DNA甲基化和腫瘤的關(guān)系

1、DNA DNA 甲基化與腫瘤甲基化與腫瘤 一、一、DNADNA甲基化與基因表達(dá)甲基化與基因表達(dá)5-甲基胞嘧啶是天然存在的修飾堿基，甲基化的mCpG ，在DNA 雙鏈中對(duì)稱出現(xiàn)。哺乳類動(dòng)物基因組約60 %的表達(dá)基因5端啟動(dòng)子存在未被甲基化的CpG島,而啟動(dòng)子區(qū)域外的CpG島大都為mCpG。正常情況下，非活化的X染色體、印跡基因等的啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島為甲基化狀態(tài)，而看家基因的CpG島則是去甲基化狀態(tài)。DNA 甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。其調(diào)控作用主要在轉(zhuǎn)錄水平抑制基因表達(dá)。 經(jīng)過(guò)亞硫酸鹽處理后的DNA中胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ぃ═）,但是甲基化的中的CpG二核苷酸C未轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)，而無(wú)甲基化的C

2、pG二核苷酸則發(fā)生這種轉(zhuǎn)變，由此可以推斷DNA是否發(fā)生甲基化。DNA甲基化的檢測(cè)方法TATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTGCCCTTTAGTATTGTTTGGTGAAATGGTACGTGTTTATAATTTTAGTTATTTAGGAGGTTGAGGTAGGAGGATTTTTTGAGTTTAGGAGTTTAAGTTTAGTTTGGGTAATATAGTTTAGTGGTTATATTAAAAAAAGTAAAATAGTCGGGCGCGGTGGTTTACGTTTGTAATTTTAGTATTTTGGGAGG

3、TCGAGGCGGGTGGATTACGAGGTTAGGAGGTTGAGATTATTTTAAGGGCAATDNA 甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)的大溝為DNA 與多種轉(zhuǎn)錄因子的作用部位，mCpG的甲基化胞嘧啶突入大溝，抑制轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄。 mCpG激活阻遏蛋白因子，如DMAP1、TSG101、Mi2等，通過(guò)阻遏蛋白因子的作用抑制轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化與組蛋白乙?；难芯堪l(fā)現(xiàn)，組蛋白H3、H4 的賴氨酸去乙酰化后帶負(fù)電荷,與帶正電荷的DNA結(jié)合更緊密,不利于轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的聚合物解聚，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄。甲基化的CpG 結(jié)合蛋白(MeCPs) 與DNA

4、的mCpG結(jié)合,并與組氨酸去乙酰化酶(HDAC) 形成復(fù)合物共同抑制轉(zhuǎn)錄。二、二、DNADNA甲基化與腫瘤甲基化與腫瘤以往的研究認(rèn)為癌基因激活、抑癌基因失活主要是基因突變、缺失導(dǎo)致的DNA 序列改變。在腫瘤研究中，檢測(cè)到許多腫瘤的重要基因并未發(fā)生突變、缺失， 基因表達(dá)的異常主要通過(guò)DNA 甲基化實(shí)現(xiàn)。癌基因的去甲基化和抑癌基因的甲基化狀態(tài)，可導(dǎo)致癌基因激活、抑癌基因的失活。癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化改變是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特征。 DNA 甲基化狀態(tài)的改變導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)和功能的異常，與腫瘤發(fā)生的關(guān)系是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。 DNA DNA甲基化的異常與基因突變甲基化的異常與基因突變、缺失等基

5、因缺失等基因組異常也有密切的關(guān)系組異常也有密切的關(guān)系甲基化異?？赡芡ㄟ^(guò)以下途徑導(dǎo)致的基因不穩(wěn)定:DNA甲基化使基因突變率升高,5-甲基胞嘧啶可自發(fā)脫氨形成胸腺嘧啶,這一頻率高于胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏さ念l率,并常導(dǎo)致C T 突變。p53、Rb、c-H-ras-1基因中均發(fā)現(xiàn)該類型突變。啟動(dòng)子甲基化使一些重要的基因漸成失活,傾向基因不穩(wěn)定。腫瘤的一個(gè)重要特征是DNA啟動(dòng)子局部甲基化增強(qiáng)的同時(shí),基因組總甲基化水平卻低于正常細(xì)胞。 基因組總甲基化水平低也是基因不穩(wěn)定的原因之一。三、乳腺癌中基因的甲基化三、乳腺癌中基因的甲基化 1. 1. ERER基因基因ER的表達(dá)與否是乳腺癌激素治療的一個(gè)腫瘤標(biāo)記物。 E

