《生物制藥》酶類藥物1

1、關(guān)于酶，你已經(jīng)知道了哪些知識(shí)？還想知道哪些知識(shí)？酶的分類酶的分類酶單純蛋白質(zhì)（多種氨基酸組成）結(jié)合蛋白質(zhì)酶蛋白（蛋白部分） 輔酶或輔基（非蛋白部分）金屬：如Cu2、Mn2金屬有機(jī)物：如鐵樸啉不含金屬的有機(jī)物如：煙酰胺、VB2等的衍生物酶胞外酶胞內(nèi)酶游離酶結(jié)合酶“綠色健康，綠色健康，“酶酶”力無限力無限醫(yī)藥、洗滌劑、紡織、淀粉制糖、發(fā)酵、酒精、食品（包括果蔬汁、啤酒釀造、谷物食品、蛋白水解、和功能食品以及食用油脂）、飼料、皮革、造紙和化工等工業(yè)領(lǐng)域 淀粉酶類與淀粉糖業(yè)淀粉酶類與淀粉糖業(yè)果汁生產(chǎn)與果膠酶乳制品與凝乳酶酶蛋白成為藥物應(yīng)具備的條件酶蛋白成為藥物應(yīng)具備的條件 在生理在生理pHpH下下,

2、,具有最高活性和穩(wěn)定性具有最高活性和穩(wěn)定性 對(duì)基質(zhì)具有較高親和力對(duì)基質(zhì)具有較高親和力( (低低KmKm值值) ) 血清中半衰期較長(zhǎng)血清中半衰期較長(zhǎng) 純度高純度高 免疫原性低或無免疫原性免疫原性低或無免疫原性 不需要外源輔助因子不需要外源輔助因子酶類藥物在疾病治療方面的應(yīng)用酶類藥物在疾病治療方面的應(yīng)用酶酶 名名來來 源源用用 途途淀粉酶淀粉酶胰臟、麥芽、微生物胰臟、麥芽、微生物治療消化不良，食欲不振治療消化不良，食欲不振蛋白酶蛋白酶胰臟、胃、植物、微生物胰臟、胃、植物、微生物治療消化不良，食欲不振，消炎，消腫，創(chuàng)愈，降壓治療消化不良，食欲不振，消炎，消腫，創(chuàng)愈，降壓脂肪酶脂肪酶胰臟、微生物胰臟、

3、微生物治療消化不良，食欲不振治療消化不良，食欲不振纖維素酶纖維素酶霉菌霉菌治療消化不良，食欲不振治療消化不良，食欲不振溶菌酶溶菌酶蛋清、細(xì)菌蛋清、細(xì)菌治療各種細(xì)菌性和病毒性疾病治療各種細(xì)菌性和病毒性疾病尿激酶尿激酶人尿人尿治療心肌梗塞，結(jié)膜下出血，黃斑部出血治療心肌梗塞，結(jié)膜下出血，黃斑部出血鏈激酶鏈激酶鏈球菌鏈球菌治療血栓性靜脈炎，咳痰，血腫，下出血，骨折治療血栓性靜脈炎，咳痰，血腫，下出血，骨折青霉素酶青霉素酶蠟狀芽孢桿菌蠟狀芽孢桿菌治療青霉素引起的變態(tài)反應(yīng)治療青霉素引起的變態(tài)反應(yīng)L-L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶大腸桿菌大腸桿菌治療白血病治療白血病超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶微生物，植物，動(dòng)物

