G蛋白信號的多個表面

1、G蛋白信號的多個表面海蒂-E-哈姆（來自美國芝加哥西北大學神經(jīng)科學、醫(yī)學學校，分子藥理學與物理化學系） 大量的激素，神經(jīng)遞質(zhì)，趨化因子，局部介質(zhì)與感官刺激通過與偶聯(lián)的G蛋白受體結(jié)合，來對細胞與器官產(chǎn)生影響?，F(xiàn)在，已經(jīng)有超過1000種這樣的受體為人所知，并且，越來越多的的受體正在隨著時間的推移陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。異源三聚體G蛋白轉(zhuǎn)換配位體使之與受體結(jié)合進入細胞進行反應，這成為組織與器官生理應答的基礎。在決定細胞對信號反應的專一性和暫時性方面，G蛋白扮演了重要的角色。G蛋白由、三種亞基構(gòu)成，并且盡管編碼每個亞基的基因產(chǎn)物有很多（編碼、的基因產(chǎn)物已知。），但四種主要類別的G蛋白是可以被區(qū)分的：Gs，用來激活

2、腺苷酸環(huán)化酶，Gi,用來抑制腺苷酸環(huán)化酶，Gq, 用來激活磷脂酶C，G12和 G13的功能還未知。與GDP偶聯(lián)的G蛋白是未被激活的，異源三聚體狀態(tài)，它可以通過鳥嘌呤核苷酸的催化受體交換使GTP偶聯(lián)到亞基上而被激活。GTP的偶聯(lián)導致GGTP從G亞基上分離，并通過偶聯(lián)的GGTP和自由亞基G來激活下游的效應器。當G亞基水解GTP形成GDP時，G蛋白的鈍化作用對細胞反應的關閉和開啟起限速作用。最近，異源三聚體G蛋白在非活性構(gòu)象和活性構(gòu)象方面晶體結(jié)構(gòu)得到解決，這為我們理解其在信號傳遞途經(jīng)中作為構(gòu)象開關的角色提供了結(jié)構(gòu)依據(jù)。隨著越來越多新穎的途經(jīng)用于G蛋白的暴露，我們對G蛋白信號調(diào)控機制的多樣性的認識也在

3、不斷增加。介紹G蛋白的結(jié)構(gòu)，作用機制以及G蛋白信號通路的作用規(guī)則的研究進展是本文的主題。由于空間有限，我只重點介紹近期的研究結(jié)果，所以讀者可以直接看到之前研究中的一些優(yōu)秀的觀點。G蛋白的結(jié)構(gòu)G亞基包含兩個域，其中一個域參與GTP的偶聯(lián)與水解（G域），它與GTP酶總科結(jié)構(gòu)上完全相同，包括小G蛋白，伸長因子與用來攜帶GTP進入核心的蛋白質(zhì)一種獨特螺旋形域。異源三聚體G蛋白的亞基有一個分為7部分的螺旋槳結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是基于其7WD-40的重復序列。亞基與亞基通過N端螺旋線圈相互作用，并一直以亞基為基礎進行廣泛接觸。這種由亞基和亞基形成的功能單元是不可分離的，除非變性。通過受體引導GTP耦合在G亞基，可

4、以激活G蛋白。這種在G亞基上的GTP調(diào)節(jié)開關的結(jié)構(gòu)性質(zhì)是一種改變，一種在三個用來指定開關1,2,3順序的靈活區(qū)域的構(gòu)象的改變，由偶聯(lián)的GTP激活，是一種對G低親和力的構(gòu)象。這將導致感受器對GGTP親和力的增加，加速亞基的分離，增加自由的G子代，而這些子代又可以激活大量的效應器。激活G蛋白的受體機制共軛G蛋白的受體們都有一個共同的橫剖面圖，那是帶有7個跨膜螺旋的橫剖面圖；連接這些螺旋的細胞內(nèi)循環(huán)形成了G蛋白鏈接域。盡管沒有高分辨率的共軛G蛋白受體的結(jié)構(gòu)被確定，但是，最近一種低分辨率的電子衍射視紫紅質(zhì)，共軛G蛋白的受體結(jié)構(gòu)被展示，它顯示了7種橫跨膜的螺旋線的位置和方向。這些關于共軛G蛋白受體的生化

