基因工程制藥工藝

1、主講教師： 劉 凱 liukai_山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物系第六章 基因工程制藥工藝n6.1 基因工程制藥微生物表達(dá)系統(tǒng)n6.2 基因工程大腸桿菌的構(gòu)建n6.3 基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制基因工程藥物的生產(chǎn)分為基因工程藥物的生產(chǎn)分為上游上游和和下游下游兩個(gè)階段：兩個(gè)階段：上游階段上游階段：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成 克隆目的基因克隆目的基因 目的基因的表達(dá)目的基因的表達(dá)基因工程藥物生產(chǎn)的基本過(guò)程基因工程藥物生產(chǎn)的基本過(guò)程下游階段下游階段：將實(shí)驗(yàn)室的成果產(chǎn)業(yè)化、商品化：將實(shí)驗(yàn)室的成果產(chǎn)業(yè)化、商品化 工程菌大量培養(yǎng)工程菌大量培養(yǎng) 產(chǎn)品的分離純化和質(zhì)量控制。產(chǎn)品的分離純化和質(zhì)量控制?；蚬こ趟?/p>

2、物研究的技術(shù)路線基因工程藥物研究的技術(shù)路線-上游技術(shù)上游技術(shù)PCR篩選，酶切確認(rèn)，提取質(zhì)粒測(cè)序篩選，酶切確認(rèn)，提取質(zhì)粒測(cè)序誘導(dǎo)表達(dá)誘導(dǎo)表達(dá)分離純化目的蛋白分離純化目的蛋白目的基因克隆目的基因克隆酶切酶切質(zhì)粒提取、酶切質(zhì)粒提取、酶切轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞連接、轉(zhuǎn)化連接、轉(zhuǎn)化基因工程藥物涉及的技術(shù)基因工程藥物涉及的技術(shù)RNA提取及操作提取及操作, 防防RNA酶酶 引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)cDNA合成合成PCR質(zhì)粒提取質(zhì)粒提取限制性內(nèi)切酶操作限制性內(nèi)切酶操作DNA連接連接制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌無(wú)菌操作無(wú)菌操作制備各種培養(yǎng)基制備各種培養(yǎng)基12. 瓊脂糖電泳瓊脂糖

3、電泳13. 蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)純化14. SDS-PAGE15. 微生物發(fā)酵技術(shù)微生物發(fā)酵技術(shù)16. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)17. 熟悉熟悉DNA分析軟件分析軟件18. 熟悉分子生物學(xué)常用網(wǎng)站熟悉分子生物學(xué)常用網(wǎng)站基因工程菌n概念：概念：以微生物為操作對(duì)象，通過(guò)基因工程技術(shù)獲得的表達(dá)外源基因，或過(guò)量表達(dá)或抑制自身基因的工程生物體。n種類： 基因工程大腸桿菌和酵母：重組蛋白質(zhì)藥物 基因工程技術(shù)改造出發(fā)菌：氨基酸、抗生素、甾體激素、中間體生產(chǎn)6.1.1 大腸桿菌系統(tǒng)1、大腸桿菌（Escherichia coli）形態(tài)特征細(xì)胞：G-，單細(xì)胞，桿狀，鞭毛，無(wú)芽孢，一般無(wú) 莢膜。裂殖。菌落：白色

4、至黃白色，光滑，直徑23mmn2、生化與遺傳特性能在僅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的無(wú)機(jī)鹽的極限培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，發(fā)酵糖，產(chǎn)氣、產(chǎn)酸。繁殖一代約17min基因工程中使用菌株：K-12株的衍生菌株基因組：4.6 Mbp，3000多種蛋白質(zhì)染色體DNA為環(huán)狀雙鏈，核外遺傳物質(zhì)為質(zhì)粒3、質(zhì)粒載體復(fù)制子選擇標(biāo)記多克隆位點(diǎn)質(zhì)粒載體的基本特征n自主復(fù)制性：復(fù)制子復(fù)制起始點(diǎn)及控制復(fù)制頻率的調(diào)控元件。質(zhì)粒DNA不依賴于染色體DNA而自主復(fù)制。n選擇標(biāo)記：質(zhì)粒編碼的選擇標(biāo)記，產(chǎn)生一種新的表型，用于轉(zhuǎn)化體的篩選。如：抗生素抗性基因，氨芐、四環(huán)素、卡那等。n多克隆位點(diǎn)：外源基因插入載體的位置，由多種常見(jiàn)的限制性內(nèi)切酶

