分子生物學(xué)導(dǎo)論分子生物學(xué)研究方法(3)

1、1第九章第九章 分子生物學(xué)研究方法分子生物學(xué)研究方法(3)2第七節(jié)第七節(jié) 核酸序列分析技術(shù)核酸序列分析技術(shù)一、Sanger雙脫氧鏈終止法 二、Maxam-Gilbert DNA化學(xué)降解法三、DNA序列測定的自動化四、DNA雜交測序法 五、基因芯片測序六、最新測序技術(shù)4原理：原理：雙脫氧（雙脫氧（2，3）-核苷酸可以象核苷酸可以象2-脫氧核苷酸那樣直接脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的摻入新合成的DNA鏈中，但因鏈中，但因3端不具端不具OH基，基，DNA鏈合成至鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不同長度的故可

2、根據(jù)不同長度的DNA片段測定出核苷酸序列。片段測定出核苷酸序列。不能和下一個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接起來一、一、Sanger雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法 l 過程：過程：制備制備ss-DNA與引物與引物退火退火分為分為4個反應(yīng)系統(tǒng)個反應(yīng)系統(tǒng)每個每個系統(tǒng)中加入系統(tǒng)中加入dNTP（其中（其中dATP常帶同位素標(biāo)記）和常帶同位素標(biāo)記）和一種雙脫一種雙脫氧核苷酸氧核苷酸DNA聚合酶定序反聚合酶定序反應(yīng)應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物變性后電泳反應(yīng)產(chǎn)物變性后電泳凝凝膠干燥膠干燥放射自顯影。放射自顯影。 l 該法亦適合該法亦適合mRNA的序列分析。的序列分析。l GC富集區(qū)富集區(qū)常出現(xiàn)常出現(xiàn)“隱影隱影”或或“停止停止”現(xiàn)象，如

3、在反應(yīng)中加現(xiàn)象，如在反應(yīng)中加入入dITP（脫氧三磷酸次黃嘌呤）（脫氧三磷酸次黃嘌呤）或脫氧三磷酸或脫氧三磷酸-7-脫氧鳥苷可解脫氧鳥苷可解決決GC富集區(qū)的測序。富集區(qū)的測序。ATGCGGTACCAT53測序模板555555555 555四套反應(yīng)體系四套反應(yīng)體系1-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddATP TATACGCCATACGCCATGGTATACTACGCTACGCCTACGTACGCCATGTACGCCATGGTTACGCCATTACGCCATGGT2-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddCTP3-dATP, dCTP, dGTP, dTTP.

4、 + ddGTP4-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddTTP7雙脫氧法的特點雙脫氧法的特點 需要需要、和高質(zhì)量的和高質(zhì)量的。缺點缺點： （1）聚合反應(yīng)會因二級結(jié)構(gòu)而提前終止，常常測不到準(zhǔn)確）聚合反應(yīng)會因二級結(jié)構(gòu)而提前終止，常常測不到準(zhǔn)確的的DNA序列；序列； （2）由于經(jīng)模板與引物結(jié)合后才能反應(yīng)并測序，因此對于）由于經(jīng)模板與引物結(jié)合后才能反應(yīng)并測序，因此對于寡聚核苷酸寡聚核苷酸DNA序列（例如對引物序列（例如對引物DNA的序列）不能測定；的序列）不能測定； （3）該法直接分析的是合成的新鏈序列，而不是模板鏈，）該法直接分析的是合成的新鏈序列，而不是模板鏈，因此不能分析模板

5、中甲基化部位；因此不能分析模板中甲基化部位； （4）需要適當(dāng)?shù)囊锖湍芎铣蓡捂溎０宓妮d體。）需要適當(dāng)?shù)囊锖湍芎铣蓡捂溎０宓妮d體。優(yōu)點優(yōu)點：簡單、快速。：簡單、快速。8二、二、Maxam-Gilbert DNA化學(xué)降解法化學(xué)降解法基本步驟基本步驟:(1)先將先將DNA的末端之一進行標(biāo)的末端之一進行標(biāo)記記(通常為放射性同位素通常為放射性同位素32P)；(2)在多組互相獨立的化學(xué)反應(yīng)在多組互相獨立的化學(xué)反應(yīng)中分別進行特定堿基的化學(xué)修中分別進行特定堿基的化學(xué)修飾；飾；(3)在修飾堿基位置化學(xué)法斷開在修飾堿基位置化學(xué)法斷開DNA鏈；鏈；(4)聚丙烯酰胺凝膠電泳將聚丙烯酰胺凝膠電泳將DNA鏈按長短分開；