4、微生物，植物，動(dòng)物預(yù)防輻射損傷，治療紅斑狼瘡，皮肌炎，結(jié)腸炎預(yù)防輻射損傷，治療紅斑狼瘡，皮肌炎，結(jié)腸炎凝血酶凝血酶動(dòng)物，蛇，細(xì)菌，酵母等動(dòng)物，蛇，細(xì)菌，酵母等治療各種出血病治療各種出血病膠原酶膠原酶細(xì)菌細(xì)菌分解膠原，消炎，化膿，脫痂，治療潰瘍分解膠原，消炎，化膿，脫痂，治療潰瘍右旋糖酐酶右旋糖酐酶微生物微生物預(yù)防齲齒預(yù)防齲齒 膽堿酯酶膽堿酯酶細(xì)菌細(xì)菌治療皮膚病，支氣管炎，氣喘治療皮膚病，支氣管炎，氣喘溶纖酶溶纖酶蚯蚓蚯蚓溶血栓溶血栓彈性蛋白酶彈性蛋白酶胰臟胰臟治療動(dòng)脈硬化，降血脂治療動(dòng)脈硬化，降血脂核糖核酸酶核糖核酸酶胰臟胰臟抗感染，祛痰，治肝癌抗感染，祛痰，治肝癌尿酸酶尿酸酶牛腎牛腎治療痛風(fēng)

5、治療痛風(fēng)栓溶酶類與心血管疾病栓溶酶類與心血管疾病凝血酶凝血酶健美生消化酶健美生消化酶幫助腸胃蠕動(dòng)幫助腸胃蠕動(dòng)【產(chǎn)品規(guī)格產(chǎn)品規(guī)格】90片瓶片瓶【食用方法食用方法】成人每日成人每日3片，隨主餐片，隨主餐服用服用【成分成分(每片含每片含)】1)消化蛋白質(zhì)：木瓜蛋白酶消化蛋白質(zhì)：木瓜蛋白酶50毫克、毫克、菠蘿蛋白酶菠蘿蛋白酶30毫克；毫克；2)消化脂肪：脂肪酶消化脂肪：脂肪酶30毫克；毫克；3)消化碳水化合物消化碳水化合物/淀粉：淀粉酶淀粉：淀粉酶50毫克；毫克；4)消化乳制品：乳糖酶消化乳制品：乳糖酶30毫克；毫克；5)消化纖維：纖維素酶消化纖維：纖維素酶15毫克。毫克。另含：能抑制過多胃酸的葡萄糖

6、酸另含：能抑制過多胃酸的葡萄糖酸鈣，能緩解反胃薄荷葉和茴香鈣，能緩解反胃薄荷葉和茴香【適用人群適用人群】消化不良者消化不良者腸胃疾病患者腸胃疾病患者大病初愈者大病初愈者消化酶類消化酶類第二節(jié)第二節(jié) 酶類藥物的制造過程酶類藥物的制造過程 一、原料的選擇一、原料的選擇 1. 不同酶的用料選擇不同酶的用料選擇 乙酰化酶（鴿肝）、凝血酶乙?；福澑危?、凝血酶(牛牛血）、透明質(zhì)酸酶（羊睪丸）、溶菌酶血）、透明質(zhì)酸酶（羊睪丸）、溶菌酶（雞蛋清），超氧化物歧化酶（血、肝）（雞蛋清），超氧化物歧化酶（血、肝） 2. 注意不同生長(zhǎng)發(fā)育情況及營(yíng)養(yǎng)狀況注意不同生長(zhǎng)發(fā)育情況及營(yíng)養(yǎng)狀況 3. 原料來源豐富原料來源豐富

7、 4. 從簡(jiǎn)化提純步驟著手從簡(jiǎn)化提純步驟著手 5. 如用動(dòng)物組織作原料，應(yīng)在此動(dòng)物宰如用動(dòng)物組織作原料，應(yīng)在此動(dòng)物宰殺后立即取材。殺后立即取材。二、微生物酶制劑高產(chǎn)菌株的選育二、微生物酶制劑高產(chǎn)菌株的選育 菌種是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑的重要條件。優(yōu)良菌種是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑的重要條件。優(yōu)良菌種不僅可以提高酶制劑產(chǎn)量和發(fā)酵原料的利菌種不僅可以提高酶制劑產(chǎn)量和發(fā)酵原料的利用率，而且還與增加品種，縮短生產(chǎn)周期，改用率，而且還與增加品種，縮短生產(chǎn)周期，改進(jìn)發(fā)酵和提煉工藝條件等密切相關(guān)。進(jìn)發(fā)酵和提煉工藝條件等密切相關(guān)。 優(yōu)良菌種獲得的三種途徑：優(yōu)良菌種獲得的三種途徑：（1）從自然界分離篩選）從自然界分離篩選

