第七章 核酸提取與鑒定

1、 1 核酸的提取與鑒定第一節(jié) 預(yù)處理 第二節(jié) DNA的提取 第三節(jié) RNA的提取 第四節(jié) 核酸的鑒定 概述 研究對(duì)象：研究對(duì)象：基因組基因組DNA、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNA、總、總RNA、mRNA過(guò)程：過(guò)程： 裂解：裂解：破碎細(xì)胞，使細(xì)胞中的核酸游離破碎細(xì)胞，使細(xì)胞中的核酸游離在裂解體系中在裂解體系中 純化：純化：使核酸與其它雜質(zhì)徹底分離，使核酸與其它雜質(zhì)徹底分離，如蛋白質(zhì)、鹽等如蛋白質(zhì)、鹽等 總原則：總原則：應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性； 排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。鑒定：鑒定：濃度、純度、分子量、測(cè)序濃度、純度、分子量、測(cè)序 （技術(shù)：分光光度技術(shù)、凝膠電泳技術(shù)

2、等）（技術(shù)：分光光度技術(shù)、凝膠電泳技術(shù)等）1 1、植物樣品、植物樣品 新鮮組織新鮮組織先用無(wú)菌生理鹽水洗；干藥材除去霉點(diǎn)，無(wú)菌水浸洗； （一）樣品預(yù)處理（獲取分散細(xì)胞）（一）樣品預(yù)處理（獲取分散細(xì)胞） 搗碎或剪碎；加液氮液氮研磨成粉狀。2、動(dòng)物樣品新鮮樣品新鮮樣品，生理鹽水洗，直接使用（或分裝、-70/液氮低溫保存）；甲醛固定組織甲醛固定組織要先去掉甲醛；石蠟包埋組織石蠟包埋組織要經(jīng)過(guò)組織切片和二甲苯脫蠟等處理。 離心，棄細(xì)胞培養(yǎng)液； 用緩沖液多次漂洗；來(lái)源：來(lái)源：新鮮血液或者凍貯血液；抗凝劑：抗凝劑：一般用EDTA-Na2或檸檬酸鈉（枸櫞酸檸檬酸鈉（枸櫞酸鈉鈉 ），），不可使用肝素；肝素；分

3、離：分離：紅白細(xì)胞，一般用明膠，加緩沖液懸浮白細(xì)胞。（血清（血清DNA是研究腫瘤的材料之一）是研究腫瘤的材料之一）3、微生物培養(yǎng)物樣品離心獲取菌體細(xì)胞，加緩沖液洗滌，加緩沖液懸浮菌體細(xì)胞。4、微生物混合樣品用緩沖液懸浮菌體，低速離心，沉淀雜質(zhì)。高速離心獲取菌體細(xì)胞。用緩沖液洗滌菌體細(xì)胞。加緩沖液懸浮菌體細(xì)胞。 （二）提取用具預(yù)處理（二）提取用具預(yù)處理1 1、DNADNA提取用具的處理提取用具的處理 要求無(wú)菌；試劑、器材高壓干燥等進(jìn)行無(wú)DNA酶處理。2 2、RNARNA提取用具的處理提取用具的處理要求無(wú)菌，防止二次污染。 RNA易被RNase水解，RNase無(wú)處不在且耐高溫，提取條件要求嚴(yán)格。裂

4、解細(xì)胞，溶出裂解細(xì)胞，溶出DNA除去雜質(zhì)除去雜質(zhì)重新溶解重新溶解DNA沉淀、濃縮沉淀、濃縮DNA 破碎細(xì)胞，溶解破碎細(xì)胞，溶解DNADNA：用提取液（裂解液）破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和核膜。用提取液（裂解液）破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和核膜。微生物樣品提取液：含表面活性劑微生物樣品提取液：含表面活性劑SDSSDS、溶菌酶等、溶菌酶等動(dòng)物樣品提取液：含動(dòng)物樣品提取液：含SDSSDS、蛋白酶、蛋白酶K K等等植物樣品提取液：含植物樣品提取液：含CTABCTAB核酸酶可被核酸酶可被CaCa2+2+、MgMg2+2+等激活，提取液均含有螯合劑（如等激活，提取液均含有螯合劑（如EDTAEDTA，檸檬酸等），螯合這些離

