生化制藥工藝基礎(chǔ)

1、第五章第五章 生物制藥工藝基礎(chǔ)生物制藥工藝基礎(chǔ)生物制藥工藝基礎(chǔ)生物制藥工藝基礎(chǔ)一、生物活性物質(zhì)的預(yù)處理二、生物活性物質(zhì)的濃縮與干燥三、生物活性物質(zhì)的分離與純化四、生物制藥中試與放大工藝設(shè)計 本章要求了解生物制藥工藝基礎(chǔ)，重點掌握生物制藥分離操作方法及過程。本次課內(nèi)容： 活性物質(zhì)提取活性物質(zhì)提取構(gòu)建工程菌構(gòu)建工程菌高密度培養(yǎng)高密度培養(yǎng)產(chǎn)品分離產(chǎn)品分離生物制藥工程總體路線生物制藥工程總體路線生物醫(yī)藥蛋白提取工藝流程：生物醫(yī)藥蛋白提取工藝流程： 生物藥物生產(chǎn)中常用的分離純化方法生物藥物生產(chǎn)中常用的分離純化方法 方方 法法 目目 的的 離心離心/過濾過濾 去除細胞、細胞碎片、顆粒性雜質(zhì)去除細胞、細胞碎

2、片、顆粒性雜質(zhì) 陰離子交換層析陰離子交換層析 去除雜志蛋白、脂質(zhì)、去除雜志蛋白、脂質(zhì)、DNA、病毒、病毒 40nm微孔濾膜過濾微孔濾膜過濾 進一步去除病毒進一步去除病毒 陽離子交換層析陽離子交換層析 去除牛血清蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白等去除牛血清蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白等 超超 濾濾 去除沉淀物及病毒去除沉淀物及病毒 疏水層析疏水層析 去除殘余的雜蛋白去除殘余的雜蛋白 凝膠過濾凝膠過濾 與多聚體分離與多聚體分離 0.22m微孔濾膜過濾微孔濾膜過濾 除除 菌菌舉例舉例：干擾素發(fā)酵工藝過程干擾素生物分離過程p菌體裂解菌體裂解配制裂解緩沖液配制裂解緩沖液：純化水，2oC-10oC。裂解保護劑裂解保護劑：EDTA，PMS

3、F。攪拌攪拌：加裂解緩沖溶液， 2oC-10oC，2hr。凍融凍融：細胞完全破裂，釋放干擾素。p預(yù)處理預(yù)處理加絮凝劑聚乙烯亞胺加絮凝劑聚乙烯亞胺：2oC-10oC，攪拌，對菌體碎片進行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液加凝聚劑醋酸鈣溶液：2oC-10oC，攪拌，對菌體碎片、DNA進行沉淀。p離心離心連續(xù)流離心機連續(xù)流離心機：2oC-10oC，16000rpm。收集上清液收集上清液：集中含有重組干擾素蛋白質(zhì)。雜質(zhì)沉淀雜質(zhì)沉淀： 121oC、30min蒸汽滅菌，焚燒處理。p離心初級分離離心初級分離鹽析鹽析：4M硫酸銨，2oC-10oC，攪拌靜置過夜。離心離心：連續(xù)流離心機，16000 rpm。保存保存： 收

4、集沉淀，粗干擾素，4 oC保存。p干擾素純化工藝過程干擾素純化工藝過程第一節(jié) 生物材料的預(yù)處理 p含量低含量低 如胰島素在胰臟中的含量為0.02%，膽汁中膽紅素含量為0.050.08%。p雜質(zhì)多雜質(zhì)多 p易變性失活易變性失活生物材料一些特點生物材料一些特點一、細胞培養(yǎng)液的預(yù)處理（一）、雜蛋白質(zhì)的去除 1、加入凝聚劑 凝聚作用(coagulation)是指在某些電解質(zhì)作用下，使膠體粒子的擴散雙電層的排斥電位降低，破壞了膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，而使膠體粒子聚集的過程。_+電荷密度負電荷分布正電荷分布吸附層 擴散層距固體表面的距離常用的凝聚劑有：Al2(SO4)318H2O、AlCl36H2O、FeCl