8、;（2）用物理或化學(xué)的方法處理，誘變）用物理或化學(xué)的方法處理，誘變;（3）用基因重組與細(xì)胞融合技術(shù)。）用基因重組與細(xì)胞融合技術(shù)。三、微生物酶制劑生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù)三、微生物酶制劑生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù) （一）培養(yǎng)基（一）培養(yǎng)基 1. 碳源（甘薯、玉米、麩皮、米糠）碳源（甘薯、玉米、麩皮、米糠） 2. 氮源氮源 （豆餅、花生餅、菜籽餅、硫酸（豆餅、花生餅、菜籽餅、硫酸銨、尿素）銨、尿素） 3. 無機(jī)鹽無機(jī)鹽 4. 生長(zhǎng)因子和產(chǎn)酶促進(jìn)劑生長(zhǎng)因子和產(chǎn)酶促進(jìn)劑（二）培養(yǎng)方法（二）培養(yǎng)方法 1. 固體培養(yǎng)法固體培養(yǎng)法 固體培養(yǎng)法也稱麩曲培養(yǎng)法，該法是利用麩皮固體培養(yǎng)法也稱麩曲培養(yǎng)法，該法是利用麩皮或米糠為主要原料，

9、另外視需要添加其它谷糠、豆或米糠為主要原料，另外視需要添加其它谷糠、豆餅等，加水拌成含水適度半固態(tài)物料作為培養(yǎng)基。餅等，加水拌成含水適度半固態(tài)物料作為培養(yǎng)基。 2.液體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)法 液體培養(yǎng)法是利用液體培養(yǎng)進(jìn)行微生物的生長(zhǎng)液體培養(yǎng)法是利用液體培養(yǎng)進(jìn)行微生物的生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶。根據(jù)通氣方法的不同，又分為液體表繁殖和產(chǎn)酶。根據(jù)通氣方法的不同，又分為液體表面培養(yǎng)和液體深層培養(yǎng)。深層通氣培養(yǎng)是目前應(yīng)用面培養(yǎng)和液體深層培養(yǎng)。深層通氣培養(yǎng)是目前應(yīng)用最廣的方法。最廣的方法。 3.影響酶產(chǎn)生的一些因素影響酶產(chǎn)生的一些因素 除培養(yǎng)基，發(fā)酵工藝參數(shù)對(duì)產(chǎn)酶的除培養(yǎng)基，發(fā)酵工藝參數(shù)對(duì)產(chǎn)酶的影響也十分明顯。影響也十分

10、明顯。 (1) 溫度溫度 (2) pH (3) 通氣通氣 (4) 攪拌攪拌 (5)泡沫泡沫 發(fā)酵過程中，由于發(fā)酵液受到強(qiáng)烈發(fā)酵過程中，由于發(fā)酵液受到強(qiáng)烈的通氣攪拌，培養(yǎng)基中某些成分的變化及的通氣攪拌，培養(yǎng)基中某些成分的變化及代謝中產(chǎn)生氣體，會(huì)形成較多的泡沫，而代謝中產(chǎn)生氣體，會(huì)形成較多的泡沫，而且氣泡不易消失，是由于培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)且氣泡不易消失，是由于培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)分子排在氣泡表面形成一層吸附膜，聚集分子排在氣泡表面形成一層吸附膜，聚集成泡沫層之故。成泡沫層之故。 消泡劑：天然油類，醇類，脂肪酸類，消泡劑：天然油類，醇類，脂肪酸類，胺類，酰胺類，磷酸酯類，金屬皂類，聚胺類，酰胺類，磷酸酯類，金