6、鏈按長短分開；(5)根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直接讀出直接讀出DNA的核苷酸序列。的核苷酸序列。9化學(xué)測序法的優(yōu)點：化學(xué)測序法的優(yōu)點：（1）待測的）待測的DNA序列來自原有的序列來自原有的DNA分子，因此可以分析分子，因此可以分析DNA被修飾的堿基；被修飾的堿基；（2）測序反應(yīng)不受）測序反應(yīng)不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響；二級結(jié)構(gòu)的影響；（3）不需要將待測序的）不需要將待測序的DNA亞克隆到其他載體上，不需要通過亞克隆到其他載體上，不需要通過通用的引物；通用的引物；（4）可測定較短的）可測定較短的DNA序列。序列?；瘜W(xué)測序法的缺點：化學(xué)測序法的缺點：（1）待測）待測DNA需要進

7、行末端放射性標(biāo)記、變性聚丙酰烯胺凝膠電需要進行末端放射性標(biāo)記、變性聚丙酰烯胺凝膠電泳分離分析，操作較復(fù)雜；泳分離分析，操作較復(fù)雜；（2）該方法測序范圍約為）該方法測序范圍約為250bp，稍低于雙脫氧法；，稍低于雙脫氧法；（3）本方法主要限制因素是變性聚丙酰烯胺凝膠電泳分離分析分）本方法主要限制因素是變性聚丙酰烯胺凝膠電泳分離分析分辨能力比較低。辨能力比較低。 10三、三、DNA序列測定的自動化序列測定的自動化 1. DNA測序步驟與自動化測序步驟與自動化 1）模板制備：可自動化）模板制備：可自動化 2）定序反應(yīng)：可自動化）定序反應(yīng)：可自動化 3）凝膠電泳：自動化有一定困難，制膠、點樣、電泳、）

8、凝膠電泳：自動化有一定困難，制膠、點樣、電泳、凝膠干燥、放射自顯影。凝膠干燥、放射自顯影。 4）核苷酸序列閱讀與計算機輸入：可自動化）核苷酸序列閱讀與計算機輸入：可自動化 DNA序列分析自動化包括兩個方面的內(nèi)容，序列分析自動化包括兩個方面的內(nèi)容，一是指一是指“分析反應(yīng)分析反應(yīng)”的自動化，另一方面則是的自動化，另一方面則是指指“讀片過程讀片過程”的自動化。的自動化。2. 自動測序儀自動測序儀 Conney等人于等人于1987年設(shè)計了不同熒光染料標(biāo)記引物，然后年設(shè)計了不同熒光染料標(biāo)記引物，然后做鏈終止測序，用激光掃描閱讀序列。做鏈終止測序，用激光掃描閱讀序列。 紅色紅色引物引物+T反應(yīng)系統(tǒng)（引物反

9、應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddTTP） 黑色引物黑色引物+G反應(yīng)系統(tǒng)（引物反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddGTP） 綠色綠色引物引物+A反應(yīng)系統(tǒng)（引物反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddATP） 蘭色蘭色引物引物+C反應(yīng)系統(tǒng)（引物反應(yīng)系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddCTP）12優(yōu)點優(yōu)點: (1) 四個反應(yīng)系統(tǒng)可合并點樣，大大節(jié)省制膠和點樣時間；四個反應(yīng)系統(tǒng)可合并點樣，大大節(jié)省制膠和點樣時間； (2) 可同時讀出多個樣品核苷酸序列，不需干燥凝膠和放射可同時讀出多個樣品核苷酸序列，不需干燥凝膠和放射自顯影；自顯影； (3) 可連續(xù)電泳，可讀出較多的核苷酸序列?？蛇B續(xù)電泳，可讀出較多

