸乙烯 -植物激素“五兄弟”l 生長素（auxin）的發(fā)現(xiàn) 向光性：在單側(cè)光的照射下，植物朝向光源方向生長的現(xiàn)象。1、19世紀(jì)末達(dá)爾文(C.R.Darwin)實驗實驗材料：胚芽鞘總結(jié)上述三個實驗,達(dá)爾文提出:胚芽鞘尖端受單側(cè)光刺激后, 就向下面的伸長區(qū)傳遞影響，造成伸長區(qū)背光面比向光面生長快,因而使胚芽鞘出現(xiàn)向光彎曲。2.1910年詹森（B.Jensen）的實驗瓊脂片云母片結(jié)論：胚芽鞘的尖端產(chǎn)生的某種刺激可以透過瓊脂片傳遞給下面一段。3.1914年拜爾（Paal）的實驗結(jié)論：胚芽鞘的彎曲生長，是因為尖端產(chǎn)生的影響在其下部分布不均勻造成的。4、1928年（F.W

17、.Went）溫特的實驗結(jié)論：胚芽鞘的彎曲生長確實是一種化學(xué)物質(zhì)引起的，并命名為生長素。l 1934年從人尿分離出具有生長素效應(yīng)的物質(zhì)吲哚乙酸。l 1942年從高等植物中分離出生長素，并確認(rèn)是IAA。l 在植物體內(nèi)，具有促進(jìn)植物生長的功能，除了吲哚乙酸（IAA）外，還有苯乙酸（PAA）和吲哚丁酸（IBA）。生長素生理作用的應(yīng)用l 頂端優(yōu)勢l 植物的向光性l 根的向重力性（向地性）l 莖的背重力性（背地性）頂端優(yōu)勢：植物的頂芽優(yōu)先生長，而側(cè)芽生長受抑制的現(xiàn)象。形成原因：頂芽產(chǎn)生的生長素向下運(yùn)輸，大量地積累在側(cè)芽部位，側(cè)芽對生長素濃度又比較敏感，使側(cè)芽的生長受到抑制。莖的背地性和根的向地性生長植物向

18、光性在單側(cè)光線照射下， 背光側(cè)向光側(cè)，背光側(cè)細(xì)胞生長快結(jié)果使莖朝向光源一側(cè)彎曲生長素類似物的應(yīng)用(1) 促進(jìn)扦插的枝條生根(2) 促進(jìn)果實發(fā)育（培育無籽果實）(3) 防止落花落果，疏花疏果（4）用作除草劑1、促進(jìn)扦插枝條生根 用一定濃度的生長素類似物溶液浸泡插枝的下端后栽插。 2、生長素促進(jìn)果實發(fā)育（無籽果實） 傳粉受精后，胚珠發(fā)育成種子的過程中產(chǎn)生大量生長素，促進(jìn)子房發(fā)育成果實。如何培育無籽果實？ 在沒有接受花粉的雌蕊柱頭上涂上一定濃度的生長素類似物，使子房正常發(fā)育為果實，因為沒有受精，果實內(nèi)沒有種子。3、防止落花落果 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用一定濃度的生長素類似物溶液噴灑棉株，可以達(dá)到保蕾保鈴的效果

19、。4、雜草的除草劑 如(2，4-D)，適用于麥田、稻田，雙子葉植物比單子葉植物對生長素更敏感，用高濃度的除草劑能抑制雙子葉植物（雜草）的生長。生長素（auxin）l 吲哚乙酸（IAA，天然），奈乙酸（NAA），二氯苯氧乙酸（2,4-D），吲哚丁酸（IBA），2,4,5-三氯苯氧乙酸（2,4,5-T）。l 促進(jìn)細(xì)胞分裂與根分化l 2,4-D有強(qiáng)烈的愈傷組織誘導(dǎo)能力，但抑制器官分化細(xì)胞分裂素（cytokinin）l 激動素 （KT），6-芐基腺嘌呤（6-BA），玉米素 （ZT），異戊烯氨基嘌呤（ 2IP）l 刺激細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)芽的分化、葉片擴(kuò)大和莖長高，抑制根的生長。 l 細(xì)胞分裂素常與生長素相互配合，用以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，細(xì)胞伸長，細(xì)胞分化和