11、屬皂類，聚硅氧烷等。硅氧烷等。 (6) 添加誘導(dǎo)劑和抑制劑添加誘導(dǎo)劑和抑制劑 誘導(dǎo)酶誘導(dǎo)酶 抑制劑（表面活性劑）抑制劑（表面活性劑）四、酶類藥物的提取和純化四、酶類藥物的提取和純化 原料選擇原料選擇生物材料的預(yù)處理生物材料的預(yù)處理提取提取濃縮濃縮純化純化結(jié)晶結(jié)晶1. 動(dòng)物材料的預(yù)處理：動(dòng)物材料的預(yù)處理：（1）機(jī)械法：）機(jī)械法：有絞碎、刨碎、勻漿、研磨、超聲波、擠壓等有絞碎、刨碎、勻漿、研磨、超聲波、擠壓等方法。有些酶用機(jī)械法處理后仍不能有效的提取，可結(jié)合其他方法。有些酶用機(jī)械法處理后仍不能有效的提取，可結(jié)合其他處理法。處理法。（2）凍融：）凍融：冷到冷到-10左右，再緩慢溶解至室溫，如此反復(fù)左

12、右，再緩慢溶解至室溫，如此反復(fù)多次。由于細(xì)胞中冰晶的形成，及剩下液體中鹽濃度的增高，多次。由于細(xì)胞中冰晶的形成，及剩下液體中鹽濃度的增高，能使細(xì)胞中顆粒及整個(gè)細(xì)胞破碎，使酶釋放出來。能使細(xì)胞中顆粒及整個(gè)細(xì)胞破碎，使酶釋放出來。（3）丙酮粉：）丙酮粉：組織經(jīng)丙酮迅速脫水干燥制成丙酮粉，不僅可組織經(jīng)丙酮迅速脫水干燥制成丙酮粉，不僅可以減少酶的變性，同時(shí)因細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的破碎使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)以減少酶的變性，同時(shí)因細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的破碎使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合的某些化學(xué)鍵打開，促使某些結(jié)酶釋放到溶液中。結(jié)合的某些化學(xué)鍵打開，促使某些結(jié)酶釋放到溶液中。材料的預(yù)處理材料的預(yù)處理酶胞外酶胞內(nèi)酶游離酶結(jié)合酶 2. 微生物材

13、料的預(yù)處理微生物材料的預(yù)處理 胞外酶胞外酶:除去菌體后再直接從發(fā)酵液除去菌體后再直接從發(fā)酵液中吸附提取酶。中吸附提取酶。 胞內(nèi)酶胞內(nèi)酶:將菌體細(xì)胞破壁，制成無細(xì)將菌體細(xì)胞破壁，制成無細(xì)胞的懸浮液后再行提取。胞的懸浮液后再行提取。1.干燥法干燥法:干燥后菌體產(chǎn)生自溶干燥后菌體產(chǎn)生自溶（1）空氣干燥）空氣干燥:適用于熱穩(wěn)定的酶適用于熱穩(wěn)定的酶（2）真空干燥）真空干燥:適于細(xì)菌適于細(xì)菌（3）冷凍干燥）冷凍干燥:適用于較敏感的酶適用于較敏感的酶2.機(jī)械法機(jī)械法（1）研磨法）研磨法（2）組織勻漿法）組織勻漿法（3）超聲波法）超聲波法（4）高壓勻漿法）高壓勻漿法3.酶法處理酶法處理 (二二) 酶的提取酶的

14、提取1.水溶液法水溶液法 常用稀鹽溶液或緩沖液提取。經(jīng)過預(yù)處理常用稀鹽溶液或緩沖液提取。經(jīng)過預(yù)處理的原料，包括組織糜，勻漿，細(xì)胞顆粒以及丙的原料，包括組織糜，勻漿，細(xì)胞顆粒以及丙酮粉等，都可以用水溶液抽提。酮粉等，都可以用水溶液抽提。 許多酶再蒸餾水中不溶解，而在低鹽濃度許多酶再蒸餾水中不溶解，而在低鹽濃度下易溶解，所以提取時(shí)加入少量鹽可提高酶的下易溶解，所以提取時(shí)加入少量鹽可提高酶的溶解度。溶解度。 2.有機(jī)溶劑法有機(jī)溶劑法 某些結(jié)合酶如微粒體和線粒體膜的酶，由某些結(jié)合酶如微粒體和線粒體膜的酶，由于和脂質(zhì)牢固結(jié)合，用水很難提取，為此必須于和脂質(zhì)牢固結(jié)合，用水很難提取，為此必須除去結(jié)合的脂質(zhì)，

