植物源農(nóng)藥的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定修改版

1、植物源農(nóng)藥的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒植物源農(nóng)藥的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定定張龍來(lái)張龍來(lái)Email：2014.10.20 一、基本概念一、基本概念 1、提取提?。豪眠m當(dāng)?shù)娜軇┗蚍椒ǎ瑢⑺豪眠m當(dāng)?shù)娜軇┗蚍椒?，將所要成分盡可能從原料中完全提出的過(guò)程。要成分盡可能從原料中完全提出的過(guò)程。 2、分離分離：將提取物中所含的各種成分一：將提取物中所含的各種成分一一分開(kāi)，并將得到的單體加以精制的過(guò)一分開(kāi)，并將得到的單體加以精制的過(guò)程。程。第一節(jié)第一節(jié) 植物源農(nóng)藥的提取植物源農(nóng)藥的提取 水水 親水性有機(jī)溶劑親水性有機(jī)溶劑 親脂性有機(jī)溶劑親脂性有機(jī)溶劑二、提取方法二、提取方法l超臨界流體萃取法（超臨界流體萃取法（SFE）

2、l水蒸氣蒸餾法水蒸氣蒸餾法l溶劑提取法溶劑提取法l升華法升華法l壓榨法壓榨法溶劑溶劑 （一）溶劑提取法一）溶劑提取法 根據(jù)天然成分的溶解性不同，選用對(duì)根據(jù)天然成分的溶解性不同，選用對(duì)所需成分溶解度大而對(duì)其他成分溶解度小所需成分溶解度大而對(duì)其他成分溶解度小的溶劑，將所需成分從生物材料中溶解出的溶劑，將所需成分從生物材料中溶解出來(lái)的一種提取方法。來(lái)的一種提取方法。 溶劑提取是指溶劑進(jìn)入生物體細(xì)胞，溶劑提取是指溶劑進(jìn)入生物體細(xì)胞，溶解或分散其有用物質(zhì)而變成浸出物的全溶解或分散其有用物質(zhì)而變成浸出物的全過(guò)程。過(guò)程。 包括包括浸潤(rùn)、解吸和擴(kuò)散浸潤(rùn)、解吸和擴(kuò)散三個(gè)階段。三個(gè)階段。1、溶劑提取法的原理、溶劑

3、提取法的原理選擇溶劑依據(jù)選擇溶劑依據(jù)相似相溶相似相溶原理。原理。 浸潤(rùn)：滲透階段浸潤(rùn)：滲透階段 溶劑通過(guò)細(xì)胞壁滲透到細(xì)胞中。溶劑通過(guò)細(xì)胞壁滲透到細(xì)胞中。解吸：溶解階段解吸：溶解階段 細(xì)胞內(nèi)容物與細(xì)胞組織之間有親和細(xì)胞內(nèi)容物與細(xì)胞組織之間有親和 力，溶劑破除這種親和力。力，溶劑破除這種親和力。擴(kuò)散：置換階段擴(kuò)散：置換階段 利用細(xì)胞內(nèi)的滲透力產(chǎn)生的壓差而抽利用細(xì)胞內(nèi)的滲透力產(chǎn)生的壓差而抽提出來(lái)，用溶劑占領(lǐng)內(nèi)容物的位置而將內(nèi)提出來(lái)，用溶劑占領(lǐng)內(nèi)容物的位置而將內(nèi)容物置換出來(lái)。容物置換出來(lái)。 擴(kuò)散過(guò)程表達(dá)式：擴(kuò)散過(guò)程表達(dá)式：dtdxdcDFdsdt: 擴(kuò)散時(shí)間擴(kuò)散時(shí)間F：擴(kuò)散面積，以粉碎度表示：擴(kuò)散面積

4、，以粉碎度表示濃度差濃度差dxdcD： 擴(kuò)散系數(shù)擴(kuò)散系數(shù)rNRTD61ds: 在在dt時(shí)間內(nèi)的擴(kuò)散量時(shí)間內(nèi)的擴(kuò)散量 2、選擇溶劑的要點(diǎn)、選擇溶劑的要點(diǎn) * 對(duì)所要成分溶解度大對(duì)所要成分溶解度大 * 沸點(diǎn)適中容易回收沸點(diǎn)適中容易回收 * 低毒安全低毒安全 * 廉價(jià)廉價(jià) 天然產(chǎn)物成分中，萜、甾等大環(huán)、稠環(huán)化天然產(chǎn)物成分中，萜、甾等大環(huán)、稠環(huán)化合物極性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等合物極性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等易溶于水、乙醇等極性溶劑中；酸堿性成分因易溶于水、乙醇等極性溶劑中；酸堿性成分因存在狀態(tài)不同溶解性不同。存在狀態(tài)不同溶解性不同。 最常用的溶劑為乙醇。最常用的溶劑為乙醇。 3、溶劑