5、3、ZnSO4、MgCO3等。 影響絮凝效果的因素主要有： （1）絮凝劑的分子量： （2）絮凝劑的用量： （3）溶液pH值： （4）攪拌速度和時間：2、加入絮凝劑 絮凝劑是天然的或人工合成的有機高分子化合物，如殼聚糖、海藻酸鈉、明膠及酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物和聚丙烯酸類等。（二）、多糖的去除 多糖可用酶轉(zhuǎn)化為單糖； 黏多糖可與一些陽離子表面活性劑如十六烷基溴化銨（CTAB）生成沉淀去除。 （三）、高價金屬離子的去除 1、離子交換法 2、沉淀法 Ca2+ 草酸 Mg2+ 磷酸鹽,三聚磷酸鈉 Fe3+ 黃血鹽 （四）、細胞破碎 機械法 1、勻漿法 2、珠磨法 3、超聲波化學(xué)法 1、化學(xué)試劑處

6、理 2、酶解法 3、制成丙酮粉物理法 1、干燥 2、凍融 3、滲透壓沖擊超聲波振蕩器 （五）、液-固分離一、過濾一、過濾二、離心分離二、離心分離 v液-液萃取指用一種溶劑將物質(zhì)從另一種溶劑（如發(fā)酵液）中提取出 來的方法。AHAHA-+ H+ KpKo 有機相水相（六）、液-液分離p鹽析法鹽析法p有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀p等電點沉淀法等電點沉淀法p成鹽沉淀法成鹽沉淀法p親和沉淀親和沉淀p高分子聚合物沉淀高分子聚合物沉淀 p結(jié)晶結(jié)晶 等等第二節(jié) 生物活性物質(zhì)濃縮方法 鹽析法 (Salt precipitation)定義：鹽析法是利用各種生物分子在濃定義：鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的

7、差異，通過向溶液鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達到純化目的或雜蛋白以沉淀析出，達到純化目的的方法。的方法。優(yōu)點：簡單、經(jīng)濟、較少變性優(yōu)點：簡單、經(jīng)濟、較少變性缺點：分辨率不高，要除鹽缺點：分辨率不高，要除鹽有機溶劑沉淀p定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。分離純化方法。 對于兩性物質(zhì)，等電點時凈電荷為零，分子間對于兩性物質(zhì)，等電點時凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互

8、聚集起來，發(fā)排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來，發(fā)生沉淀。生沉淀。 等電點沉淀法金屬離子沉淀：與生物分子的金屬離子沉淀：與生物分子的酸性功能團酸性功能團作作用的用的金屬復(fù)合鹽法金屬復(fù)合鹽法；有機酸類復(fù)合鹽沉淀有機酸類復(fù)合鹽沉淀: :與生物分子的與生物分子的堿性功能堿性功能團團作用的作用的有機酸復(fù)合鹽法有機酸復(fù)合鹽法（如苦味酸鹽、（如苦味酸鹽、苦酮酸鹽、丹寧酸鹽等）?？嗤猁}、丹寧酸鹽等）。成鹽沉淀法親和沉淀 利用親和反應(yīng)原理，將配利用親和反應(yīng)原理，將配基與可溶性的載體偶聯(lián)基與可溶性的載體偶聯(lián)后形成后形成載體載體- -配基復(fù)合物配基復(fù)合物（親和沉淀劑），（親和沉淀劑），該復(fù)該復(fù)合物可選擇性

9、地與蛋白合物可選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合，在一定條件下質(zhì)結(jié)合，在一定條件下沉淀出來。沉淀出來。 中性可溶，酸性沉淀。中性可溶，酸性沉淀。高分子聚合物沉淀 水溶性非離子型高分子聚合物，如不同分子水溶性非離子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（量的聚乙二醇（PEGPEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使蛋白質(zhì)水合作用減弱而發(fā)生沉酸酯等，能使蛋白質(zhì)水合作用減弱而發(fā)生沉淀。淀。表面活性劑 十六烷基三甲基季胺溴化物（十六烷基三甲基季胺溴化物（CTABCTAB） 十六烷基氯化吡啶（十六烷基氯化吡啶（CPCCPC）酸性酸性多糖多糖結(jié)晶(Crystallization) p定義：定義：溶液