10、的核苷酸序列。缺點：缺點：無法保留原始記錄無法保留原始記錄, 四個反應(yīng)產(chǎn)物點在一條道上四個反應(yīng)產(chǎn)物點在一條道上,相互間會相互間會發(fā)生干擾發(fā)生干擾, 導(dǎo)致讀序時分辨率下降。導(dǎo)致讀序時分辨率下降。15四、四、DNA雜交測序法雜交測序法 自從自從70年代末期年代末期DNA測序技術(shù)問世以來，人們已經(jīng)做測序技術(shù)問世以來，人們已經(jīng)做了大量重要的改進，但從根本原理上創(chuàng)新的則只有了大量重要的改進，但從根本原理上創(chuàng)新的則只有雜交測雜交測序法序法（sequencing by hybridization，SBH）一種。它利用一）一種。它利用一組已知序列的寡核苷酸短序列作探針，同某一特定的較長組已知序列的寡核苷酸短序

11、列作探針，同某一特定的較長的靶的靶DNA分子進行雜交，從而測定其核苷酸的序列。分子進行雜交，從而測定其核苷酸的序列。 DNA雜交測序?qū)嵸|(zhì)上包括兩個主要的步驟：雜交測序?qū)嵸|(zhì)上包括兩個主要的步驟： 首先首先是將待測定的靶是將待測定的靶DNA分子同一組已知其核苷酸順分子同一組已知其核苷酸順序的寡核苷酸探針進行雜交，序的寡核苷酸探針進行雜交， 然后然后與那些能夠同靶與那些能夠同靶DNA形成完全的雙鏈雜合分子的形成完全的雙鏈雜合分子的寡核苷酸探針做比較分析，并據(jù)此推算出靶寡核苷酸探針做比較分析，并據(jù)此推算出靶DNA的核苷酸的核苷酸序列。序列。如果將一種核苷酸順序為如果將一種核苷酸順序為5-AGCCTAG

12、CTGAA-3的的12-mer的的靶靶DNA，與一組完全隨機的，與一組完全隨機的8-mer寡核苷酸探針混合雜交，在總寡核苷酸探針混合雜交，在總數(shù)為數(shù)為48=65536種的種的8-mer探針群體中，僅有探針群體中，僅有5種會與靶種會與靶DNA形成形成完全互補的雙鏈體分子。根據(jù)這完全互補的雙鏈體分子。根據(jù)這5種發(fā)生了完全雜交作用的種發(fā)生了完全雜交作用的8-mer寡核苷酸探針之間的重疊序列的線性關(guān)系，便可推算出這段寡核苷酸探針之間的重疊序列的線性關(guān)系，便可推算出這段12-mer的靶的靶DNA分子的核苷酸順序。分子的核苷酸順序。當(dāng)然，這只是一種理想化狀態(tài)，實際上此種雜交模式要復(fù)雜得當(dāng)然，這只是一種理想

13、化狀態(tài)，實際上此種雜交模式要復(fù)雜得多，因為那些沒有同靶多，因為那些沒有同靶DNA片段完全互補的寡核苷酸探針，也片段完全互補的寡核苷酸探針，也仍然會與之形成不穩(wěn)定的雙鏈分子。仍然會與之形成不穩(wěn)定的雙鏈分子。上圖是兩條長度均為上圖是兩條長度均為17-mer的靶的靶DNA片段片段I和和II的雜交測序結(jié)果，兩者僅在的雜交測序結(jié)果，兩者僅在第第8位堿基有不同，分別為位堿基有不同，分別為C和和T。靶靶DNA片段片段I可與可與18共共8段彼此相互重疊段彼此相互重疊的的8-mer寡核苷酸形成完全的雙鏈分子，但不能與第寡核苷酸形成完全的雙鏈分子，但不能與第9段段8-mer寡核苷酸形成寡核苷酸形成完全的雙鏈分子。