5、的分類、溶劑的分類 * 強(qiáng)極性溶劑：水強(qiáng)極性溶劑：水 * 親水性有機(jī)溶劑：親水性有機(jī)溶劑： 能與水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮）能與水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮） * 親脂性有機(jī)溶劑：親脂性有機(jī)溶劑： 不與水任意混溶，可分層（正丁醇、乙醚、不與水任意混溶，可分層（正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、環(huán)己烷、石油醚）乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、環(huán)己烷、石油醚） 常用溶劑的極性大小順序：常用溶劑的極性大小順序： 石油醚石油醚四氯化碳四氯化碳苯苯氯仿氯仿乙醚乙醚乙酸乙酯乙酸乙酯正丁醇正丁醇丙酮丙酮乙醇（甲醇）乙醇（甲醇）Kb K=CU/CL CU、CL為被分離物質(zhì)在上相和下相中濃度為被分離物質(zhì)在上相

6、和下相中濃度 1、萃取法、萃取法 利用混和物中各成分在兩種互不相溶的溶劑利用混和物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)不同而達(dá)到分離的方法。中分配系數(shù)不同而達(dá)到分離的方法。 根據(jù)根據(jù)值的大小可決定分離采用的方法值的大小可決定分離采用的方法 100, 簡(jiǎn)單的一次萃取，可基本分離。簡(jiǎn)單的一次萃取，可基本分離。10，數(shù)次乃至，數(shù)次乃至10余次萃取，余次萃取，CCD法法2，100次以上萃取，次以上萃取，DCCC法，法，HSCCC法法1，不能分離，不能分離可以根據(jù)可以根據(jù)PC法計(jì)算法計(jì)算值，選擇理想的分離條件。值，選擇理想的分離條件。 2.沉淀分離法沉淀分離法 根據(jù)溶解度的不同，控制溶液條件使溶液中的

7、化根據(jù)溶解度的不同，控制溶液條件使溶液中的化合物或離子分離的方法統(tǒng)稱為沉淀分離法。方法合物或離子分離的方法統(tǒng)稱為沉淀分離法。方法的主要依據(jù)是溶度積原理的主要依據(jù)是溶度積原理。 根據(jù)沉淀劑的不同，沉淀分離也可以分成用無(wú)機(jī)根據(jù)沉淀劑的不同，沉淀分離也可以分成用無(wú)機(jī)沉淀劑的分離法、用有機(jī)沉淀劑的分離法和共沉沉淀劑的分離法、用有機(jī)沉淀劑的分離法和共沉淀分離富集法。沉淀分離法和共沉淀分離法的區(qū)淀分離富集法。沉淀分離法和共沉淀分離法的區(qū)別主要是：沉淀分離法主要使用于常量組分的分別主要是：沉淀分離法主要使用于常量組分的分離（毫克離（毫克 量級(jí)以上）；而共沉淀分離法主要使用量級(jí)以上）；而共沉淀分離法主要使用于

8、痕量組分的分離（小于于痕量組分的分離（小于1mg/mL）。）。 常用的沉淀分離方法及試劑常用的沉淀分離方法及試劑 1 、無(wú)機(jī)沉淀劑、無(wú)機(jī)沉淀劑 氫氧化物、硫化物、其它沉淀劑。氫氧化物、硫化物、其它沉淀劑。 2、有機(jī)沉淀劑、有機(jī)沉淀劑 草酸、銅試劑、銅鐵試。草酸、銅試劑、銅鐵試。3.結(jié)晶和重結(jié)晶結(jié)晶和重結(jié)晶 在化學(xué)里面，熱的飽和溶液冷卻后，溶質(zhì)以晶體在化學(xué)里面，熱的飽和溶液冷卻后，溶質(zhì)以晶體的形式析出，這一過(guò)程叫結(jié)晶。的形式析出，這一過(guò)程叫結(jié)晶。 重結(jié)晶是將晶體溶于溶劑或熔融以后，又重新從重結(jié)晶是將晶體溶于溶劑或熔融以后，又重新從溶液或熔體中結(jié)晶的過(guò)程。重結(jié)晶可以使不純凈溶液或熔體中結(jié)晶的過(guò)程。