10、中的溶質(zhì)在一定條件下因分子有規(guī)則溶液中的溶質(zhì)在一定條件下因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體。的排列而結(jié)合成晶體。 p通過結(jié)晶，溶液中的大部分雜質(zhì)會留在母液中，通過結(jié)晶，溶液中的大部分雜質(zhì)會留在母液中，經(jīng)過濾、洗滌可得到經(jīng)過濾、洗滌可得到純度高純度高的晶體。的晶體。 凝膠層析p分子篩層析分子篩層析 (molecular sieve chromatography)(molecular sieve chromatography)p凝膠過濾凝膠過濾 (Gel filtration) (Gel filtration) p排阻層析排阻層析(exclusion chromatography)(exclusion

11、 chromatography)較小的分子在柱中停留時間比大分子停留的時間要長，較小的分子在柱中停留時間比大分子停留的時間要長，p吸附法吸附法(adsorption method)(adsorption method)指利用吸附作用，指利用吸附作用，將樣品中的將樣品中的生物活性物質(zhì)生物活性物質(zhì)或或雜質(zhì)雜質(zhì)吸附于適當?shù)奈接谶m當?shù)奈絼┥?，利用吸附劑對活性物質(zhì)和雜質(zhì)間吸附劑上，利用吸附劑對活性物質(zhì)和雜質(zhì)間吸吸附能力附能力的差異，使目的物和其它物質(zhì)分離，達的差異，使目的物和其它物質(zhì)分離，達到濃縮和提純目的的方法。到濃縮和提純目的的方法。 吸附分離幾種常用的吸附劑幾種常用的吸附劑無機：白陶土、氧化鋁

12、、硅膠、硅無機：白陶土、氧化鋁、硅膠、硅藻土藻土有機：活性炭、纖維素、大孔吸附有機：活性炭、纖維素、大孔吸附樹脂等樹脂等干燥：冷凍干燥儀氧化鋁吸附層析純化維生素氧化鋁吸附層析純化維生素B12影響因素：影響因素：p(1) Al2O3的顆粒度要均勻，流速控制要很慢；的顆粒度要均勻，流速控制要很慢；p(2) 溫度宜在溫度宜在20以下層析，洗脫在室溫中進行；以下層析，洗脫在室溫中進行；p(3) 利用利用B12在丙酮中不溶的特性，在冰凍條件下結(jié)晶在丙酮中不溶的特性，在冰凍條件下結(jié)晶3天，結(jié)晶析出。天，結(jié)晶析出。 層 析 洗 脫 冷凍結(jié)晶 維生素維生素 B12 吸附柱層析吸附柱層析 洗脫液洗脫液 維生素維

13、生素 B12結(jié)晶結(jié)晶 的濃縮液的濃縮液 Al2O3吸附,20以下 丙酮,水(80%) 丙酮 56 倍 (4000u/ml) Your Text活性物質(zhì)蛋白 核酸糖類多糖分離純化的一般方法原料提取除蛋白透析沉淀粗品 純化糖提取糖提取-肝素提取工藝肝素提取工藝1.鹽解離子交換生產(chǎn)工藝豬腸粘膜【提取】PH9.0,5055,2h提取液【吸附】714樹脂樹脂吸附物【洗滌】1.4mol/LNaCl樹脂吸附物【洗脫】3mol/LNaCl洗脫液【沉淀】乙醇粗品肝素【溶解】1%NaCl,pH1.5濾液【脫色】H2O2， pH11濾液【沉淀】乙醇肝素鈉精品酶提取酶提取-牛血紅細胞提取牛血紅細胞提取Cu、Zn-SO

14、D的工藝的工藝 Insulin crystas 酸醇提取法提取動物胰島素酸醇提取法提取動物胰島素 第二節(jié)第二節(jié) 生物制藥工藝中試放大設(shè)計生物制藥工藝中試放大設(shè)計一、中試放大目的與規(guī)模一、中試放大目的與規(guī)模1目的：（1）建立穩(wěn)定工藝、大批量制備足量合格產(chǎn)品，供應(yīng)臨床前與臨床研究；（2）研究工藝參數(shù)制定工藝規(guī)程和檢定規(guī)程，為正式生產(chǎn)提供工藝參數(shù)，保證能在以后生產(chǎn)中應(yīng)用。2規(guī)模：規(guī)模： 中試是由小試轉(zhuǎn)入工業(yè)化生產(chǎn)的過渡性研究，是取得成功產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。3、中試放大時應(yīng)具備的條件、中試放大時應(yīng)具備的條件 （1）有穩(wěn)定的工藝：收率，質(zhì)量可靠 （2）操作條件基本確立 （3）已建立中間品和成品分析方法 （4）