5、位點(diǎn)序列構(gòu)成。n不相容性：具有相同或相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)及特征的兩種不同質(zhì)粒不能穩(wěn)定地存在于同一宿主細(xì)胞內(nèi)。n轉(zhuǎn)移性：通過(guò)細(xì)菌接合作用從一個(gè)宿主轉(zhuǎn)移到另一個(gè)宿主細(xì)胞/菌質(zhì)粒類型n嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒：每個(gè)細(xì)胞含少數(shù)拷貝質(zhì)粒n松弛型質(zhì)粒：每個(gè)細(xì)胞含幾十至幾百拷貝質(zhì)粒n克隆質(zhì)粒：用于克隆和擴(kuò)增外源基因n測(cè)序質(zhì)粒：用于基因測(cè)序n整合質(zhì)粒：用于外源基因與宿主染色體整合n穿梭質(zhì)粒：能在兩種宿主細(xì)胞存在n表達(dá)質(zhì)粒：能表達(dá)基因產(chǎn)物表達(dá)載體MCS附近結(jié)構(gòu) 啟動(dòng)子 操縱子 核糖體結(jié)合位點(diǎn) MCS 終止子4、產(chǎn)物表達(dá)形式n不溶性蛋白質(zhì)：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成包涵體n可溶性蛋白質(zhì)：存在于細(xì)胞質(zhì)n周質(zhì)表達(dá)：外源蛋白被運(yùn)輸分泌到周質(zhì)空間，可溶性

6、n胞外表達(dá)：胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)液中5、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的問(wèn)題、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的問(wèn)題缺點(diǎn)缺點(diǎn): 1）缺乏翻譯后修飾，如）缺乏翻譯后修飾，如糖基化糖基化 2）常形成包涵體）常形成包涵體，復(fù)性效果差復(fù)性效果差 3）蛋白質(zhì)易被降解）蛋白質(zhì)易被降解 4）內(nèi)毒素內(nèi)毒素難以除盡，產(chǎn)生熱源難以除盡，產(chǎn)生熱源 5）N端增加的端增加的蛋氨酸蛋氨酸容易引起免疫反應(yīng)容易引起免疫反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): 1）簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)，快速）簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)，快速 2）適合于制備抗體適合于制備抗體，供下游研究供下游研究6、應(yīng)用n大量外源基因能超量的表達(dá)，18種藥物上市n多肽類：2種（甲狀旁腺激素1-34、利尿鈉肽）n激素：胰島素及2種突變體

7、、8種生長(zhǎng)素（1種PEG化）n細(xì)胞因子類：5種干擾素（1種PEG化）、干擾素和，2種G-CSF（1種PEG化）、白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗劑n溶栓酶類：rPA（reteplase，瑞替普酶）n白喉毒素-1L 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等6.1.2 酵母表達(dá)系統(tǒng)1、形態(tài)特征細(xì)胞：?jiǎn)渭?xì)胞真核生物，球形，橢圓形，卵形繁殖：芽殖、裂殖，在特定條件下才產(chǎn)生子囊孢子菌落：乳白色，有光澤，邊沿整齊2、生長(zhǎng)與遺傳特征n兩個(gè)性別不同的單倍體細(xì)胞結(jié)合形成二倍體結(jié)合子或營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行芽殖。n能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖等。n生長(zhǎng)繁殖迅速，倍增期約2 hn釀酒酵母有17條染色體n1996年

8、完成其全基因組測(cè)序，遺傳背景相對(duì)清楚n基因組：120.68 Mbp，5887個(gè)ORF，編碼約6000個(gè)基因表達(dá)載體穿梭載體穿梭載體n含有復(fù)制起始序列或整合序列、選擇標(biāo)記以及由啟動(dòng)子、終止子和信號(hào)肽序列構(gòu)成的表達(dá)盒序列。n四種類型 YIp酵母整合載體 YCp酵母著絲粒載體 YRp酵母復(fù)制載體 YEp酵母附加載體n YIp酵母整合載體：選擇標(biāo)記和MCS，無(wú)自主復(fù)制序列，有整合序列。同源重組整合到酵母染色體，隨同染色體一起復(fù)制和遺傳。n YCp酵母著絲粒載體：著絲粒序列和自主復(fù)制序列。可自主復(fù)制，拷貝數(shù)很低，無(wú)選擇性，極易丟失，主要用于文庫(kù)構(gòu)建和基因克隆。n YRp酵母復(fù)制載體：酵母基因組DNA復(fù)制