9、重結(jié)晶可以使不純凈的物質(zhì)獲得純化，或使混合在一起的鹽類彼此分的物質(zhì)獲得純化，或使混合在一起的鹽類彼此分離。離。 重結(jié)晶提純法的一般過(guò)程重結(jié)晶提純法的一般過(guò)程 1、溶劑選擇、溶劑選擇 2、固體物質(zhì)的溶解、固體物質(zhì)的溶解 3、雜質(zhì)的除去、雜質(zhì)的除去 4、晶體的析出、晶體的析出 5、晶體的收集和洗滌、晶體的收集和洗滌 6、晶體的干燥、晶體的干燥4.膜分離膜分離 利用膜的選擇性分離實(shí)現(xiàn)料液的不同組分的利用膜的選擇性分離實(shí)現(xiàn)料液的不同組分的分離、純化、濃縮的過(guò)程稱作膜分離分離、純化、濃縮的過(guò)程稱作膜分離液膜分離過(guò)程分為乳液膜分離過(guò)程分為乳化液膜和固定液膜的分化液膜和固定液膜的分離過(guò)程；離過(guò)程；合成膜的分

10、離過(guò)程包合成膜的分離過(guò)程包括微過(guò)濾、超過(guò)濾、反括微過(guò)濾、超過(guò)濾、反滲透、氣體滲透分離、滲透、氣體滲透分離、滲透蒸發(fā)、滲析及電滲滲透蒸發(fā)、滲析及電滲析等過(guò)程。析等過(guò)程。 二：柱色譜1.吸附柱色譜 吸附分類吸附分類 物理吸附：物理吸附：無(wú)選擇性吸附，吸附無(wú)選擇性吸附，吸附-解吸附發(fā)生迅速，吸附解吸附發(fā)生迅速，吸附劑如劑如硅膠、氧化鋁、活性炭硅膠、氧化鋁、活性炭等；等；化學(xué)吸附：化學(xué)吸附：不可逆吸附，如堿性氧化鋁對(duì)酚酸性成分的不可逆吸附，如堿性氧化鋁對(duì)酚酸性成分的吸附；酸性硅膠對(duì)生物堿的吸附等；吸附；酸性硅膠對(duì)生物堿的吸附等；半化學(xué)吸附：半化學(xué)吸附：聚酰胺聚酰胺對(duì)酚酸類、醌類的氫鍵吸附。對(duì)酚酸類、醌

11、類的氫鍵吸附。 吸附原理：相似相吸吸附原理：相似相吸 影響吸附過(guò)程的三要素：影響吸附過(guò)程的三要素：吸附劑（固定相）吸附劑（固定相）溶質(zhì)（被分離物質(zhì)）溶質(zhì)（被分離物質(zhì)）溶劑（洗脫劑、展開(kāi)劑、流動(dòng)相）溶劑（洗脫劑、展開(kāi)劑、流動(dòng)相） 2、硅膠、氧化鋁、硅膠、氧化鋁 極性吸附劑極性吸附劑：載樣量大，吸附力強(qiáng)：載樣量大，吸附力強(qiáng)硅膠硅膠：有中性、酸性之分，適用于各類成分分離。：有中性、酸性之分，適用于各類成分分離。氧化鋁：有中性、酸性、堿性之分，不適合于分離氧化鋁：有中性、酸性、堿性之分，不適合于分離酸性成分，多用于分離生物堿。酸性成分，多用于分離生物堿。 被分離物質(zhì)吸附力與結(jié)構(gòu)的關(guān)系被分離物質(zhì)吸附力與

12、結(jié)構(gòu)的關(guān)系 被分離物質(zhì)極性大，吸附力強(qiáng)，難洗脫，被分離物質(zhì)極性大，吸附力強(qiáng)，難洗脫，Rf值小。值小。 官能團(tuán)極性大小排列順序：官能團(tuán)極性大小排列順序：-COOH Ar-OH R-OH R-NH2、RNHR、RNRR RCONRR RCHO RCOR RCOOR ROR RH 溶劑（洗脫劑）的極性與洗脫力的關(guān)系溶劑（洗脫劑）的極性與洗脫力的關(guān)系洗脫劑極性越大，洗脫力越強(qiáng)；洗脫劑極性越大，洗脫力越強(qiáng)； OOHOHCOOHOOOHOHCH3OHOOOHOHCH3O 大黃酸大黃酸大黃素大黃素大黃酚大黃酚酸性最強(qiáng)酸性最強(qiáng)酸性其次酸性其次酸性最弱酸性最弱溶于溶于NaHCO3溶于溶于Na2CO3溶于溶于Na

13、OH 例：從黃花夾竹桃果仁中分離到七種強(qiáng)心苷成分，例：從黃花夾竹桃果仁中分離到七種強(qiáng)心苷成分，根據(jù)極性大小推測(cè)從硅膠柱上的洗脫順序。根據(jù)極性大小推測(cè)從硅膠柱上的洗脫順序。 名稱名稱RR黃夾苷黃夾苷ACHO(D-glc)2黃夾苷黃夾苷BCH3(D-glc)2黃夾次苷黃夾次苷ACHOH黃夾次苷黃夾次苷BCH3H黃夾次苷黃夾次苷CCH2OHH黃夾次苷黃夾次苷DCOOHH單乙酰黃夾次苷單乙酰黃夾次苷BCH3H OOOHROOROOROCH3CH3單乙酰黃夾次苷單乙酰黃夾次苷B R = COCH3 , 其它其它R = H 3、 活性炭活性炭-非極性吸附劑非極性吸附劑 吸附力與結(jié)構(gòu)的關(guān)系吸附力與結(jié)構(gòu)的關(guān)系

