絲氨酸蛋白酶抑制劑

1、LOGO絲絲 氨氨 酸酸 蛋蛋 白白 酶酶 抑抑 制制 劑劑絲氨酸蛋白酶抑制劑 一、物質(zhì)簡介二、研究進(jìn)展 1. 理化性質(zhì)、種類、分布及結(jié)構(gòu) 1.1 理化性質(zhì) 1.2 種類、分布 1.3 分子結(jié)構(gòu) 1.4 基因表達(dá)及cDNA編碼特點(diǎn)（若有研究需綜述） 2 作用機(jī)理 3 功能作用 4 應(yīng)用 4.1 應(yīng)用 4.2 作為食品、化工、臨床藥物的優(yōu)點(diǎn)與局限 4.3 研究展望，重點(diǎn)是需要研究的方面 三、活性物質(zhì)的研究方法及手段 3.1研究的技術(shù)路線及方案 3.2分離純化方案 3.3 活性鑒定方法 3.4 基因克隆物質(zhì)簡介 絲氨酸蛋白酶抑制劑具有廣泛的生物活性和作用，在新藥研制和防治疾病方面具有廣闊的前景。蛋

2、白酶抑制劑可與病毒蛋白酶催化基因結(jié)合抑制酶活性，導(dǎo)致蛋白前體裂解和形成成熟病毒體。作為一類重要的艾滋病藥物，蛋白酶抑制劑市場可謂是一塊誘人的大蛋糕。目前已經(jīng)投入市場的蛋白酶抑制劑主要有：奈非那韋、沙奎邦韋、茚地那韋、安潑那韋、利托那韋、洛匹那韋及復(fù)合制劑。綜述 1 理化性質(zhì)種類分布及結(jié)構(gòu) 目前在人、動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌及病毒中發(fā)現(xiàn)的絲氨酸蛋白酶抑制劑超過1500種，根據(jù)其序列相似性、二硫鍵拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和反應(yīng)位點(diǎn)的不同，Laskowski和Kato (1980)將絲氨酸蛋白酶抑制劑分為八個(gè)不同的超家族，2000年進(jìn)一步分為17個(gè)蛋白家族。絲氨酸蛋白酶抑制劑一般為單一肽鏈蛋白質(zhì)，且氨基酸殘基具有較強(qiáng)

3、的保守性。絲氨酸蛋白酶抑制劑分子一般由350500個(gè)氨基酸殘基組成，在X光下的晶體結(jié)構(gòu)一般為球狀蛋白并含有9個(gè)螺旋和3個(gè)折疊。1.1 理化性質(zhì)綜述分布分布：廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物體中。在動(dòng)物體中。種類：種類：根據(jù)活性位點(diǎn)氨基酸種類不同可將蛋白酶抑制劑分為四大類型:絲氨酸蛋白酶抑制劑、巰基蛋白酶抑制劑、天冬氨酸蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶抑制劑。其中尤以絲氨酸蛋白酶及其抑制劑在體內(nèi)一些重要生理活動(dòng)中起關(guān)鍵性的調(diào)控作用。 1.2 種類、分布綜述 絲氨酸蛋白酶抑制劑是一類單鏈蛋白質(zhì)，它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)及特性多種多樣，僅氨基酸的數(shù)量就從大約29個(gè)到400個(gè)。經(jīng)序列分析和X射線衍射圖譜分析，這些抑制劑并非

4、同源。基于其序列、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及功能的相似性，絲氨酸蛋白酶抑制劑可分為至少20個(gè)家族。1.3 分子結(jié)構(gòu)綜述 絲氨酸蛋白酶抑制劑按其抑制機(jī)理的不同分為典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑、非典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑及serpin類絲氨酸蛋白酶抑制。 典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑 非典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑多來源于吸血生非典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑多來源于吸血生物，特異性地阻斷參與凝血反應(yīng)的酶，尤其是物，特異性地阻斷參與凝血反應(yīng)的酶，尤其是凝血酶和凝血酶和XaXa因子。這類抑制劑通過因子。這類抑制劑通過N N端與酶的酶端與酶的酶切位點(diǎn)相互作用行使抑制功能。切位點(diǎn)相互作用行使抑制功能。 2 作用機(jī)

5、理綜述 最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶的水解平衡。作為調(diào)控物，絲氨酸蛋白酶抑制劑參與機(jī)體免疫反應(yīng)，對(duì)生物體內(nèi)的血液凝固、補(bǔ)體形成、纖溶、蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞基質(zhì)重建、激素形成、激素轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)蛋白水解、血壓調(diào)節(jié)、腫瘤抑制以及病毒或寄生蟲致病性的形成等許多重要的生化反應(yīng)和生理功能有重要的影響3 功能作用綜述 天然的蛋白酶抑制劑具備抗病毒的潛能，能控制外源細(xì)菌釋放的蛋白酶水解抑制特異性病毒生長并使自身細(xì)胞不受傷害。基于上述功能，蛋白酶抑制劑作為藥物使用已經(jīng)被研究開發(fā)了好多年，目前已被用于治療人類免疫缺陷?。℉IV）和高血壓等疾病。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制

6、劑是一個(gè)用于藥物治療的蛋白酶抑制劑。ACE能催化血管緊縮素和血管緊縮素的水解，一個(gè)有效的血管收縮藥能使緩激肽失活。而ACE抑制劑通過降低周圍血管阻力達(dá)到降低血壓的目的，同時(shí)ACE抑制劑能降低蛋白尿和穩(wěn)定腎功能，對(duì)治療糖尿病腎病有療效。ACE抑制劑的使用最初源于1977年。目前其它的ACE抑制劑也已投入市場。4.1 應(yīng)用綜述 HIV蛋白酶在PhePro，PheLeu，PheThr的特異性剪切，使得抑制劑的設(shè)計(jì)必須具備高度可變性。目前，有8類蛋白酶抑制劑用于HIV治療，包括替拉那韋，印地那韋，沙奎那韋，洛匹那韋。新一代的抑制劑正在被開發(fā)以發(fā)揮最大的療效，來治療病患。目前治療HIV的第二代蛋白酶抑制