5、試驗與誘變反映了受體的激活是由于配體結(jié)合引起跨膜螺旋3和6相對取向的變化。然后這些改變影響了受體的構(gòu)象，這些受體是細胞內(nèi)循環(huán)時相互作用的G蛋白。并將之前被覆蓋的G蛋白的結(jié)合位點暴露出來。當一個激活的受體與異源三聚體G蛋白進行反應時，它誘導GDP從G蛋白釋放。人們認為與G蛋白上結(jié)合位點接觸的受體距離耦合GDP的口袋較遠，因此得出受體必須在特定的距離工作才能改變蛋白的構(gòu)象。因為GDP包埋在細胞內(nèi)部，G的兩個域之間，所以改變一些域間的相互作用是必要的。在GDP被釋放和GTP缺乏的情況下，在激活的受體和異源三聚體之間，一種穩(wěn)定的絡合物形成了。這種叫“空口袋”的構(gòu)象引起了人們極大的興趣，但它的結(jié)構(gòu)現(xiàn)在還

6、是未知的。 在G蛋白上連接受體的區(qū)域是什么？它們是怎樣激活G蛋白的呢?GDP偶聯(lián)異源三聚體G蛋白Gt和Gi的構(gòu)象顯示了GDP偶聯(lián)異源三聚體和表面能與其他蛋白相互作用的剩余物的整體形狀，并且為G蛋白受體反應區(qū)域生化性質(zhì)多樣性的理解和突變形成的研究提供了結(jié)構(gòu)環(huán)境。亞基的N端和亞基的C端都是脂修飾的位點。在異源三聚體內(nèi)，這些脂修飾區(qū)是相互靠近的，表明是膜附著的位點。有證據(jù)表明受體與表面的三個亞基全部連接。 在亞基上，最主要的受體接受區(qū)是在C末端。在異源三聚體晶體結(jié)構(gòu)中，亞基上最后7個亞基酸是無序的，并且從組合肽庫中對受體結(jié)合肽的選擇分析表明這7個殘基是最關鍵的。利用嵌合G蛋白亞基的研究證實，事實上對

7、受體G蛋白相互作用的特異性來說，最后的5個殘基最為重要。簡練的誘變研究已經(jīng)證實，受體細胞內(nèi)第三循環(huán)的C末端連接在G亞基上的C末端區(qū)域。就M2毒蕈堿受體耦合Gi來說，對于認識Gi/o的C末端由決定作用的確切受體殘留物已經(jīng)被清楚的解釋闡明了。一個更大的區(qū)域的G亞基的C-末端區(qū)域，以及N-末端的螺旋，在受體接觸中已經(jīng)被密切聯(lián)系起來了。 Gt丙氨酸掃描突變和G蛋白亞基殘留分析都表明Gt的C端50個氨基酸殘基是可以接觸視紫紅質(zhì)的。Arg-310位于Gt的4- 6環(huán)上，是完全阻止胰蛋白酶的蛋白在光激活的視紫紅質(zhì)下水解，這表明4 - 6環(huán)區(qū)的貢獻是與感受器連接。4 - 6環(huán)在5HT1B 羥色胺受體與Gi1特

8、異性反應和受體催化激活Gi方面密切相關。顯然，異源三聚體G蛋白的亞基增強了與亞基的相互作用能力。在亞基接觸殘基的單丙氨酸突變是接觸亞基塊受體介導的GTP / GDP的交換。這表明當GDP的釋放發(fā)生時，亞基必須讓亞基嚴格到位。在受體與亞基直接進行相互作用的情況已經(jīng)有報道。交聯(lián)的研究表明，G的C-末端的60個氨基酸的區(qū)域能與2 -腎上腺素能受體的肽交聯(lián)，從而進入受體細胞內(nèi)的第三循環(huán)。此外，G蛋白的亞基的C末端區(qū)已經(jīng)被證實與受體的耦合和特異性有關。異三聚體G蛋白與視紫紅質(zhì)和膜脂雙層的相互作用。視紫紅質(zhì)的螺旋的結(jié)構(gòu)來自于Schertler和Baldwin的研究。在視紫紅質(zhì)前，跨膜螺旋1、5、6、7是亮