14、根據(jù)相鄰的兩段完全的雙鏈分子。根據(jù)相鄰的兩段8-mer寡核苷酸之間各自具有寡核苷酸之間各自具有7個堿基的重個堿基的重疊情況，可以構(gòu)建出互補的疊情況，可以構(gòu)建出互補的DNA序列。序列。靶靶DNA片段片段II的雜交結(jié)果表明，橫跨的雜交結(jié)果表明，橫跨其第其第8位堿基位堿基T的的6段段8-mer寡核苷酸的雙鏈體，由于含有內(nèi)部的堿基錯配，因寡核苷酸的雙鏈體，由于含有內(nèi)部的堿基錯配，因此其雜交效率明顯下降；但與第此其雜交效率明顯下降；但與第1和第和第8兩段兩段8-mer寡聚體形成的具有末端寡聚體形成的具有末端G-T錯配的雙鏈分子，其穩(wěn)定性下降并不顯著。與第錯配的雙鏈分子，其穩(wěn)定性下降并不顯著。與第9段段8

15、-mer寡核苷酸能雜交寡核苷酸能雜交形成完全的雙鏈體分子，證實與片段形成完全的雙鏈體分子，證實與片段I相比，它在第相比，它在第8位發(fā)生了由位發(fā)生了由C堿基到堿基到T堿堿基的變化?；淖兓?。181 ATACGTTA2 GTTAGATC3 ACGTTAGA4 CGTTAGAT5 GTTAGATCDNA 樣 品TATGCAATCTAG與基因芯片上 65,000 種可能的八聚體進行雜交從而形成特定的結(jié)合圖形計算機 分析雜交圖象并由探 針的重疊情況推導(dǎo)樣品的核酸序列1 ATACGTTA3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGAT5 GTTAGATC3 TACGTTAG4 ACGTTAGA

16、2 CGTTAGAT互補序列為：ATACGTTAGATC樣品序列為：TATGCAATCTAG五、基因芯片測序五、基因芯片測序 基因芯片測序流程基因芯片測序流程20六、最新測序技術(shù)六、最新測序技術(shù)1. 新一代測序技術(shù)（新一代測序技術(shù)（Next generation sequencing technology） 美國美國Roche Applied Science公司的公司的454基因組測序儀基因組測序儀 美國美國Illumina公司公司 英國英國Solexa technology公司合作開發(fā)的公司合作開發(fā)的Illumina測序儀測序儀 美國美國Applied Biosystems公司的公司的SOL

17、iD測序儀測序儀 Dover/Harvard公司的公司的Polonator測序儀測序儀 美國美國Helicos公司的公司的HeliScope單分子測序儀單分子測序儀 所有這些新型測序儀都使用了一種新的測序策略所有這些新型測序儀都使用了一種新的測序策略循循環(huán)芯片測序法環(huán)芯片測序法（cyclic-array sequencing），也可將其稱為），也可將其稱為“新一代測序技術(shù)或者第二代測序技術(shù)新一代測序技術(shù)或者第二代測序技術(shù)”。 21焦磷酸測序焦磷酸測序邊合成邊測序邊合成邊測序邊連接邊測序邊連接邊測序3730 xlSanger雙脫氧核苷酸雙脫氧核苷酸新一代測序技術(shù)的發(fā)展為基因組學(xué)研究帶來了更大的機

18、遇新一代測序技術(shù)的發(fā)展為基因組學(xué)研究帶來了更大的機遇http:/ 第三代測序技術(shù)（第三代測序技術(shù)（Third generation sequencing technology）英國牛津納米孔公司英國牛津納米孔公司 基于納米孔的基于納米孔的單分子讀取單分子讀取技術(shù)。技術(shù)。該技術(shù)在測序時該技術(shù)在測序時DNA分子依靠核酸外切酶一次一個堿基地分子依靠核酸外切酶一次一個堿基地通過小孔，無需多次擴增和熒光標(biāo)記。通過小孔，無需多次擴增和熒光標(biāo)記。 26第八節(jié)第八節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)一、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建二、受體材料的選擇三、植物遺傳轉(zhuǎn)化體系四、轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定適宜外植體的選擇及再生體系的建立適