14、 分子量大者分子量大者 分子量小者分子量小者芳香族芳香族 脂肪族，活性炭和芳香族均有平面型脂肪族，活性炭和芳香族均有平面型分子的緣故。分子的緣故。含含OH、COOH、NH2多者多者 少者少者 3、活性炭、活性炭-非極性吸附劑非極性吸附劑 溶劑的洗脫力溶劑的洗脫力 吡啶吡啶 15%酚酚/醇醇 7%酚酚/H2O 醇醇 含水醇含水醇 H2O 黃酮、生物堿的富集，糖的分離，脫色等。黃酮、生物堿的富集，糖的分離，脫色等。 應(yīng)用應(yīng)用 4、聚酰胺（、聚酰胺（Polyamide） 由己酰胺聚合成的一類高分子化合物。由己酰胺聚合成的一類高分子化合物。 H2CNHOCH2H2CCH2H2CCH2NH2COHCH2

15、NHOH2CCH2H2CCH2H2CNCH2OHOOOH分離原理：主要分離原理：主要通過(guò)通過(guò)酰胺酰胺與與酚、酚、酸、醌酸、醌等化合物等化合物形成氫鍵形成氫鍵，吸附，吸附能力取決于氫鍵能力取決于氫鍵的強(qiáng)弱。的強(qiáng)弱。 2.分配柱色譜分配柱色譜 液液-液柱色譜法，其固定相和流動(dòng)相均為液液柱色譜法，其固定相和流動(dòng)相均為液體，液態(tài)固定相又稱固定液，被涂漬在惰體，液態(tài)固定相又稱固定液，被涂漬在惰性材料載體上構(gòu)成固定相。分配柱色譜法性材料載體上構(gòu)成固定相。分配柱色譜法的優(yōu)點(diǎn)是：穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性好，適用樣的優(yōu)點(diǎn)是：穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性好，適用樣品的類型廣等。品的類型廣等。 固定相極性小于流動(dòng)相固定相極性小于流動(dòng)相

16、，如，如HPLC反相色譜柱、反相薄層反相色譜柱、反相薄層色譜板。色譜板。固定相固定相：硅膠的硅醇基與烷基結(jié)合，如：硅膠的硅醇基與烷基結(jié)合，如RP-2、RP-8、RP-18，親脂性親脂性：RP-18 RP-8 RP-2流動(dòng)相流動(dòng)相（洗脫劑）：（洗脫劑）：MeOH-H2O；CH3CN-H2O洗脫順序洗脫順序：分離極性大的成分：分離極性大的成分，極性大者先被洗脫出來(lái)，極性大者先被洗脫出來(lái)。 固定相的表面修飾固定相的表面修飾 RH-2RH-8RH-18化學(xué)修飾硅膠親水性表面親脂性表面3.離子交換色譜 離子交換色譜中的固定相是一些帶電荷的基團(tuán)，離子交換色譜中的固定相是一些帶電荷的基團(tuán)， 這些帶電基團(tuán)通過(guò)

17、靜電相互作用與帶相反電荷的這些帶電基團(tuán)通過(guò)靜電相互作用與帶相反電荷的離子結(jié)合。如果流動(dòng)相中存在其他帶相反電荷的離子結(jié)合。如果流動(dòng)相中存在其他帶相反電荷的離子，按照質(zhì)量作用定律，這些離子將與結(jié)合在離子，按照質(zhì)量作用定律，這些離子將與結(jié)合在固定相上的反離子進(jìn)行交換。固定相基團(tuán)帶正電固定相上的反離子進(jìn)行交換。固定相基團(tuán)帶正電荷的時(shí)候，其可交換離子為陰離子，這種離子交荷的時(shí)候，其可交換離子為陰離子，這種離子交換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團(tuán)帶負(fù)電換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團(tuán)帶負(fù)電荷，可用來(lái)與流動(dòng)相交換的離子就是陽(yáng)離子，這荷，可用來(lái)與流動(dòng)相交換的離子就是陽(yáng)離子，這種離子交換劑叫做陽(yáng)離子交換劑