9、綠色的，而跨膜螺旋2、3、4是在視紫紅質(zhì)之后，暗綠色的。11-順維生素A醛輔基由一個Lys-296希夫堿聯(lián)動形成，是洋紅色的。雙分子層是綠色的。細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和外循環(huán)是未知的，并且由手繪表現(xiàn)出螺旋的連通性。與異源三聚體相互作用的胞內(nèi)循環(huán)是橘黃色的和棕色的。（內(nèi)循環(huán)3和推定的細胞內(nèi)的第四循環(huán)的連接跨膜螺旋7的棕櫚酰化站點）。G亞基是深藍色的，G亞基是粉紅色的，G亞基是藍色的。GDP是紫紅色的。G蛋白的表面受體是旋轉(zhuǎn)20度面向讀者。在文章中討論的，在異源三聚體G蛋白上連接的受體是紅色的，并且包括G亞基上123號和299350號氨基酸殘基，一個在G亞基上的連接位點，那是包含在280-340氨基酸殘基中

10、和G亞基的6071氨基酸殘基。在C末端，視紫紅質(zhì)是可以移動的，G亞基在其N末端是肉豆蔻?；蜃貦磅；?。G亞基在C末端是白色的。在視紫紅質(zhì)，G，G上的?；M顯示與膜作用。激活的效應機制在GDP與亞基結(jié)合后，.GDP與亞基發(fā)生解離。這種耦合GDP是一種活性構(gòu)象，一種新的表面能在G*亞基上形成，并且它可以與效應器反應，與效應器的親和力可以比它和GDP耦合時的親和力高20100倍。研究表明，不同的G*s相互作用時所用方式具有相當高的特異性，不同的效應器有不同的酶穿過其表面。G*s激活腺苷酸環(huán)化酶，G*t激活感光細胞的cGMP二酯酶，G*p激活磷脂酶C。然而，這種在G亞基表面的保守開關不能解釋G蛋白上

11、亞基與效應器作用時精致的特異性。有一種Gt/Gi的嵌合方法可以識別以Gt為基礎的特異性相互作用，用磷酸二酯酶。類似的區(qū)域參與了帶有PLC2的Gq與帶有腺苷酸環(huán)化酶的Gs的相互作用。新奇的目標Gs主要分為Gs,Gi,和 Gq，是已知的靶細胞。最近，酵母雙雜交篩選發(fā)現(xiàn)了新的靶細胞。GAIP，是相互作用蛋白的GTPase RGS家族的一個成員- 激活蛋白，是第一個用這種方法確定的蛋白。并且最近兩個目標，無約束力的和一種新的LGN重復蛋白，已經(jīng)由同事描述出來了。到目前為止，無生理作用的后兩個G蛋白已經(jīng)確定。G蛋白亞基的其他效應正在被發(fā)現(xiàn)。例如，Gq直接刺激布魯頓絡氨酸激酶的活性，無論淋巴瘤細胞在體外還

12、是在體內(nèi)。含有未知效應器的兩個G亞基是G12和G13。報告顯示，它們可以與凝血酶，血栓素和血管緊縮素結(jié)合。這些G蛋白的突變激活形式對細胞的影響已經(jīng)被研究出來了，并且已經(jīng)確定它們可以調(diào)節(jié)Na/H的交換。通過Rac和Cdc42的活化技術(shù)，它們參與了電壓依賴性Ca的緩激肽的激活。為了了解G13的生物學作用，產(chǎn)生了基因敲除小鼠。純合的G13沒有被找到，并且盡管在胚胎期8.5天時胚胎是正常的，但是在10.5天之前它會被胚胎吸收。結(jié)果顯示，G13的缺乏會降低內(nèi)皮細胞的血管生成并且沒有能力發(fā)展成有組織的血管系統(tǒng)。另外，G13的胚胎成纖維細胞顯示了受損的遷徙對凝血酶的影響，這表明了趨化受損。有趣的是，雖然G1