15、生物材料已鑒定 （5）物料平衡、三廢處理已基本解決 （6）中試規(guī)模、產(chǎn)品產(chǎn)量，規(guī)模已確定 （7）安全生產(chǎn)已有方案4中試放大要解決的問題中試放大要解決的問題（1）原輔材料規(guī)格 （2）設(shè)備選型與材質(zhì)選用 （3）反應(yīng)條件（4）原輔料中間品、產(chǎn)品質(zhì)控標準與檢定方法（5）下游工藝優(yōu)化與穩(wěn)定制造規(guī)程的制定二中試放大方法與總結(jié)內(nèi)容二中試放大方法與總結(jié)內(nèi)容1、放大方法、放大方法 （1）經(jīng)驗放大 （2）相似放大 （3）數(shù)學(xué)模型放大2、總結(jié)內(nèi)容：、總結(jié)內(nèi)容：（1）確定工藝路線，優(yōu)化工藝條件，制定制造規(guī)程。（2）制定崗位操作、投產(chǎn)（3）進行材料衡算（4）安全生產(chǎn)與處理（5）原輔料及產(chǎn)品質(zhì)控方法與標準測定。（6）產(chǎn)品

16、規(guī)格標準制定（7）消耗定額，成本核算，工時，生產(chǎn)周期計算。 nucleic acid medicine課程考試題目(二選一)p1、對映體選擇性E表示酶反應(yīng)對映體選擇性的大小E值越大，酶的對映體選擇性越好；E值為1，表示酶無對映體選擇性。計算酶選擇性的公式為E= Ln1-c(1+eep)/Lnl-c(1-eep)。（a）利用B. megaterium凍干細胞不對稱水解外消旋縮水甘油苯基醚4 h后，水解情況如圖所示，請計算酶的選擇性。（已知Ln0.1225=-2.0996，Ln0.01225=-4.402，Ln(0.9775)=-0.02276，Ln(0.09775)=-2.325）（b）設(shè)計紫外

17、誘變實驗，簡要描述通過紫外誘變B. megaterium ECU1001篩選出耐受高底物濃度（200 mmol/L）誘變流程。）p2、根據(jù)所學(xué)的“生物制藥工程”原理，簡述基因工程制藥、發(fā)酵工程制藥和酶工程制藥的研究范圍及應(yīng)用意義。第一章第一章 緒論緒論（1）名詞解釋：藥物，生物藥物，生物技術(shù)藥物，）名詞解釋：藥物，生物藥物，生物技術(shù)藥物，生物制品，中國藥典，基因治療，反義生物制品，中國藥典，基因治療，反義RNA,藥品，藥品，RNA干涉干涉（2）分析現(xiàn)代生物技術(shù)制藥（包括研發(fā)和生產(chǎn)）分析現(xiàn)代生物技術(shù)制藥（包括研發(fā)和生產(chǎn)）的特征及發(fā)展趨勢，比較與化學(xué)制藥的異同。的特征及發(fā)展趨勢，比較與化學(xué)制藥的異同。（3）中藥與生物藥物的區(qū)別。）中藥與生物藥物的區(qū)別。（4）生物藥物的特性與類別）生物藥物的特性與類別富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)復(fù)復(fù)篩篩生物轉(zhuǎn)化生物轉(zhuǎn)化 分析分析土壤土壤發(fā)酵菌株篩選、微生物營養(yǎng)、培養(yǎng)基、發(fā)酵優(yōu)化、代謝等發(fā)酵菌株篩選、微生物營養(yǎng)、培養(yǎng)基、發(fā)酵優(yōu)化、代謝等鑒定菌種第二章第二章 發(fā)酵工程制藥發(fā)酵工程制藥第三章 酶工程制藥p酶篩選p生物催化：選擇性，ee值p酶工程：固定化、水-有機溶劑反應(yīng)體系，模擬酶課堂練習(xí)課堂練習(xí)1. 簡單描述質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法？2. 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法有哪些方法？3.設(shè)計一培養(yǎng)基，描述如何從自然界土壤中篩選真菌來源