5、子。檸檬酸等），螯合這些離子。2、除去雜質(zhì)（主要是蛋白質(zhì)） （SDSSDS，破膜、蛋白質(zhì)變性沉淀），破膜、蛋白質(zhì)變性沉淀）苯酚抽苯酚抽提蛋白質(zhì)提蛋白質(zhì)氯仿抽提、萃取苯酚氯仿抽提、萃取苯酚經(jīng)離心后溶液分為三層：上層是核酸溶液、經(jīng)離心后溶液分為三層：上層是核酸溶液、中間不溶物為變性蛋白質(zhì)，下層是苯酚氯中間不溶物為變性蛋白質(zhì)，下層是苯酚氯仿溶液。仿溶液。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)苯酚氯仿苯酚氯仿核酸溶液核酸溶液3.沉淀DNA有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀DNADNA：2 2倍體積無(wú)水乙醇（或倍體積無(wú)水乙醇（或1 1倍體積的異戊醇）倍體積的異戊醇）再用再用75%75%乙醇清洗多次。乙醇清洗多次。4.重新溶解DNA將將DN

6、ADNA溶于水或溶于水或TETE溶液。溶液。qCTAB法原理法原理（植物（植物DNA提取經(jīng)典方法）提取經(jīng)典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。并與核酸形成復(fù)合物。 該復(fù)合物在高鹽溶液中（該復(fù)合物在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通）是可溶的，通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。醇沉淀即可使核酸分離出

7、來(lái)。注：CTAB溶液在低于15 時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15。q SDS法原理法原理 SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（是一種陰離子去垢劑，在高溫（5565）條件下）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸； 提高鹽提高鹽(KAc或或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀； 上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的淀水相

8、中的DNA。DNA提取的一般流程提取的一般流程三、質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNA特點(diǎn)：特點(diǎn)：（1）細(xì)菌基因組）細(xì)菌基因組DNA以外的小型閉合環(huán)狀雙鏈以外的小型閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子。分子。（2）大都含有抗生素抗性基因。）大都含有抗生素抗性基因。（3）可自我復(fù)制或表達(dá)。）可自我復(fù)制或表達(dá)。（重組（重組DNA技術(shù)中構(gòu)建載體）技術(shù)中構(gòu)建載體）（4）大?。┐笮?-300 kb。1 1、培養(yǎng)細(xì)菌和擴(kuò)增質(zhì)粒、培養(yǎng)細(xì)菌和擴(kuò)增質(zhì)粒n 加適當(dāng)?shù)囊种苿ㄈ缏让顾兀?，抑制?xì)菌蛋加適當(dāng)?shù)囊种苿ㄈ缏让顾兀种萍?xì)菌蛋白質(zhì)合成，抑制細(xì)胞分裂，但質(zhì)粒會(huì)繼續(xù)復(fù)制。白質(zhì)合成，抑制細(xì)胞分裂，但質(zhì)粒會(huì)繼續(xù)復(fù)制。 2 2、收獲細(xì)菌

9、和溶菌、收獲細(xì)菌和溶菌 離心收集細(xì)菌細(xì)胞。離心收集細(xì)菌細(xì)胞。 細(xì)菌裂解方法：細(xì)菌裂解方法： 機(jī)械法機(jī)械法 化學(xué)試劑法化學(xué)試劑法 （SDSSDS） 溶菌酶化學(xué)試劑聯(lián)合法（最常用）溶菌酶化學(xué)試劑聯(lián)合法（最常用）3 3、分離質(zhì)粒、分離質(zhì)粒DNADNA 基因組基因組DNADNA與質(zhì)粒與質(zhì)粒DNADNA分離分離堿裂解法（最常用）堿裂解法（最常用） 用溶液用溶液1 1（EDTAEDTA）懸浮菌體。）懸浮菌體。 溶液溶液2 2（NaOHNaOH和和SDSSDS）裂解菌體，蛋白質(zhì)與）裂解菌體，蛋白質(zhì)與DNADNA發(fā)生變性。發(fā)生變性。 溶液溶液3 3中和中和pHpH，質(zhì)粒，質(zhì)粒DNADNA分子能夠迅速?gòu)?fù)性，呈溶