13、2與G13有67%的地方完全相同，但G12并不能取代G13。的目標一旦G.GDP從G上解離，自由的是很多蛋白的催化劑，隨著時間的推移，能被催化的蛋白的種類在不斷增加。很明顯，自由的G的構(gòu)象與其在異源三聚體里時是一樣的，G通過與G上位點的結(jié)合來抑制G和感受器的相互作用。這方面的證據(jù)來自Iyengar實驗室的同事，他發(fā)現(xiàn)了來自ACII的一種肽，用來連接G和封鎖各種效應激活，表明了效應器的一部分結(jié)合位點是與ACII，GIRK和PLC共享的?？缒みB接與對接試驗局限于G連接區(qū)的部分結(jié)合位點。除了G連接區(qū)，其他G與效應器緊密作用的區(qū)域包含了N末端的卷曲螺旋和G的螺旋槳1,7葉片。G很好的定義的經(jīng)典第二信使

14、酶的亞基的影響-PLC2，-3和AC。它也吸收腎上腺素受體激酶來使膜激酶磷酸化從而激活受體。它也可以結(jié)合磷酸化光導蛋白，這種蛋白是用來隔絕并且因此控制通過cAMP依賴的蛋白激酶調(diào)節(jié)機制的可用性生理機能。近光感因子蛋白也顯示與G結(jié)合。對光感因子G復合物的晶體結(jié)構(gòu)解析顯示G的頂部有一個共享表面是用來讓G和光感因子進行相互作用的，但是內(nèi)部反應的第二位點在光感因子C端和G的螺旋的1和7葉片之間。有趣的是，光感因子上的磷酸化位點，用來調(diào)整G的緊密關系的，距離蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)界面十分遙遠。另外，G是一種直接催化劑，來催化K+, Ca2+，可能還有Na+的通道發(fā)生G蛋白應答反應。IKACh是用來向內(nèi)修正K離子通

15、道使得心臟跳動減慢從而與副交感神經(jīng)乙酰膽堿反應。這是一個同質(zhì)或異質(zhì)多聚體的GIRK，是在心臟和大腦發(fā)現(xiàn)的單體。G亞基連接GIRK的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的N端或C端并直接激活它們。似乎在確定的突觸前的Ca離子通道，G亞基扮演了重要的調(diào)節(jié)角色，尤其是對1A,1B和較短長度的1E，但并不針對1C, 1D, 1S亞型。現(xiàn)已經(jīng)有研究表明，G通過連接1亞基Ca離子通道的兩個區(qū)域來抑制Ca離子通道，這兩個區(qū)域分別為細胞內(nèi)的12循環(huán)和C末端。G也可以直接激活一個以上的磷脂酰肌醇-3-激酶亞型。有一種獨特的G -敏感的磷脂基化磷脂酰肌醇3激酶，P110,沒有p85或N-末端的p85結(jié)合區(qū)域上的催化亞單位。也有報道稱，G

16、也可以激活蛋白激酶，例如，該Raf1的蛋白激酶和布魯頓和TSK 酪氨酸激酶。在酵母中，G是一個刺激信息素激酶途徑的激活劑。已知它是的綁定到酵母中的腳手架蛋白Ste5的N-末端區(qū)域。最近，索納和協(xié)同工作者實驗表明，STE5含有一個二聚體域，這是需要進行綁定的。他們證明了G相互作用引導在STE5域的齊聚。有趣的是，大多數(shù)通過谷胱甘肽二聚域 Ste5 S-轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白導致MAP激酶級聯(lián)激活了G獨立交流。最近，酵母G也顯示激活Rho CDC24，這是一種GTPase Cdc42類型的交換因子。也有報道稱G綁定到其他 的Rho GTP酶家族的成員，Rho和Rac，以及小G蛋白ARF（ADP-核糖基化

17、因子），這是用來參與涂層的形成和囊泡運輸。鑒于這個G效應器和執(zhí)行器的激活機制非常豐富和擴展，對未來研究提出了一些關鍵問題。什么生理情況下是各種效應器能夠被激活和什么條件是讓所有這些效應器同時保持活性，是否不超過一個G蛋白偶聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導通路需要足夠的G產(chǎn)生活性使這些效應器激活？G效應特異性是什么，發(fā)生相互作用和活化的效應機制是什么？最后斷路機制是什么？G效應相互作用的決定因素身體內(nèi)有多個基因與G和G有關，并且大部分與G有關的堿基對能形成有功能的G。第一個問題是是否不同的G能調(diào)節(jié)是不同的效應器。從大量的生化實驗中我們得出的結(jié)果是：并非如此。G11在感光細胞的視紫紅質(zhì)和光傳感因子相互作用方面比其他更