18、。種離子交換劑叫做陽(yáng)離子交換劑。 陰離子交換柱的功能團(tuán)主要是陰離子交換柱的功能團(tuán)主要是NH2，及，及NH3 ：陽(yáng)離子交換劑的功能團(tuán)主要是：陽(yáng)離子交換劑的功能團(tuán)主要是SO3H及及COOH。其中。其中-NH3 離子交換柱及離子交換柱及-SO3H離子交換劑離子交換劑屬于強(qiáng)離子交換劑，它們?cè)诤軓V泛的屬于強(qiáng)離子交換劑，它們?cè)诤軓V泛的pH范圍內(nèi)都范圍內(nèi)都有離子交換能力；有離子交換能力；-NH2及及-COOH 離子交換柱屬于離子交換柱屬于弱離子交換劑，只有在一定的弱離子交換劑，只有在一定的pH值范圍內(nèi)，才能值范圍內(nèi)，才能有離子交換能力。離子交換色譜主要用于可電離有離子交換能力。離子交換色譜主要用于可電離化合

19、物的分離，例如，氨基酸自動(dòng)分析儀中的色化合物的分離，例如，氨基酸自動(dòng)分析儀中的色譜柱，多肽的分離、蛋白質(zhì)的分離，核苷酸、核譜柱，多肽的分離、蛋白質(zhì)的分離，核苷酸、核苷和各種堿基的分離等。苷和各種堿基的分離等。 4、凝膠層析、凝膠層析（Gel Penetration Chromatography, GPC） 葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠 交聯(lián)葡聚糖是由一定平均分子量的葡聚糖和交聯(lián)葡聚糖是由一定平均分子量的葡聚糖和交聯(lián)劑（一般為環(huán)氧氯丙烷）以醚橋的形式互相交聯(lián)劑（一般為環(huán)氧氯丙烷）以醚橋的形式互相交聯(lián)形成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)高分子材料，是水交聯(lián)形成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)高分子材料，是水不溶性的白色球狀顆粒，酸性

20、環(huán)境能水解，堿中不溶性的白色球狀顆粒，酸性環(huán)境能水解，堿中穩(wěn)定。穩(wěn)定。 在樣品通過(guò)一定孔徑的凝膠固定相時(shí)，由于在樣品通過(guò)一定孔徑的凝膠固定相時(shí)，由于流經(jīng)路徑的不同，使不同相對(duì)分子量的組分得以流經(jīng)路徑的不同，使不同相對(duì)分子量的組分得以分離的方法。分離的方法。 表面有孔隙，其大小決定于聚糖與交聯(lián)劑表面有孔隙，其大小決定于聚糖與交聯(lián)劑的配比及反應(yīng)條件。的配比及反應(yīng)條件。 商品型號(hào)即按凝膠的交聯(lián)度大小分類，并商品型號(hào)即按凝膠的交聯(lián)度大小分類，并以吸水量來(lái)表示，英文字母以吸水量來(lái)表示，英文字母G代表葡聚糖凝膠，代表葡聚糖凝膠，后面的數(shù)字表示每克凝膠吸水量，再乘以后面的數(shù)字表示每克凝膠吸水量，再乘以10的

21、的值，值，G-25的吸水量為每克的吸水量為每克2.5ml。 交聯(lián)度大交聯(lián)度大網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密孔隙越小孔隙越小吸吸水膨脹越少。水膨脹越少。 型號(hào)型號(hào)吸水量吸水量（ml/g）床體積床體積（ml/g）分離范圍分離范圍最小溶脹時(shí)間最小溶脹時(shí)間肽與蛋白質(zhì)肽與蛋白質(zhì)多糖多糖室溫室溫沸水沸水G-101.023小于小于700小于小于70031G-151.52.53.5小于小于1500小于小于150031G-252.54610005000100500062G-505.091115003萬(wàn)萬(wàn)5001萬(wàn)萬(wàn)62G-757.5121530007萬(wàn)萬(wàn)10005萬(wàn)萬(wàn)243G-100101520400015萬(wàn)萬(wàn)1

22、00010萬(wàn)萬(wàn)485G-150152030500040萬(wàn)萬(wàn)100015萬(wàn)萬(wàn)725G-200203040500080萬(wàn)萬(wàn)100020萬(wàn)萬(wàn)725凝膠的型號(hào)與使用范圍凝膠的型號(hào)與使用范圍 層析原理層析原理 絕大部分在水溶液中進(jìn)行，凝膠顆粒在適當(dāng)絕大部分在水溶液中進(jìn)行，凝膠顆粒在適當(dāng)溶劑中浸泡，待充分膨脹后裝入層析柱，加樣后溶劑中浸泡，待充分膨脹后裝入層析柱，加樣后用同一溶液洗脫。在洗脫過(guò)程中，較小的分子滲用同一溶液洗脫。在洗脫過(guò)程中，較小的分子滲入凝膠，較大的分子隨溶液流動(dòng)，分子量小的物入凝膠，較大的分子隨溶液流動(dòng)，分子量小的物質(zhì)（阻滯作用大）可通過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入粒子內(nèi)部，質(zhì)（阻滯作用大）可通過(guò)凝膠網(wǎng)