7、劑TMC114已進(jìn)入臨床階段測試中。 這些藥物制劑的研究成功引起了人們對(duì)于蛋白酶抑制劑治療作用的極大興趣。下面將集中介紹蛋白酶抑制劑針對(duì)多種疾病的潛在使用價(jià)值。綜述 絲氨酸蛋白酶抑制劑具有廣泛的生物活性和作用，在新藥研制和防治疾病方面具有廣闊的前景。蛋白酶抑制劑可與病毒蛋白酶催化基因結(jié)合抑制酶活性，導(dǎo)致蛋白前體裂解和形成成熟病毒體?，F(xiàn)階段，經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)生產(chǎn)的蛋白酶抑制劑僅有3個(gè)品種。這主要是由于蛋白酶抑制劑在合成工藝方面存在相當(dāng)?shù)碾y度，受限于技術(shù)、成本等問題，目前主要利用物理、化學(xué)或者生物化學(xué)方法，從動(dòng)植物及微生物體內(nèi)收集材料例如動(dòng)物的血液以及植物的塊根塊莖等提取各類絲氨酸蛋白

8、酶抑制劑，并不能大量低成本地獲得抑制劑蛋白，從而使得其不能大規(guī)模投入生產(chǎn)4.2 作為食品、化工、臨床藥物的優(yōu)點(diǎn)與局限綜述 蛋白酶抑制劑在合成工藝方面存在相當(dāng)?shù)碾y度，受限于技術(shù)、成本等問題，目前主要利用物理、化學(xué)或者生物化學(xué)方法 因此，研究人員已著手構(gòu)建含有抑制劑基因的工程菌株，利用微生物發(fā)酵成本低、產(chǎn)量大和可控性高的有點(diǎn)，嘗試進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，滿足人們對(duì)于抑制劑的實(shí)際需要。4.3 研究展望，重點(diǎn)是需要研究的方面3 3 活活性物性物質(zhì)的質(zhì)的研究研究方法方法及手及手段段3.1 研究的技術(shù)路線及方案綜述1、收集動(dòng)物組織，以發(fā)色底物對(duì)其進(jìn)行絲氨酸蛋白酶抑制活性測定，包括胰蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白

9、酶和胰凝乳蛋白酶。3.2分離純化方案綜述2、通過ConA Sepharose 4B親和層析、Sephadex G-75凝膠過濾、反相高壓液相等生化技術(shù)手段，從中獲得一個(gè)表觀分子量約為43kDa的單鏈蛋白。我們將其命名為CaSPI。CaSPI對(duì)胰蛋白酶具有專一性的抑制活性。Edman降解法測序結(jié)果顯示CaSPI的N-末端氨基酸序列為EAHPSHSGED。糖蛋白檢測結(jié)果表明CaSPI屬于糖蛋白。接合活性測定中，CaSPI在SDS-PAGE電泳時(shí)能與胰蛋白酶形成穩(wěn)定的復(fù)合物，該結(jié)果提示它可能屬于serpins蛋白超家族中的一員。綜述3、利用RT-PCR和RACE技術(shù)，獲得了一條全長為1397bp，其

10、中包括1233bp完整的開放閱讀框的核酸序列，編碼410個(gè)氨基酸。對(duì)由核酸序列推測的氨基酸序列分析顯示，在52-408處具有SERPIN結(jié)構(gòu)域。經(jīng)過BLAST比對(duì)，該蛋白與來源于動(dòng)物腦膜液的CP9等serpins超家族的絲氨酸蛋白酶抑制劑具有高度同源性，并且在P1位置處為精氨酸（Arg），推測該蛋白屬于Sepins超家族一員綜述4、對(duì)所獲得的蛋白酶抑制劑CaSPI進(jìn)行結(jié)合比和及最小抑制常數(shù)Ki測定，結(jié)果為CaSPI與胰蛋白酶結(jié)合比為1.15：1時(shí)能完全抑制蛋白酶水解活性，Ki為0.46M，表明CaSPI為競爭性抑制劑。并對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)定性（時(shí)間、溫度、pH、金屬離子及變性劑）檢測，表明CaSPI具

11、有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。綜述熱穩(wěn)定性 材料中絲氨酸蛋白酶抑制劑樣品溶液（質(zhì)量終濃度50mg/ml）在30、40、50、60、70、80、90和100加熱10 min, 取出后立即放冰上冷卻，然后用檢測抑制劑活性的方法測定處理樣品的抑制活性酸堿穩(wěn)定性 將材料中絲氨酸蛋白酶抑制劑樣品溶液（質(zhì)量終濃度50 mg/ml）與等體積的pH 2-11的各種緩沖溶液（緩沖溶液為0.2M氨基乙酸-HCl 緩沖溶液， pH 2和3；0.2M乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，pH 4和5；0.2M磷酸氫鹽緩沖溶液，pH 6,7和8；0.2M氨基乙酸-NaOH緩沖溶液，pH 9,10和11）混合，4放置18h，然后用0.4M TrisHCl緩沖溶液，pH 7.8調(diào)整抑制劑混合溶液的pH值為7.8，并測定其抑制劑活性。3.3 活性鑒定方法綜述 利用RT-PCR和RACE技術(shù)，獲得了一條全長為1397bp，其中包括1233bp完整的開放閱讀框的核酸序列，編碼410個(gè)氨基酸。對(duì)