18、優(yōu)秀，但在與所有其他的G對效應器相互作用方面比較，其表現(xiàn)很糟。一系列的研究表明，在G與受體和效應器相互作用方面的選擇性很高，使用的研究方法是使用反義寡核苷酸抑制PAR的翻譯特定的蛋白質(zhì)。特異性的其他證據(jù)是慢慢出現(xiàn)的，使用不同的研究技術(shù)。G5，最近發(fā)現(xiàn)的在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的G亞基，差異于兩個MAP激酶通路。由于G可抑制G的所有行動，G的結(jié)合殘留是效應激活決定因素的候選者。我們想測試這個想法通過單突變15個G的G的結(jié)合殘留對丙氨酸，和所有已被檢查的效應器，部分不再激活效應器的突變體。然而，在每個效應的相互作用下，不同的氨基酸殘基聚集在G的表面是至關重要的，建議一種機制，通過G獨特的接觸面能與許多不同

19、的效應器進行特定的相互作用。有趣的是，在某些情況下，去除側(cè)鏈能增加該突變體的G的激活效應器的效力。通過分子間的相互作用確定信號的特異性 細胞信號轉(zhuǎn)導事件的復雜性，即接收和處理多個信號是研究的重點。一些關鍵的問題是：1）在直接的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的編碼過程中有多大程度的特異性；2）有其他水平的細胞組織具有特異性嗎?和3) 集成的細胞反應交叉調(diào)節(jié)導致最終的機制是什么？眾所周知，多聚體受體可以聚集在一個單一的 G蛋白上，在許多情況下，一個單一的受體能比一個G蛋白激活得更多，從而調(diào)節(jié)多種細胞內(nèi)信號。在其他情況下，一個單一的受體與一個給定的G蛋白的相互作用似乎是被調(diào)節(jié)的通過特定基因的高度選擇性。一些

20、描述的特定受體-G蛋白相互作用的影響因素的優(yōu)秀的評論最近已經(jīng)出現(xiàn)了。早在體外研究受體-G蛋白相互作用的特點往往是通過高度雜交的受體-G蛋白的相互作用關系，但一些最近的研究表明，一些受體區(qū)別于甚至在相關的G蛋白之間的同一個家庭。原位有時具有很高的特異性，它是怎樣實現(xiàn)的呢？受體耦合的最精美的特異性 是在體內(nèi)通過G蛋白的胞內(nèi)信號通路，已經(jīng)被證實開始使用反義寡核苷酸抑制翻譯特定的G蛋白亞基。該技術(shù)允許的抑制不同的組成部分包括信號轉(zhuǎn)導途徑和任何后續(xù)的受損細胞的反應檢查。結(jié)果表明，鈣通道的抑制作用在生長激素生長抑素受體GH3細胞介導的Go213，而抑制M4毒蕈堿受體介導的 GO114。G的消除 通過反義技

21、術(shù)廢除生長抑素，在大鼠垂體GH鈣離子的抑制作用是由4C1細胞M4M，D2多巴胺受體介導的。相反，通過消耗的GI2受體介導的選擇性損害在該系統(tǒng)中抑制cAMP的積累。另一個反義的研究表明，M 1 毒蕈堿受體的利用一個特定的G蛋白組成的復雜的GQ/111/44激活磷脂酶C。最近的一項研究顯示，耦合血管緊縮素IIAT1A受體對于調(diào)節(jié)鈣 2 通道，鈣誘導的鈣釋放通道，Na+/H+ 交換是通過1313。這一水平的特異性在體外不能看到，或者可以使用過表達蛋白轉(zhuǎn)染研究。這就提出了如何針對蛋白質(zhì)或其他細胞機制問題可以獲得高的特異性。限制信令結(jié)果的曲目一些組織和靶蛋白和細胞結(jié)構(gòu),我們是在G中指定的蛋白質(zhì)相互作用的作用的候選人-蛋白信號轉(zhuǎn)導通路。另一個潛在的G蛋白調(diào)節(jié)劑，