19、宜外植體的選擇及再生體系的建立抗生素篩選壓的確定及農(nóng)桿菌菌株的選擇抗生素篩選壓的確定及農(nóng)桿菌菌株的選擇遺傳轉(zhuǎn)化操作遺傳轉(zhuǎn)化操作l 載體介導(dǎo)的載體介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化方法l DNA直接導(dǎo)入法直接導(dǎo)入法l 種質(zhì)系統(tǒng)法種質(zhì)系統(tǒng)法選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株鑒定轉(zhuǎn)基因植株鑒定獲得再生植株獲得再生植株轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株的繁殖與應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植株的繁殖與應(yīng)用利用報告基因利用報告基因Southern 雜交雜交Northern 雜交雜交Western 雜交雜交植物遺傳轉(zhuǎn)化流程植物遺傳轉(zhuǎn)化流程301. 一元載體系統(tǒng)一元載體系統(tǒng)一元載體系統(tǒng)是中間表達一元載體系統(tǒng)是中間表達載體與改造后的受體載體與改造

20、后的受體Ti質(zhì)質(zhì)粒通過同源重組所產(chǎn)生的粒通過同源重組所產(chǎn)生的一種復(fù)合型載體，通常又一種復(fù)合型載體，通常又稱為稱為共整合載體共整合載體。 一、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建一、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建312. 雙元載體系統(tǒng)雙元載體系統(tǒng)雙元載體系統(tǒng)是指兩個分別含有雙元載體系統(tǒng)是指兩個分別含有T-DNA和和Vir區(qū)的相容性區(qū)的相容性突變突變Ti質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng)，由于其質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng)，由于其T-DNA和和Vir區(qū)在區(qū)在兩個獨立的質(zhì)粒上，通過反式激活兩個獨立的質(zhì)粒上，通過反式激活T-DNA轉(zhuǎn)移，故又稱轉(zhuǎn)移，故又稱為為反式載體反式載體。 一元載體一元載體(順式載體順式載體)雙元載體雙元載體(反式載

21、體反式載體)32二、受體材料的選擇二、受體材料的選擇受體受體是指用于接受外源是指用于接受外源DNA的轉(zhuǎn)化材料。的轉(zhuǎn)化材料。良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)滿足如下條件：良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)滿足如下條件： 1. 高效穩(wěn)定的再生能力；高效穩(wěn)定的再生能力； 2. 受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性；受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性； 3. 外植體來源方便，如胚和其它器官等；外植體來源方便，如胚和其它器官等； 4. 對篩選劑敏感；對篩選劑敏感； 5. 轉(zhuǎn)化率高。轉(zhuǎn)化率高。33常用的受體材料有以下幾大類型常用的受體材料有以下幾大類型:1. 愈傷組織再生系統(tǒng)愈傷組織再生系統(tǒng) 外植體材料經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷

22、組織，轉(zhuǎn)化外植體材料經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化(帶帶有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染)，分化培養(yǎng)獲得再生植株。，分化培養(yǎng)獲得再生植株。優(yōu)點優(yōu)點：外植體來源廣，繁殖快，易接受外源基因，：外植體來源廣，繁殖快，易接受外源基因， 轉(zhuǎn)化效率高。轉(zhuǎn)化效率高。缺點缺點：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體 因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng)因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng)342. 直接分化再生系統(tǒng)直接分化再生系統(tǒng) 外植體材料細胞不經(jīng)過脫分化形成愈傷組織階段，而是直外植體材料細胞不經(jīng)過脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。接分化出不定芽形成再生植株。優(yōu)點優(yōu)點：周期短、操作簡