9、序列，可獨(dú)立自主復(fù)制，轉(zhuǎn)化效率高。但存在分配不均一性，母細(xì)胞中遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于子細(xì)胞中。無(wú)選擇壓，容易丟失。常用于試驗(yàn)研究，很難工業(yè)化應(yīng)用。n YEp酵母附加載體：復(fù)制子，可自主復(fù)制，高拷貝，轉(zhuǎn)化頻率高。改造后，無(wú)需選擇壓就能高拷貝穩(wěn)定分配，在大規(guī)模無(wú)選擇培養(yǎng)中是非常有用的，用于過(guò)量表達(dá)外援基因。3、優(yōu)點(diǎn)與不足n載體：安全、無(wú)毒n營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇外來(lái)質(zhì)粒n培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)成熟n亞細(xì)胞器分化，進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后正確修飾和加工，并具有良好的蛋白質(zhì)分泌能力n缺點(diǎn)： 釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，制約了高密度發(fā)酵 修飾的蛋白質(zhì)糖基化側(cè)鏈過(guò)長(zhǎng)糖基化側(cè)鏈過(guò)長(zhǎng)，會(huì)引起副作用4、應(yīng)用n1981年，Nature，Hit

10、zeman等在酵母中表達(dá)人干擾素n激素類：67種人胰島素及1種突變體，尿酸水解酶和水蛭素 細(xì)胞因子：GM-CSF和血小板衍生生長(zhǎng)因子n多肽類：高血糖素n2種乙肝疫苗等5、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)Saccharomyces cerevisiae過(guò)去常用過(guò)去常用畢赤酵母畢赤酵母Pichia pastoris現(xiàn)在多用現(xiàn)在多用Pichia pastoris 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng) nPichia pastoris 是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作為唯一的碳源；n易操作，培養(yǎng)容易；n表達(dá)量高, 可達(dá)培養(yǎng)液中10 g/L；n可以有真核生物的翻譯后修飾，如糖基化；n避免了釀

11、酒酵母的過(guò)糖基化問(wèn)題。畢赤酵母具有高等真核表達(dá)系統(tǒng)的許多優(yōu)點(diǎn)：畢赤酵母具有高等真核表達(dá)系統(tǒng)的許多優(yōu)點(diǎn)：1. 蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等。2. 操作時(shí)與E.coli及釀酒酵母同樣簡(jiǎn)單。它比桿狀病毒或哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)等其它真核表達(dá)系統(tǒng)更快捷、簡(jiǎn)單、廉價(jià)，且表達(dá)水平更高。3. 同為酵母，畢赤酵母具有與釀酒酵母相似的分子及遺傳操作優(yōu)點(diǎn)，且它的外源蛋白表達(dá)水平是后者的十倍以至百倍。 這些使得畢赤酵母成為非常有用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。這些使得畢赤酵母成為非常有用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。 畢赤酵母系統(tǒng)的注意事項(xiàng)畢赤酵母系統(tǒng)的注意事項(xiàng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止污染；可以鏡檢溫度30C轉(zhuǎn)化PCR檢測(cè)5. 誘導(dǎo)時(shí)間蛋白質(zhì)糖基化n蛋白質(zhì)的糖基化是真核生物的一種常見(jiàn)的翻譯后修飾方式 ；n糖基化影響蛋白折疊、定位、轉(zhuǎn)運(yùn)、生物活性、可溶性、抗原性、半衰期。 酵母蛋白糖基化酵母蛋白糖基化n釀酒酵母與畢赤酵母大多數(shù)為N-連接糖基化高甘露糖型；n然而畢赤酵母中蛋白轉(zhuǎn)錄后所增加的寡糖鏈長(zhǎng)度（平均每個(gè)支鏈814 個(gè)甘露糖殘基