10、解狀態(tài)，分子能夠迅速?gòu)?fù)性，呈溶解狀態(tài)，基因組基因組DNADNA不復(fù)性與蛋白質(zhì)形成絮狀沉淀。不復(fù)性與蛋白質(zhì)形成絮狀沉淀。 離心后，質(zhì)粒離心后，質(zhì)粒DNADNA留在上清液中。留在上清液中。 通過(guò)加熱，使細(xì)菌裂解、蛋白質(zhì)和通過(guò)加熱，使細(xì)菌裂解、蛋白質(zhì)和DNADNA變性。變性。 降低溫度，質(zhì)粒降低溫度，質(zhì)粒DNADNA復(fù)性留于上清液，基因組復(fù)性留于上清液，基因組DNADNA復(fù)性很慢復(fù)性很慢與蛋白質(zhì)形成沉淀，可通過(guò)離心除去。與蛋白質(zhì)形成沉淀，可通過(guò)離心除去。煮沸裂解法（偶爾用）煮沸裂解法（偶爾用）梯度離心法（極少用）梯度離心法（極少用） 基因組基因組DNADNA斷裂，吸附大量斷裂，吸附大量EBEB，密度

11、大；質(zhì)粒，密度大；質(zhì)粒DNADNA密度小。密度小。 利用氯化銫梯度離心，分離基因組利用氯化銫梯度離心，分離基因組DNADNA和質(zhì)粒和質(zhì)粒DNADNA。 離心分離后，吸取含有質(zhì)粒離心分離后，吸取含有質(zhì)粒DNADNA的上清液。的上清液。 用苯酚、氯仿抽提，除去溶解于上清液中的蛋白質(zhì)。用苯酚、氯仿抽提，除去溶解于上清液中的蛋白質(zhì)。 用乙醇或異戊醇沉淀質(zhì)粒用乙醇或異戊醇沉淀質(zhì)粒DNADNA（與基因組（與基因組DNADNA方法同）。方法同）。4 4、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNADNA的純化的純化蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)苯酚氯仿苯酚氯仿核酸溶液核酸溶液（一）總RNA的提取所有RNA的提取過(guò)程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即：樣品細(xì)胞或組織的

12、有效破碎；有效地使核蛋白復(fù)合體變性；對(duì)內(nèi)源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。 最關(guān)鍵的是抑制RNA酶的活性。 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNARNA酶抑制劑。酶抑制劑。異硫氰酸胍：可裂解細(xì)胞并抑制RNA酶，目前被認(rèn)為是最有效的最有效的RNARNA酶抑制劑酶抑制劑。 RNA酶的蛋白抑制劑(RNAsin)等。（1 1）提取）提取RNARNA所用器皿的處理及溶液的準(zhǔn)備所用器皿的處理及溶液的準(zhǔn)備 塑料制品：塑料制品：使用滅菌的一次性用品。或用0.1DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻

13、璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用氯仿處理）。 玻璃用品：玻璃用品：使用前于180的高溫下干烤6h以上，或在220下干烤3h以上。 有機(jī)玻璃的電泳槽等，有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再用3H2O2室溫浸泡10min，然后用0.1DEPC水沖洗，晾干。 所需溶液的配制：所需溶液的配制：必須用高壓滅菌的水和RNA提取專用的化學(xué)試劑配制溶液，用干烤過(guò)的藥匙稱取試劑，把溶液裝入無(wú)RNase的玻璃器皿。 在涉及RNA的一切操作過(guò)程中，都應(yīng)戴一次性手套和口罩，應(yīng)勤換手套。 （2 2）RNARNA提取中提取中RNaseRNase污染的控制污染的控制 1 1、異硫氰酸胍、異硫氰酸胍