23、單，體細胞變異小，遺傳穩(wěn)定；：周期短、操作簡單，體細胞變異小，遺傳穩(wěn)定；缺點缺點：材料局限，轉(zhuǎn)化率低。：材料局限，轉(zhuǎn)化率低。353. 原生質(zhì)體再生系統(tǒng)原生質(zhì)體再生系統(tǒng) 原生質(zhì)體恢復(fù)細胞壁具有分化再生能力，是應(yīng)用最早的再原生質(zhì)體恢復(fù)細胞壁具有分化再生能力，是應(yīng)用最早的再生受體系統(tǒng)之一。生受體系統(tǒng)之一。優(yōu)點優(yōu)點：高效、廣泛地攝取外源：高效、廣泛地攝取外源DNA或遺傳物質(zhì)，獲得基因型或遺傳物質(zhì)，獲得基因型一致的克隆細胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，適用于多種轉(zhuǎn)一致的克隆細胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；化系統(tǒng)；缺點缺點：不易制備、再生困難和變異程度高。：不易制備、再生困難和變異程度高。3

24、64. 胚狀體再生系統(tǒng)胚狀體再生系統(tǒng) 是指具有胚胎性質(zhì)的個體。是指具有胚胎性質(zhì)的個體。優(yōu)點優(yōu)點：個體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因能力強，：個體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因能力強， 嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生。嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生。缺點缺點：技術(shù)含量高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。：技術(shù)含量高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。375. 生殖細胞受體系統(tǒng)生殖細胞受體系統(tǒng) 以生殖細胞如花粉粒、卵細胞等受體細胞進行外源基因轉(zhuǎn)以生殖細胞如花粉粒、卵細胞等受體細胞進行外源基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)?；南到y(tǒng)。 一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進行小孢子和卵細胞的單倍體培養(yǎng)、一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進行小孢子和卵細胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受

25、體系統(tǒng)；轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)； 二是直接利用花粉和卵細胞受精過程進行基因轉(zhuǎn)化，如花二是直接利用花粉和卵細胞受精過程進行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。粉管導(dǎo)入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。38三、植物遺傳轉(zhuǎn)化體系三、植物遺傳轉(zhuǎn)化體系（一）載體型遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（一）載體型遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)u 最常見的轉(zhuǎn)基因方法。最常見的轉(zhuǎn)基因方法。u 將外源基因重組進入適合的載體系統(tǒng)，通過載體將將外源基因重組進入適合的載體系統(tǒng)，通過載體將攜帶的外源基因?qū)胫参锛毎?，整合在核染色體組中并攜帶的外源基因?qū)胫参锛毎?，整合在核染色體組中并隨核染色體復(fù)制和表達。隨核染色體復(fù)制和表達。u 農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌Ti

26、質(zhì)粒質(zhì)粒（tumor-inducing plasmid）或）或 Ri質(zhì)粒質(zhì)粒(root-indcing plasmid)介導(dǎo)法是迄今為止植物基因工程介導(dǎo)法是迄今為止植物基因工程中應(yīng)用最多、機理最清楚、最理想的載體轉(zhuǎn)移方法。中應(yīng)用最多、機理最清楚、最理想的載體轉(zhuǎn)移方法。39農(nóng)桿菌共培養(yǎng)侵染誘導(dǎo)愈傷組織分化生芽生根葉盤轉(zhuǎn)化法(1)(1)葉盤法葉盤法 雙子葉植物雙子葉植物較為常用、簡單有效的方法。較為常用、簡單有效的方法。40 (2) 真空滲入法真空滲入法 將適宜轉(zhuǎn)化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因?qū)⑦m宜轉(zhuǎn)化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)真空處理，造傷，使

27、農(nóng)的農(nóng)桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)真空處理，造傷，使農(nóng)桿菌通過傷口感染植株，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)桿菌通過傷口感染植株，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。該法簡便、快速、可靠，不需要組織培養(yǎng)?；?。該法簡便、快速、可靠，不需要組織培養(yǎng)。(3) 愈傷組織共培養(yǎng)愈傷組織共培養(yǎng)(4) 原生質(zhì)體共培養(yǎng)原生質(zhì)體共培養(yǎng)41（二）（二）DNA直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 1. 化學(xué)刺激法化學(xué)刺激法 細胞融合劑：聚乙二醇（細胞融合劑：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（）、聚乙烯醇（PVC）轉(zhuǎn)化順利，對細胞傷害?。晦D(zhuǎn)化順利，對細胞傷害小；避免嵌合體的生成；避免嵌合體的生成；易于選擇；易于選擇；便于進行理論研究；便于進行