6、R基因啟動(dòng)子和1號(hào)外顯子上分布有CpG島。乳腺癌中ER失表達(dá)是經(jīng)常性事件,約1/3的乳腺癌患者初診時(shí)ER表達(dá)陰性；相當(dāng)一部分的乳腺癌患者隨著腫瘤病情的進(jìn)展, ER由陽(yáng)性變成陰性。 基因組的改變, 在ER基因失表達(dá)中作用不大。近來(lái)的研究認(rèn)為, ER基因的甲基化異常是其失活的主要機(jī)制。q應(yīng)用Southern 印跡雜交及MS-PCR法研究,顯示在正常乳腺組織和ER表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞株,如MCF-7、T47-D、ZR75-1 均未檢測(cè)到啟動(dòng)子的高甲基化,而在原發(fā)性乳腺癌和許多ER陰性的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468、Hs578t 中,近50 %的ER啟動(dòng)子

7、高甲基化?？梢?jiàn),DNA甲基化在乳腺癌的ER基因失活中起著十分重要的作用。q一系列乳腺癌細(xì)胞株中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1 (DNMT1) 的活性水平檢測(cè)結(jié)果顯示, ER陰性的乳腺癌細(xì)胞株和ER 陽(yáng)性的比較， DNMT1的表達(dá)水平無(wú)論RNA 水平或是蛋白水平都顯著升高。ER陰性的乳腺癌DNMT1在整個(gè)細(xì)胞周期都表達(dá),ER陽(yáng)性的細(xì)胞株則DNMT1多數(shù)出現(xiàn)于S 期。2.2.PR PR 基因基因PR 基因1號(hào)外顯子上分布有CpG島。該基因編碼兩種同源性的蛋白質(zhì)hPRa和hPRb。二者的區(qū)別在于N-末端序列和生物活性。hPRb的轉(zhuǎn)錄需要ER激活,而hPRa不必。Southern印跡雜交及MS-PCR法分析PR表

8、達(dá)陰性的原發(fā)性乳腺癌及乳腺癌細(xì)胞株,約40%的PR基因啟動(dòng)子甲基化。應(yīng)用DNMT1抑制劑5-aza-Dc和雌激素作用于PR陰性的乳腺癌細(xì)胞株MSA-MB-231, PR基因啟動(dòng)子部分去甲基化且基因重新表達(dá)。3. 3. BRCA1基因 BRCA1 基因于1994年最早報(bào)道, 為具有遺傳傾向的乳腺癌、卵巢癌的易感基因,在乳腺癌中最主要的改變形式為等位基因雜合型缺失和突變。目前的研究認(rèn)為,在約50%的遺傳性乳腺癌中，BRCA1基因的可遺傳性突變是主要的分子機(jī)制。 散發(fā)性乳腺癌病例中,BRCA1基因突變罕見(jiàn)。DNA甲基化機(jī)制可以合理地解釋散發(fā)性乳腺癌的BRCA1基因轉(zhuǎn)錄與翻譯水平異常。應(yīng)用Southe

9、rn印跡和甲基化敏感特異單鏈構(gòu)象分析法(MS-SSCA法)分析散發(fā)性乳腺癌中BRCA1基因啟動(dòng)子甲基化情況,1124.2%的病例的BRCA1基因啟動(dòng)子高度甲基化。在散發(fā)型乳腺癌中,甲基化改變是BRCA1基因失表達(dá)的重要機(jī)制之一。 4.4.上皮鈣黏附蛋白( E-cadherin) 黏附分子的異常，使細(xì)胞和細(xì)胞間失去黏附作用，在腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵潤(rùn)中起關(guān)鍵作用。 E-cadherin是一種重要的鈣依賴性的黏附分子, 該蛋白在上皮細(xì)胞之間起著黏附及維持組織結(jié)構(gòu)完整性的作用。正常上皮中該蛋白在細(xì)胞邊緣區(qū)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),而在大多數(shù)腫瘤中表達(dá)異常。該蛋白的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。 基因的突變、缺失可以解