14、- -氯化銫超速離心法氯化銫超速離心法 使用蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍裂解組織和有效抑制RNA酶的活性； 再進(jìn)行CsCl密度梯度超速離心，RNA沉淀于管底，而DNA與蛋白質(zhì)在上清液中。 這種方法能得到高質(zhì)量的RNA，同時(shí)分離出細(xì)胞染色體DNA。2 2、鹽酸胍、鹽酸胍- -有機(jī)溶劑法有機(jī)溶劑法 利用鹽酸胍使蛋白質(zhì)變性，抑制RNA酶；3 3、氯化鋰、氯化鋰- -尿素法尿素法 利用高濃度尿素變性蛋白質(zhì)同時(shí)抑制RNA酶； 氯化鋰選擇性沉淀RNA。 其缺點(diǎn)是有時(shí)會(huì)存在DNA污染，氯化鋰沉淀RNA會(huì)丟失一些小分子RNA。4 4、一步快速熱酚抽提法、一步快速熱酚抽提法 將異硫氰酸胍、巰基乙醇和去污劑SDS等聯(lián)

15、合使用，抑制RNA的降解，裂解細(xì)胞，增強(qiáng)對(duì)核蛋白復(fù)合物的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離； 用高溫苯酚、氯仿等抽提去除蛋白質(zhì)和DNA，乙醇或異丙醇沉淀純化RNA。 此法操作簡(jiǎn)便快速，可在3小時(shí)以內(nèi)處理大批樣品，對(duì)大量或少量組織的細(xì)胞RNA提取均甚合適。 5 5、試劑盒快速提取法、試劑盒快速提取法 裂解液含胍鹽，抑制RNA酶，使蛋白質(zhì)和DNA同時(shí)變性； 氯仿等抽提去除蛋白質(zhì)和DNA； 乙醇或異丙醇沉淀純化RNA； 此法操作簡(jiǎn)便快速。 TRIzol的主要成分是異硫氰酸胍和苯酚。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有

16、效的變性蛋白質(zhì)，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8-羥基喹啉、-巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase。1）實(shí)驗(yàn)前取冰，）實(shí)驗(yàn)前取冰，4離心機(jī)預(yù)冷，離心機(jī)預(yù)冷，DEPC處理水處理水（高壓滅菌（高壓滅菌處理）處理）配制的配制的75%乙醇乙醇4預(yù)冷；預(yù)冷；2）1ml Trizol勻漿好的樣品；勻漿好的樣品；3）加入）加入0.2ml氯仿氯仿，顛倒顛倒混勻（混勻（15秒秒）“慢慢”，氯仿使蛋，氯仿使蛋白變性白變性4）室溫室溫，靜置，靜置3分鐘分鐘；5）離心機(jī)）離心機(jī)4、14000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分，離心分，離心15分鐘分鐘；靜置；靜置1分鐘分鐘（分（分層即可；樣品會(huì)分成三層：下層有機(jī)相，

17、中間層和上層無(wú)色的水相，層即可；樣品會(huì)分成三層：下層有機(jī)相，中間層和上層無(wú)色的水相，RNA主要存在于水相中）主要存在于水相中）6）取上清取上清0. 5ml（注意：取最上層水相，小心污染，寧可吸少點(diǎn)（注意：取最上層水相，小心污染，寧可吸少點(diǎn)也不要吸到中間層的物質(zhì)）也不要吸到中間層的物質(zhì)）放入另一個(gè)放入另一個(gè)1.5ml的的EP管中；管中；7）加入等體積的）加入等體積的異丙醇異丙醇（0.5ml），渦旋混勻；），渦旋混勻；8）室溫室溫，靜置，靜置10分鐘分鐘（該條件由（該條件由Trizol試劑盒提供；其他提供的試劑盒提供；其他提供的條件用條件用-20、1小時(shí)，目的為了更好分層）小時(shí)，目的為了更好分層）