23、孔進(jìn)入粒子內(nèi)部，然后擴(kuò)散出來(lái)，故流程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢，后流出然后擴(kuò)散出來(lái)，故流程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢，后流出色譜柱，分子量大的物質(zhì)沉凝膠粒子間孔隙，隨色譜柱，分子量大的物質(zhì)沉凝膠粒子間孔隙，隨洗脫液移動(dòng)，流程短，移動(dòng)速度快，先流出色譜洗脫液移動(dòng)，流程短，移動(dòng)速度快，先流出色譜柱。柱。 不同的化合物由于其大小差異，在流經(jīng)不同的化合物由于其大小差異，在流經(jīng)GPC柱時(shí)，不同柱時(shí)，不同分子量的化合物流經(jīng)體積不同（大分子不能或難以進(jìn)入凝膠分子量的化合物流經(jīng)體積不同（大分子不能或難以進(jìn)入凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，直接從凝膠顆粒之間穿過(guò)，保留時(shí)間短；網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，直接從凝膠顆粒之間穿過(guò)，保留時(shí)間短；而小分子恰恰相反，保

24、留時(shí)間較長(zhǎng)）而得以分離而小分子恰恰相反，保留時(shí)間較長(zhǎng)）而得以分離 。 常用術(shù)語(yǔ)常用術(shù)語(yǔ)Vt 床體積，凝膠裝柱以后，柱床所占的體積。床體積，凝膠裝柱以后，柱床所占的體積。Vo外水體積，柱床內(nèi)存在于凝膠外面的水相外水體積，柱床內(nèi)存在于凝膠外面的水相體積。體積。Vi內(nèi)水體積，凝膠顆粒內(nèi)部所含的水相體積。內(nèi)水體積，凝膠顆粒內(nèi)部所含的水相體積。Vg凝膠本身體積。凝膠本身體積。相互關(guān)系：相互關(guān)系：Vt= Vo+ Vi+ VgVe洗脫體積，自樣品加入時(shí)算起，至流出組洗脫體積，自樣品加入時(shí)算起，至流出組分最大濃度出現(xiàn)時(shí)，所流出的體積分最大濃度出現(xiàn)時(shí)，所流出的體積 。 同一類型化合物，洗脫特征與組分分子量同一類

25、型化合物，洗脫特征與組分分子量有關(guān)。有關(guān)。 Ve=K1-K2logM 說(shuō)明不同組分流經(jīng)凝膠柱時(shí)，按分子量大小說(shuō)明不同組分流經(jīng)凝膠柱時(shí)，按分子量大小順序流出，分子量大的，洗脫體積小，最先流出，順序流出，分子量大的，洗脫體積小，最先流出，當(dāng)條件固定時(shí)，當(dāng)條件固定時(shí)，Ve重現(xiàn)性很好。重現(xiàn)性很好。 按此特性可測(cè)大分子物質(zhì)的分子量。按此特性可測(cè)大分子物質(zhì)的分子量。 用已知分子量的物用已知分子量的物質(zhì)分別相繼上柱（質(zhì)分別相繼上柱（5mg），），流出液按每管流出液按每管24ml收集，收集，通過(guò)硫酸蒽酮顯色，再經(jīng)通過(guò)硫酸蒽酮顯色，再經(jīng)紫外檢測(cè)，分別求得洗脫紫外檢測(cè)，分別求得洗脫體積體積Ve。再用藍(lán)色葡聚糖。再

26、用藍(lán)色葡聚糖測(cè)出柱床的外水體積測(cè)出柱床的外水體積Vo，按按Ve /Vo與分子量對(duì)數(shù)關(guān)與分子量對(duì)數(shù)關(guān)系作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，最系作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后將待測(cè)物質(zhì)分子量用少后將待測(cè)物質(zhì)分子量用少水溶解上柱，在同樣條件水溶解上柱，在同樣條件下測(cè)定下測(cè)定Ve，根據(jù)，根據(jù)Ve/Vo，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得物質(zhì)分查標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得物質(zhì)分子量。子量。 局限性：局限性： 1、要有標(biāo)準(zhǔn)樣。、要有標(biāo)準(zhǔn)樣。 2、不同的待測(cè)物質(zhì)、不同的待測(cè)物質(zhì)要有不同的標(biāo)準(zhǔn)樣。要有不同的標(biāo)準(zhǔn)樣。 操作技術(shù)：操作技術(shù)：溶脹：溶脹：不同凝膠溶脹時(shí)間不一樣，不同凝膠溶脹時(shí)間不一樣，G-100室溫下最室溫下最小水化時(shí)間小水化時(shí)間72h，除微顆粒。目的：