10、釋部分E-cadherin失表達(dá),但是在約50%的原發(fā)性乳腺癌和乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435中未檢測(cè)到基因的突變、缺失,應(yīng)用MS-PCR法卻發(fā)現(xiàn)E-cadherin基因5端CpG的高甲基化現(xiàn)象,表明E-cadherin基因啟動(dòng)子甲基化與該基因失活密切相關(guān)。乳腺原位導(dǎo)管癌中E-cadherin啟動(dòng)子30%甲基化,而轉(zhuǎn)移病灶上升到60% ,提示E-cadherin基因的甲基化情況與腫瘤的惡性程度相關(guān)。研究顯示口部鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的E-cadherin的低表達(dá)和甲基化有關(guān)。 5.5.P16INK4a/CDKN2A/MTSDNA 甲基化在抑癌基因失活中起著重要的作用。P16INK4a 編碼的蛋

11、白是細(xì)胞周期依賴性激酶4 的抑制物(CDKI4) ,通過(guò)Rb蛋白的磷酸化/去磷酸化作用調(diào)節(jié)細(xì)胞G1 S 期的轉(zhuǎn)化。該基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是P16INK4a與P19ARF 兩種蛋白。P16INK4a失活存在于大多數(shù)腫瘤中,但是乳腺癌中純合性缺失、點(diǎn)突變極低，分別為1.9%和1.0%。有20%30%的原發(fā)性乳腺癌及乳腺癌細(xì)胞株T47-D、HMECs、ZR75-1檢測(cè)到5端啟動(dòng)子和1號(hào)外顯子的甲基化情況。在40例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌占30%發(fā)生P16INK4a基因甲基化，與腫瘤分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。 6.候選抑癌基因脾酪氨酸激酶syk啟動(dòng)子甲基化與乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)系 在細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中,酪氨酸激酶起著很重要

12、的作用。syk在造血細(xì)胞上廣泛表達(dá), 作為信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中一個(gè)影響因子而被廣泛研究。B 細(xì)胞抗原受體(BcR)激活以后,依賴syk 的信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)B 細(xì)胞的克隆表達(dá), 分化和凋亡。磷脂酶C(PLC)-2 和磷脂酰肌醇3 激酶(PI3-K) 是syk 的關(guān)鍵靶位。B 細(xì)胞內(nèi)PLC-2 syk的磷酸化導(dǎo)致ERK 和JNK激酶活性的下降,相反,通過(guò)syk 介導(dǎo)Akt 激活可致PI3-K磷酸化。國(guó)外研究認(rèn)為syk,在T 細(xì)胞分化成熟過(guò)程中也起著很重要的作用采用。q syk 也可使微管的-微管蛋白亞基磷酸化,-微管蛋白亞基磷酸化有調(diào)節(jié)微管細(xì)胞骨架的功能,而微管細(xì)胞骨架是作為信號(hào)復(fù)合物裝配的基礎(chǔ)。qRT

13、-PCR和 MS-PCR檢測(cè)了40例乳腺癌組織癌旁組織及15 例乳腺纖維瘤組織中syk基因 mRNA 的表達(dá)及syk基因啟動(dòng)子甲基化情況。syk mRNA 在乳腺正常組織中可檢測(cè)到,而在乳腺癌組織中檢測(cè)率很低,兩組差異有顯著意義,這表明syk mRNA 的表達(dá)缺失可能與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。同時(shí)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織的syk mRNA 的檢出率顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,這表明syk mRNA 的表達(dá)缺失可能與乳腺癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。 研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了野生型syk 的乳腺癌細(xì)胞株有抑制乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。Okamura 等認(rèn)為Syk 基因的表達(dá)是p53 依賴性的。在腫瘤生成過(guò)程中，p53的功能喪失會(huì)

14、導(dǎo)致syk 的活性下降,從而使腫瘤易于生成和轉(zhuǎn)移。Carter 等認(rèn)為syk 與HER2/ neu 是一對(duì)功能相反的抑癌/癌基因，HER2/ neu 的過(guò)度表達(dá)可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的收縮，從而使腫瘤細(xì)胞易于穿過(guò)血管屏障發(fā)生轉(zhuǎn)移，而syk 可抑制HER2/ neu 的收縮血管內(nèi)皮細(xì)胞作用，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。Mahabeleshwar 等研究認(rèn)為，syk通過(guò)抑制磷脂酰肌醇3 (PI-3) 激酶的活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的分裂和核因子NF-B 調(diào)節(jié)的尿激酶型纖溶酶激活物(u-PA) 的激活分泌,而u-PA 的激活分泌與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)。 7. 乳腺癌Nm23-H1 轉(zhuǎn)移抑制基因 Nm