15、且不能使酶變性，最常用的除去結(jié)合的脂質(zhì)，且不能使酶變性，最常用的有機(jī)溶劑是丁醇。有機(jī)溶劑是丁醇。 丁醇具有以下特點(diǎn)丁醇具有以下特點(diǎn)：（：（1）親脂性強(qiáng)，特）親脂性強(qiáng)，特別是親磷脂的能力；（別是親磷脂的能力；（2)兼具親水性，在兼具親水性，在0在水中的溶解度為在水中的溶解度為10.5%；（；（3）在脂與水分）在脂與水分子間能起類似去垢劑的橋梁作用。子間能起類似去垢劑的橋梁作用。 3.表面活性劑法表面活性劑法(三三) 酶制劑的工業(yè)提取法酶制劑的工業(yè)提取法 1. 發(fā)酵液的預(yù)處理及過濾發(fā)酵液的預(yù)處理及過濾 絮凝劑絮凝劑 2. 酶液的脫色酶液的脫色 0.11.5%活性炭活性炭 3. 鹽析法鹽析法 4.

16、有機(jī)溶劑法有機(jī)溶劑法 5. 噴霧干燥直接制備粉末酶制劑噴霧干燥直接制備粉末酶制劑酶的分離提純?nèi)齻€(gè)基本環(huán)節(jié)：酶的分離提純?nèi)齻€(gè)基本環(huán)節(jié)：p第一抽提，即把酶從材料轉(zhuǎn)入溶劑中制成酶溶液；第一抽提，即把酶從材料轉(zhuǎn)入溶劑中制成酶溶液； p第二純化，即把雜質(zhì)從酶溶液中除掉或從酶溶液中第二純化，即把雜質(zhì)從酶溶液中除掉或從酶溶液中把酶分離出來；把酶分離出來；p第三制劑，即將酶制成各種劑型。第三制劑，即將酶制成各種劑型。在酶的分離純化過程中每步都須做三件事：在酶的分離純化過程中每步都須做三件事：p第一，測(cè)定酶活力第一，測(cè)定酶活力(IU/m1)；p第二，測(cè)定蛋白質(zhì)含量第二，測(cè)定蛋白質(zhì)含量(mg/m1)；p第三，測(cè)量

17、體積第三，測(cè)量體積(m1)。 酶是生物活性物質(zhì)，操作條件要溫和，一般酶是生物活性物質(zhì)，操作條件要溫和，一般在在0 055間進(jìn)行。間進(jìn)行。 初分：用分離蛋白質(zhì)的方法，如鹽析、等電初分：用分離蛋白質(zhì)的方法，如鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑分級(jí)、選擇性熱變性等方點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑分級(jí)、選擇性熱變性等方法可從酶粗提液中初步分離酶。法可從酶粗提液中初步分離酶。 細(xì)分：再采用吸附層析、離子交換層析、凝細(xì)分：再采用吸附層析、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析、疏水層析及高效液相色膠過濾、親和層析、疏水層析及高效液相色譜法等層析技術(shù)或各種制備電泳技術(shù)進(jìn)一步譜法等層析技術(shù)或各種制備電泳技術(shù)進(jìn)一步純化酶，以得到純的酶制品