27、充分吸水，各，除微顆粒。目的：充分吸水，各孔隙舒張，以利于物質(zhì)分子通過(guò)。孔隙舒張，以利于物質(zhì)分子通過(guò)。 裝柱：裝柱：柱內(nèi)加少量洗脫液，排除底部氣泡，然后將柱內(nèi)加少量洗脫液，排除底部氣泡，然后將凝膠漿倒入，讓其自然沉降，打開(kāi)出口，柱床表面凝膠漿倒入，讓其自然沉降，打開(kāi)出口，柱床表面不再下沉即緊密。裝好的柱應(yīng)不含氣泡，柱床表面不再下沉即緊密。裝好的柱應(yīng)不含氣泡，柱床表面平坦。平坦。 平衡：平衡：用用3倍床體積洗脫液讓柱平衡流動(dòng)倍床體積洗脫液讓柱平衡流動(dòng)2-3天，天，至流速恒定。至流速恒定。 加樣：加樣：平衡后，床表面應(yīng)有平衡后，床表面應(yīng)有12cm的洗脫液，的洗脫液，用吸管沿柱壁加入，打開(kāi)出口，當(dāng)上

28、面液體剛用吸管沿柱壁加入，打開(kāi)出口，當(dāng)上面液體剛好全部滲入柱內(nèi)時(shí)，滴加洗脫液，注意不能振好全部滲入柱內(nèi)時(shí)，滴加洗脫液，注意不能振動(dòng)床表面。動(dòng)床表面。 上樣品要體積小，濃度大，這樣峰形好。上樣品要體積小，濃度大，這樣峰形好。 洗脫：洗脫：一般用水和電解質(zhì)溶液，如酸、堿、鹽的一般用水和電解質(zhì)溶液，如酸、堿、鹽的溶液及緩沖溶液。加入溶液及緩沖溶液。加入5cm以上洗脫液時(shí)，可接高以上洗脫液時(shí)，可接高位瓶中的洗脫液，位瓶中的洗脫液， 洗脫分階段洗脫和梯度洗脫洗脫分階段洗脫和梯度洗脫收集：收集：分部收集器收集。分部收集器收集。 檢出：檢出：蛋白質(zhì)、核苷酸、多肽用紫外光譜儀在蛋白質(zhì)、核苷酸、多肽用紫外光譜儀

29、在280nm、260nm、230nm測(cè)吸光度值，以樣品體積測(cè)吸光度值，以樣品體積（或管數(shù)）為橫座標(biāo)，吸光度為縱座標(biāo)，畫出洗脫（或管數(shù)）為橫座標(biāo)，吸光度為縱座標(biāo)，畫出洗脫曲線。曲線。 5、大孔樹(shù)脂柱色譜、大孔樹(shù)脂柱色譜 大孔吸附樹(shù)脂的吸附實(shí)質(zhì)為一種物體高度分散或大孔吸附樹(shù)脂的吸附實(shí)質(zhì)為一種物體高度分散或表面分子受作用力不均等而產(chǎn)生的表面吸附現(xiàn)象表面分子受作用力不均等而產(chǎn)生的表面吸附現(xiàn)象，這種吸附性能是由于范德華引力或生成，這種吸附性能是由于范德華引力或生成氫鍵氫鍵的的結(jié)果。同時(shí)由于大孔吸附樹(shù)脂的多孔結(jié)構(gòu)使其對(duì)結(jié)果。同時(shí)由于大孔吸附樹(shù)脂的多孔結(jié)構(gòu)使其對(duì)分子大小不同的物質(zhì)具有篩選作用。通過(guò)上述這分子

30、大小不同的物質(zhì)具有篩選作用。通過(guò)上述這種吸附和篩選原理，有機(jī)化合物根據(jù)吸附力的不種吸附和篩選原理，有機(jī)化合物根據(jù)吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附樹(shù)脂上經(jīng)一定溶同及分子量的大小，在大孔吸附樹(shù)脂上經(jīng)一定溶劑洗脫而達(dá)到分離、純化、除雜、濃縮等不同目劑洗脫而達(dá)到分離、純化、除雜、濃縮等不同目的。的。 吸附樹(shù)脂的表面發(fā)生吸附作用后，會(huì)使樹(shù)脂吸附樹(shù)脂的表面發(fā)生吸附作用后，會(huì)使樹(shù)脂表面上溶質(zhì)的濃度高于溶劑內(nèi)溶質(zhì)的濃度，其結(jié)表面上溶質(zhì)的濃度高于溶劑內(nèi)溶質(zhì)的濃度，其結(jié)果引起體系內(nèi)放熱和自由能的下降果引起體系內(nèi)放熱和自由能的下降。 大孔吸附樹(shù)脂按其極性大小和所選用的單體分子大孔吸附樹(shù)脂按其極性大小和所選用的