18、9）離心機(jī)）離心機(jī)4、14000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分，離心分，離心10分鐘分鐘10）棄上液棄上液(移液器調(diào)至移液器調(diào)至1ml，分兩步快速輕輕吸棄上清：第，分兩步快速輕輕吸棄上清：第1步，沿步，沿液面吸棄約液面吸棄約0.9ml上清；第上清；第2步，沿液面吸棄其余上清步，沿液面吸棄其余上清;注意吸頭不要接觸注意吸頭不要接觸到沉淀斑區(qū)）到沉淀斑區(qū)）11)沿試管內(nèi)壁輕輕加入沿試管內(nèi)壁輕輕加入1ml 4預(yù)冷的預(yù)冷的75%乙醇乙醇,注意切勿注意切勿沖擊到沉淀斑區(qū)沖擊到沉淀斑區(qū)12）離心機(jī)）離心機(jī)4、10000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分，離心分，離心5分鐘分鐘13）棄上液棄上液（用槍把里面的乙醇吸去，留極少許即可，以防干燥過(guò)（用槍把里面

19、的乙醇吸去，留極少許即可，以防干燥過(guò)程中把程中把RNA烤干），烤干），60恒溫箱干燥恒溫箱干燥5分鐘分鐘（注意：打開(kāi)管蓋；或用（注意：打開(kāi)管蓋；或用真空干燥真空干燥5分鐘）分鐘）14）加入）加入50l DEPC處理水處理水溶解溶解（可以根據(jù)管底的白色沉淀判（可以根據(jù)管底的白色沉淀判斷斷RNA量的多少加量的多少加DEPC處理水）處理水）15）-80冰箱保存。冰箱保存。 （二）mRNA的提取從總RNA中分離mRNA， 用Oligo（dT）層析柱。mRNA含polyA，在高鹽濃度條件下與Oligo（dT）結(jié)合，其他成分被洗掉，再用低鹽濃度洗脫mRNA。（一）核酸濃度檢測(cè) OD2601時(shí)（比色皿厚度時(shí)

20、（比色皿厚度1.0cm）雙鏈雙鏈DNA濃度為濃度為50 g/ml，單鏈單鏈DNA或或RNA濃度為濃度為40 g/ml。DNA(g/ml) = OD26050RNA（g/ml ） = OD26040（二）核酸純度檢測(cè)（紫外吸收法紫外吸收法） 核酸在260 nm處有吸收峰，蛋白質(zhì)在280 nm有吸收峰 核酸的純度用比值表示。 DNA樣品：樣品：OD / OD 1.8 ，DNA純度高純度高OD / OD 1.8，含，含RNA，或，或DNA部分降解部分降解OD / OD 1.8，含苯酚或蛋白雜質(zhì)，含苯酚或蛋白雜質(zhì)RNA樣品：樣品： OD / OD 1.82.0 RNA純度高純度高 2.0，RNA出現(xiàn)降

21、解出現(xiàn)降解（三）核酸完整性檢測(cè)（三）核酸完整性檢測(cè) 核酸樣本的完整性和分子量可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定（RNA常采用甲醛瓊脂糖變性凝膠電泳），溴化乙錠染色，紫外燈觀察。 凝膠上RNA存在處可觀察到清晰的條帶。完整性良好的總RNA應(yīng)該清晰地看到28s rRNA、18s rRNA、5s rRNA的三條帶，其中28s rRNA的亮度應(yīng)為18s rRNA的兩倍，5s rRNA 較弱。 電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移。瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳：多用于鑒定較大核酸片段（0.160 kb）聚丙烯酰胺凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠電泳：用于鑒定較小的核酸片段（501000 bp）六、電泳六、電泳瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖是從瓊脂中提純出來(lái)的一種多糖。凝膠具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。瓊脂糖濃度() 線型DNA分子的分離范圍(kb)0.35600.61200.70.81