18、純化酶，以得到純的酶制品 結(jié)晶結(jié)晶: :酶的結(jié)晶過程進(jìn)行得很慢，需要數(shù)天或酶的結(jié)晶過程進(jìn)行得很慢，需要數(shù)天或數(shù)星期。數(shù)星期。凡用于蛋白質(zhì)的純化手段均適用于酶的純化凡用于蛋白質(zhì)的純化手段均適用于酶的純化(四四) 酶的純化酶的純化(一一) 雜質(zhì)的除去雜質(zhì)的除去 酶提取液中，除所需酶外，還含有大量雜蛋白，酶提取液中，除所需酶外，還含有大量雜蛋白，多糖，脂類和核酸等，需要除去。多糖，脂類和核酸等，需要除去。（1）pH和加熱沉淀法和加熱沉淀法 利用蛋白質(zhì)酸堿變性性質(zhì)的差異可以通過利用蛋白質(zhì)酸堿變性性質(zhì)的差異可以通過調(diào)調(diào)pH和等電點(diǎn)除去某些雜蛋白，也可以利用不和等電點(diǎn)除去某些雜蛋白，也可以利用不同蛋白質(zhì)對(duì)

19、熱穩(wěn)定性的差異。（同蛋白質(zhì)對(duì)熱穩(wěn)定性的差異。（SOD酶）酶）（2）蛋白質(zhì)表面變性法）蛋白質(zhì)表面變性法 利用蛋白質(zhì)表面變性性質(zhì)的差別，也可以利用蛋白質(zhì)表面變性性質(zhì)的差別，也可以除去雜蛋白。除去雜蛋白。 制備過氧化氫酶，加入氯仿除雜蛋白。制備過氧化氫酶，加入氯仿除雜蛋白。 (3) 選擇性變性法選擇性變性法 利用蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的不同，除去雜蛋白。利用蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的不同，除去雜蛋白。 (4) 核酸沉淀劑法核酸沉淀劑法 在微生物制備酶時(shí)，常含有較多核酸，在微生物制備酶時(shí)，常含有較多核酸，可用核酸酶降解，離心分離，用核酸沉淀劑如可用核酸酶降解，離心分離，用核酸沉淀劑如三甲基十六烷基溴化銨，硫酸鏈霉素等。三甲

20、基十六烷基溴化銨，硫酸鏈霉素等。 (5) 將酶與底物結(jié)合，用加熱法除去雜蛋白。將酶與底物結(jié)合，用加熱法除去雜蛋白。 近來發(fā)現(xiàn)，酶和底物結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)性抑制近來發(fā)現(xiàn)，酶和底物結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑結(jié)合后，穩(wěn)定性大大提高，這樣可以用加熱劑結(jié)合后，穩(wěn)定性大大提高，這樣可以用加熱法除去雜蛋白。法除去雜蛋白。酶分離方法有：酶分離方法有：p分子大小分子大小: 如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過濾法等。濾法等。p溶解度大小溶解度大小: 如鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、共沉如鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法等。淀法、選擇性沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法等。p所帶正負(fù)電荷所帶正

21、負(fù)電荷: 如離子交換分離法、電泳分離法、如離子交換分離法、電泳分離法、聚焦層析法等。聚焦層析法等。p穩(wěn)定性差異穩(wěn)定性差異: 如選擇性熱變性法、表面變性法等如選擇性熱變性法、表面變性法等p親和作用的差異親和作用的差異: 如親和層析法等如親和層析法等.1. 凝膠過濾法凝膠過濾法(分子篩分子篩)2. 離子交換法離子交換法T離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度蛋白濃度蛋白濃度T+ 帶負(fù)電荷帶負(fù)電荷 的被吸附上的被吸附上帶負(fù)電荷少帶負(fù)電荷少的先被置換的先被置換帶負(fù)電荷多帶負(fù)電荷多的后被置換的后被置換連續(xù)梯度洗脫連續(xù)梯度洗脫:3. 親和層析法親和層析法 表表 些互為配基的物質(zhì)。些互為配基的物質(zhì)。 2.酶的濃縮酶的濃縮:（1）