28、理論研究；受體廣泛。受體廣泛。 優(yōu)點：優(yōu)點：42將外源將外源DNA包裹在微小的鎢粉或金粉包裹在微小的鎢粉或金粉顆粒的表面，借助高壓動力射入受體顆粒的表面，借助高壓動力射入受體細胞或組織，最后整合到植物基因組細胞或組織，最后整合到植物基因組并得以表達。并得以表達。步驟簡單易行：適合于大多數(shù)細胞或步驟簡單易行：適合于大多數(shù)細胞或組織，克服了受體材料的限制，不必組織，克服了受體材料的限制，不必制備原生質(zhì)體，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用制備原生質(zhì)體，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，已經(jīng)成為植物細胞轉(zhuǎn)化最有效范圍，已經(jīng)成為植物細胞轉(zhuǎn)化最有效方法之一。方法之一。2. 基因槍轟擊法基因槍轟擊法 （微彈轟擊技術(shù)（微彈轟擊技術(shù)m

29、icro-projectile bombardment) 433. 高壓電穿孔法高壓電穿孔法電擊法電擊法 利用高壓脈沖作用，在原利用高壓脈沖作用，在原生質(zhì)體上形成可逆的瞬間生質(zhì)體上形成可逆的瞬間通道，從而促進外源通道，從而促進外源DNA的攝取。的攝取。444. 微注射法微注射法 細胞操作：細胞操作： 利用瓊脂糖包埋、聚賴氨酸粘連和微吸管吸附等方式利用瓊脂糖包埋、聚賴氨酸粘連和微吸管吸附等方式將受體細胞（原生質(zhì)體或生殖細胞）固定，然后將供體將受體細胞（原生質(zhì)體或生殖細胞）固定，然后將供體DNA或或RNA直接注射進入受體細胞。直接注射進入受體細胞。子房注射法或花粉管通道法：子房注射法或花粉管通道法

30、： 具有較大子房或胚囊的植株可在田間進行活體操作。操具有較大子房或胚囊的植株可在田間進行活體操作。操作簡便、成本低。作簡便、成本低。45四、轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定四、轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定1. 轉(zhuǎn)化體的篩選轉(zhuǎn)化體的篩選 外源目的基因轉(zhuǎn)化頻率低外源目的基因轉(zhuǎn)化頻率低 目的基因已被整合到核基因組并表達轉(zhuǎn)化細胞更少目的基因已被整合到核基因組并表達轉(zhuǎn)化細胞更少 使用特異性選擇標(biāo)記基因（使用特異性選擇標(biāo)記基因（selectable marker genes）進行標(biāo)記，有效地選擇出真正轉(zhuǎn)化細胞。進行標(biāo)記，有效地選擇出真正轉(zhuǎn)化細胞。常用選擇標(biāo)記基因：常用選擇標(biāo)記基因： 抗生素抗性基因；抗生素抗性基因； 除草劑抗性基

31、因除草劑抗性基因 將選擇標(biāo)記基因與適當(dāng)啟動子構(gòu)成嵌合基因，克隆到質(zhì)將選擇標(biāo)記基因與適當(dāng)啟動子構(gòu)成嵌合基因，克隆到質(zhì)粒載體上，與目的基因同時進行轉(zhuǎn)化。標(biāo)記基因在受體細粒載體上，與目的基因同時進行轉(zhuǎn)化。標(biāo)記基因在受體細胞表達，使轉(zhuǎn)化細胞具有抵抗相應(yīng)抗生素或除草劑的能力胞表達，使轉(zhuǎn)化細胞具有抵抗相應(yīng)抗生素或除草劑的能力而存活下來。非轉(zhuǎn)化細胞則被抑制、殺死。而存活下來。非轉(zhuǎn)化細胞則被抑制、殺死。462. 轉(zhuǎn)化體的鑒定轉(zhuǎn)化體的鑒定（1）DNA水平的鑒定水平的鑒定（2）轉(zhuǎn)錄水平的鑒定）轉(zhuǎn)錄水平的鑒定（3）翻譯水平的鑒定）翻譯水平的鑒定 47第九節(jié)第九節(jié)RNAi技術(shù)技術(shù) RNA干擾（干擾（RNA inter