15、23-H1基因的啟動(dòng)子有2個(gè) CpG島。DNA 甲基化抑制劑 5-Aza-CdR，使11個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中5個(gè)細(xì)胞系的Nm23-H1 表達(dá)升高，其中3個(gè)有轉(zhuǎn)移能力。 Nm23-H1表達(dá)升高的同時(shí)細(xì)胞系體外轉(zhuǎn)移能力下降。8. 8. hDAB2IP hDAB2IP （人（人DOC-2/DAB2 interactive protein DOC-2/DAB2 interactive protein ）hDAB2IPhDAB2IP 腫瘤抑制基因是腫瘤抑制基因是 Ras GTPaseRas GTPase活化家族的新活化家族的新成員。成員。乳腺癌、前列腺癌中，乳腺癌、前列腺癌中，hDAB2IPhDAB2IP

16、甲基化率高，與表達(dá)甲基化率高，與表達(dá)負(fù)相關(guān)，甲基化狀態(tài)在負(fù)相關(guān)，甲基化狀態(tài)在 hDAB2IPhDAB2IP 基因失活中起關(guān)鍵基因失活中起關(guān)鍵作用。作用。 5-aza-2-deoxycytidine5-aza-2-deoxycytidine處理處理 后，基因表達(dá)恢后，基因表達(dá)恢復(fù)。復(fù)。hDAB2IP hDAB2IP 的啟動(dòng)子區(qū)分成的啟動(dòng)子區(qū)分成m2a m2a 和和 m2bm2b。 m2a m2a區(qū)甲基化異常：區(qū)甲基化異常：2525個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中，有個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中，有1111個(gè)，個(gè)，占占44%44%。3939個(gè)原發(fā)乳腺癌中有個(gè)原發(fā)乳腺癌中有1515個(gè)，占個(gè)，占 38%38%； m2b m2b區(qū)

17、區(qū)甲基化異常：甲基化異常：2525個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中，有個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中，有1212 個(gè)，占個(gè)，占48%48%。3939個(gè)原發(fā)乳腺癌中有個(gè)原發(fā)乳腺癌中有1313個(gè)，占個(gè)，占 33%33%。 m2bm2b區(qū)甲基化異區(qū)甲基化異常和乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)常和乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān) 。9.9.其它基因的甲基化 14-3-3基因PHME1(human mammary epithelial 1) 、RAR2 基因(即視黃酸受體基因) 等許多關(guān)鍵的抑癌基因和生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)基因的研究都肯定了DNA 甲基化異常是基因失活的重要機(jī)制。這些基因的表達(dá)蛋白產(chǎn)物涵蓋了諸如DNA 修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞間黏附等各

18、環(huán)節(jié)。 Cyclin D2Cyclin D2, , RARRAR-, -, TwistTwist, , RASSF1ARASSF1A, , HIN-1HIN-1 在乳腺原發(fā)癌及其淋巴結(jié)(25例)、骨（12例）、腦（8例）、肺轉(zhuǎn)移（10例）的配對(duì)標(biāo)本中檢測(cè)Cyclin D2, RAR-, Twist, RASSF1A, 和HIN-1 基因的高甲基化情況。與原發(fā)癌相比，轉(zhuǎn)移癌均有甲基化率高的趨勢(shì)，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌HIN-1 的甲基化狀況有顯著差異，骨、腦、肺轉(zhuǎn)移癌HIN-1 和 RAR-有顯著差異。轉(zhuǎn)移癌中，上述基因的低表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化相關(guān)。甲基化率高的轉(zhuǎn)移癌對(duì)甲基化抑制劑和組蛋白去已酰酶抑制劑治療敏感。RASSF1ARASSF1A, , APC APC, , DAP-kinaseDAP-kinaseRAS association domain family protein 1A (RASSF1A), adenomatous polyposis coli (APC), death-associated protein kinase (DAP-kinase) 在原發(fā)導(dǎo)管癌和小葉癌及不同階段和等級(jí)的侵潤(rùn)癌中， RASSF1A, APC, DAP-kinase 的高甲基化34例標(biāo)本中，32例有一個(gè)或多個(gè)基因高甲基化，占94%。 RASSF1A 高甲基化22