22、工業(yè)上：）工業(yè)上：超濾、真空減壓濃縮、薄膜濃縮、冷凍超濾、真空減壓濃縮、薄膜濃縮、冷凍濃縮、離子交換法、濃縮、離子交換法、（2）實(shí)驗(yàn)室：）實(shí)驗(yàn)室： 除上述方法外，對(duì)少量樣品可用下列方法除上述方法外，對(duì)少量樣品可用下列方法 1. 用用G-15或或G-25濃縮濃縮 2. 用聚乙二醇用聚乙二醇(PEG)濃縮濃縮 3. 凝膠吸水凝膠吸水（二）脫鹽和濃縮（二）脫鹽和濃縮 1. 脫鹽脫鹽 （1）透析）透析 玻璃紙袋玻璃紙袋（2）凝膠過濾）凝膠過濾 Sephadex G10 (3) 復(fù)合結(jié)晶法復(fù)合結(jié)晶法 有時(shí)可以利用某些酶與有機(jī)化合物或有時(shí)可以利用某些酶與有機(jī)化合物或金屬離子形成復(fù)合物或成鹽的性質(zhì)來結(jié)晶。金

23、屬離子形成復(fù)合物或成鹽的性質(zhì)來結(jié)晶。 (4) 透析平衡透析平衡 利用透析平衡進(jìn)行結(jié)晶也是常用方法利用透析平衡進(jìn)行結(jié)晶也是常用方法之一。之一。 (5) 等電點(diǎn)法等電點(diǎn)法(三三)酶的結(jié)晶酶的結(jié)晶 特征：特征：有序性，對(duì)稱排列，周期性的重復(fù)結(jié)構(gòu)有序性，對(duì)稱排列，周期性的重復(fù)結(jié)構(gòu) 為空間結(jié)構(gòu)研究提供為空間結(jié)構(gòu)研究提供x-衍射樣品衍射樣品既是純化的結(jié)果又是純化的手段既是純化的結(jié)果又是純化的手段 把酶提純到一定純度以后，可使其結(jié)晶。把酶提純到一定純度以后，可使其結(jié)晶。 蛋白質(zhì)分子多數(shù)處于含水的環(huán)境中，蛋白質(zhì)分蛋白質(zhì)分子多數(shù)處于含水的環(huán)境中，蛋白質(zhì)分子與水分子結(jié)晶形成穩(wěn)定的水合物。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)子與水分子結(jié)晶形成

24、穩(wěn)定的水合物。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的濃度非常高的時(shí)候，溶液中沒有足夠可以與的濃度非常高的時(shí)候，溶液中沒有足夠可以與蛋白質(zhì)結(jié)合的水分子用于形成水合物，在蛋白蛋白質(zhì)結(jié)合的水分子用于形成水合物，在蛋白質(zhì)分子之間也沒有足夠的水分子可以將它們充質(zhì)分子之間也沒有足夠的水分子可以將它們充分隔開，于是蛋白質(zhì)就以無定形沉淀或結(jié)晶的分隔開，于是蛋白質(zhì)就以無定形沉淀或結(jié)晶的形式從溶液中析出。形式從溶液中析出。2.2.結(jié)晶的條件選擇結(jié)晶的條件選擇酶的純度酶的純度酶的濃度酶的濃度金屬離子金屬離子pH溫度、時(shí)間溫度、時(shí)間晶種晶種酶蛋白結(jié)晶的基本條件酶蛋白結(jié)晶的基本條件: (1) 酶的純度酶的純度 酶只有達(dá)到相當(dāng)純度后才能結(jié)晶。酶的純

25、度酶只有達(dá)到相當(dāng)純度后才能結(jié)晶。酶的純度越高，結(jié)晶越容易，長(zhǎng)成大的結(jié)晶可能性也越大。越高，結(jié)晶越容易，長(zhǎng)成大的結(jié)晶可能性也越大。 (2) 酶的濃度酶的濃度 結(jié)晶母液盡可能保持高的濃度。酶的濃度越結(jié)晶母液盡可能保持高的濃度。酶的濃度越高越有利于溶液中溶質(zhì)分子間的相互碰撞聚合，高越有利于溶液中溶質(zhì)分子間的相互碰撞聚合，形成結(jié)晶的機(jī)會(huì)也越大。形成結(jié)晶的機(jī)會(huì)也越大。 (3) 溫度溫度 (4) 時(shí)間時(shí)間 (5) pH 有時(shí)相差有時(shí)相差0.2pH，只能達(dá)到沉淀，而不能達(dá)，只能達(dá)到沉淀，而不能達(dá)到晶體。到晶體。 (6) 金屬離子金屬離子 許多金屬離子能引起或有助于酶的結(jié)晶。許多金屬離子能引起或有助于酶的結(jié)晶