32、ference, RNAi）是指在進化過程中）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。高效特異性降解的現(xiàn)象。 一、一、RNAi的發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)1995年，康乃爾大學(xué)的年，康乃爾大學(xué)的Guo等等秀麗新小桿線蟲秀麗新小桿線蟲(C.elegans) 二、二、RNA干擾的作用機制干擾的作用機制49 基因敲除基因敲除又叫基因打靶，通過外源又叫基因打靶，通過外源DNA與染色體與染色體DNA之間的之間的同源重組同源重組，進行精確的定點修飾和基因改，進行精確的定點修飾和基因改造，具有專一

33、性強、染色體造，具有專一性強、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點。定遺傳等特點。l 完全基因敲除完全基因敲除l 條件型基因敲除條件型基因敲除第十節(jié)第十節(jié) 基因敲除技術(shù)基因敲除技術(shù) (gene knock-out)51第十節(jié)第十節(jié) 蛋白組學(xué)及其研究技術(shù)蛋白組學(xué)及其研究技術(shù) 一、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容二、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù) 1. 免疫組織化學(xué)技術(shù) 2. 雙向電泳技術(shù) 3. 生物質(zhì)譜技術(shù) 4. 酵母雙雜交和噬菌體展示技術(shù) 5. 芯片技術(shù) 6. 凝膠阻滯電泳（EMSA） 7. DNase I 足跡法52mRNA經(jīng)翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，一個細胞在特定經(jīng)翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，一個細胞在特定生

34、理或病理狀態(tài)下表達的所有種類的蛋白質(zhì)生理或病理狀態(tài)下表達的所有種類的蛋白質(zhì)稱為稱為蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組(proteome) 蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics) 是是1994年澳大利亞年澳大利亞學(xué)者學(xué)者Wilkins 和和Williams提出的。提出的。蛋白組學(xué)蛋白組學(xué)(proteomics)旨在闡明生物體全部旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式及功能模式，其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的表達模式及功能模式，其內(nèi)容包括鑒定蛋白質(zhì)的表達、存在方式、結(jié)構(gòu)、功能鑒定蛋白質(zhì)的表達、存在方式、結(jié)構(gòu)、功能和相互作用等。和相互作用等。 53一、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容一、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容1. 蛋白質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)鑒定2.

35、翻譯后修飾翻譯后修飾3. 蛋白質(zhì)功能確定蛋白質(zhì)功能確定4. 醫(yī)學(xué)應(yīng)用醫(yī)學(xué)應(yīng)用54二、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)二、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)分為蛋白質(zhì)組學(xué)分為結(jié)構(gòu)蛋結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)白質(zhì)組學(xué)和和功能蛋白質(zhì)功能蛋白質(zhì)組學(xué)組學(xué)兩大類。兩大類。前者主要研究蛋白質(zhì)氨前者主要研究蛋白質(zhì)氨基酸序列及三維結(jié)構(gòu)、基酸序列及三維結(jié)構(gòu)、種類分析和數(shù)量確定；種類分析和數(shù)量確定；后者主要研究蛋白質(zhì)的后者主要研究蛋白質(zhì)的功能和相互作用。功能和相互作用。（一）免疫組織化學(xué)技術(shù)（一）免疫組織化學(xué)技術(shù)（二）雙向電泳技術(shù)（二）雙向電泳技術(shù)57（三）生物質(zhì)譜技術(shù)（三）生物質(zhì)譜技術(shù)58（四）酵母雙雜交和噬菌體展示技術(shù)（四）酵母雙雜交和噬菌體展示技術(shù)（五）芯片技術(shù)（五）芯片技術(shù)61（六）凝膠阻滯電泳（六）凝膠阻