31、單體分子結(jié)構(gòu)不同，可分為非極性、中極性和極性三類。結(jié)構(gòu)不同，可分為非極性、中極性和極性三類。 （1）非極性大孔吸附樹(shù)脂）非極性大孔吸附樹(shù)脂 非極性大孔吸附樹(shù)脂是由非極性大孔吸附樹(shù)脂是由偶極矩偶極矩很小的單體聚合很小的單體聚合制得的不帶任何功能基，孔表的疏水性較強(qiáng)，可制得的不帶任何功能基，孔表的疏水性較強(qiáng)，可通過(guò)與小分子內(nèi)的疏水部分的作用吸附溶液中的通過(guò)與小分子內(nèi)的疏水部分的作用吸附溶液中的有機(jī)物，最適于極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)，也有機(jī)物，最適于極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)，也稱為芳香族吸附劑，例如苯乙烯、二乙烯苯聚合稱為芳香族吸附劑，例如苯乙烯、二乙烯苯聚合物。物。 （2）中等極性大孔吸附樹(shù)脂）中

32、等極性大孔吸附樹(shù)脂 中等極性大孔吸附樹(shù)脂是含酯基的吸附樹(shù)脂，且中等極性大孔吸附樹(shù)脂是含酯基的吸附樹(shù)脂，且多功能團(tuán)的甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑。其表面兼多功能團(tuán)的甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑。其表面兼有疏水和親水兩部分。既可極性溶劑中吸附非極有疏水和親水兩部分。既可極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)，又可由非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)，也性物質(zhì)，又可由非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)，也稱為脂肪族吸附劑，例如聚丙烯酸酯型聚合物。稱為脂肪族吸附劑，例如聚丙烯酸酯型聚合物。 （3）極性大孔吸附樹(shù)脂）極性大孔吸附樹(shù)脂 極性大孔吸附樹(shù)脂是指含酰胺基、極性大孔吸附樹(shù)脂是指含酰胺基、氰基氰基、酚羥基、酚羥基等含氮、等含氮、氧氧、硫極性功能

33、基的吸附樹(shù)脂，它們通、硫極性功能基的吸附樹(shù)脂，它們通過(guò)過(guò)靜電靜電相互作用吸附極性物質(zhì)，如丙烯酰胺。相互作用吸附極性物質(zhì)，如丙烯酰胺。6.親和色譜親和色譜 親和色譜也稱為親和層析，是一種利用固定相的親和色譜也稱為親和層析，是一種利用固定相的結(jié)合特性來(lái)分離分子的色譜方法。親和色譜在凝結(jié)合特性來(lái)分離分子的色譜方法。親和色譜在凝膠過(guò)濾色譜柱上連接與待分離的物質(zhì)有一定結(jié)合膠過(guò)濾色譜柱上連接與待分離的物質(zhì)有一定結(jié)合能力的分子，并且它們的結(jié)合是可逆的，在改變能力的分子，并且它們的結(jié)合是可逆的，在改變流動(dòng)相條件時(shí)二者還能相互分離。親和色譜可以流動(dòng)相條件時(shí)二者還能相互分離。親和色譜可以用來(lái)從混合物中純化或濃縮某

34、一分子，也可以用用來(lái)從混合物中純化或濃縮某一分子，也可以用來(lái)去處或減少混合物中某一分子的含量。來(lái)去處或減少混合物中某一分子的含量。 紙色譜（紙色譜（PC），也叫紙分配色譜（），也叫紙分配色譜（PPC，Paper Partition Chromatography） )1 ()1 ()1(1)1(1fafbfbfafbfbfafaBARRRRRRRRKK (為紙色譜定數(shù)為紙色譜定數(shù)) Rfa、Rfb為為A、B兩物質(zhì)在兩物質(zhì)在PC上的上的Rf值值 pH值值 對(duì)于酸性、堿性和兩性化合物，對(duì)于酸性、堿性和兩性化合物，pH值可以改值可以改變它們的存在狀態(tài)（游離型、解離型），分配比變它們的存在狀態(tài)（游離型、解離型），分配比受受pH的影響。的影響。 HA + H2O = A- + H3O+3HAOHAKapKa= pH - logA-/HApH = pKa + logA-/HAHA達(dá)到達(dá)到99%解離時(shí)，解離時(shí)，pH = pKa + 2HA達(dá)到達(dá)到99%游離時(shí)，游離時(shí)，pH = pKa - 2 2) 酸堿性成分的分離酸堿性成分的分離-pH梯度萃取法梯度萃取法 按酸堿性強(qiáng)弱的不同分離酸性、堿性、中按酸堿性強(qiáng)弱的不同分離酸性、堿性、中性物質(zhì)，改變性物質(zhì)，改變pH值使酸堿成分呈不同狀態(tài)。值使酸堿成分呈不同狀態(tài)。 如中藥大黃中的大