26、。 (7) 晶種晶種 (8) 結(jié)晶器皿處理。結(jié)晶器皿處理。酶的結(jié)晶方法酶的結(jié)晶方法 (1) 鹽析法鹽析法 在適當(dāng)?shù)脑谶m當(dāng)?shù)膒H、溫度等條件下，保持酶的穩(wěn)定、溫度等條件下，保持酶的穩(wěn)定性，慢慢改變鹽濃度進(jìn)行結(jié)晶。結(jié)晶時(shí)采用的鹽性，慢慢改變鹽濃度進(jìn)行結(jié)晶。結(jié)晶時(shí)采用的鹽有硫酸銨，檸檬酸鈉，乙酸銨，硫酸鎂等。利用有硫酸銨，檸檬酸鈉，乙酸銨，硫酸鎂等。利用硫酸銨結(jié)晶時(shí)一般是把鹽加入到一個(gè)比較濃的酶硫酸銨結(jié)晶時(shí)一般是把鹽加入到一個(gè)比較濃的酶溶液中，并使溶液微呈渾濁為止。然后放置，并溶液中，并使溶液微呈渾濁為止。然后放置，并且非常緩慢地增加鹽濃度。操作要在低溫下進(jìn)行，且非常緩慢地增加鹽濃度。操作要在低溫下

27、進(jìn)行，緩沖液緩沖液pH要接近酶的等電點(diǎn)。要接近酶的等電點(diǎn)。 (2) 有機(jī)溶劑法有機(jī)溶劑法 酶液中滴加有機(jī)溶劑，有時(shí)也能使酶形成結(jié)酶液中滴加有機(jī)溶劑，有時(shí)也能使酶形成結(jié)晶。結(jié)晶用溶劑有：乙醇，丙醇，丁醇，乙腈，晶。結(jié)晶用溶劑有：乙醇，丙醇，丁醇，乙腈，異丙醇，二惡烷，二甲亞砜，二氧雜環(huán)已烷。異丙醇，二惡烷，二甲亞砜，二氧雜環(huán)已烷。 (3) 復(fù)合結(jié)晶法復(fù)合結(jié)晶法 (4) 透析平衡法透析平衡法 (5) 等電點(diǎn)法等電點(diǎn)法 p通常將純化后的酶溶液經(jīng)透析除鹽后冷凍干燥得通常將純化后的酶溶液經(jīng)透析除鹽后冷凍干燥得到酶粉，低溫下可較長(zhǎng)時(shí)期保存。到酶粉，低溫下可較長(zhǎng)時(shí)期保存。p也可將酶溶液制成也可將酶溶液制成2

28、525甘油或甘油或5050甘油分別貯甘油分別貯于于2525或或5050冰箱中保存。冰箱中保存。p注意：酶溶液濃度越低越易變性，因此切記不能注意：酶溶液濃度越低越易變性，因此切記不能保存酶的稀溶液。保存酶的稀溶液。 酶的分離純化工作中的注意事項(xiàng)酶的分離純化工作中的注意事項(xiàng)1. 1. 防止酶蛋白變性防止酶蛋白變性2. 2. 防止輔因子丟失防止輔因子丟失3. 3. 防止酶被蛋白防止酶被蛋白 水解酶降解水解酶降解采取的措施采取的措施: :簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱KatIU與與Kat的換算的換算 1IU16.6710-9Kat 1Kat6107IU 1Kat109 nKat注意：注意：p如果底物（如果底物（S S）有一個(gè)以上可被