生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)(1)ppt課件

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) CQMU 紙層析法察看轉(zhuǎn)氨基作用紙層析法察看轉(zhuǎn)氨基作用p學(xué)習(xí)氨基酸紙層析的根本原理學(xué)習(xí)氨基酸紙層析的根本原理p掌握氨基酸紙層析的操作技術(shù)掌握氨基酸紙層析的操作技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膒 層析技術(shù)層析技術(shù)層析法又稱(chēng)色譜法，是一種根據(jù)層析法又稱(chēng)色譜法，是一種根據(jù)物質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)不同如物質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)不同如吸附力、溶解度等而建立的物吸附力、溶解度等而建立的物質(zhì)分別、分析方法，是近代生化質(zhì)分別、分析方法，是近代生化最常用技術(shù)之一。最常用技術(shù)之一。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理根本原理：在層析系統(tǒng)固定相流動(dòng)相中，根本原理：在層析系統(tǒng)固定相流動(dòng)相中，由于混合物各組份理化性質(zhì)不同，與兩相的相

2、互由于混合物各組份理化性質(zhì)不同，與兩相的相互作用吸附、溶解等才干不同，隨著流動(dòng)相不作用吸附、溶解等才干不同，隨著流動(dòng)相不斷向前挪動(dòng)，不同組分最終得以分開(kāi)。斷向前挪動(dòng)，不同組分最終得以分開(kāi)。p紙層析紙層析屬于分配層析，利用混合物在二種或二種以上屬于分配層析，利用混合物在二種或二種以上的不同溶劑中總的分配系數(shù)的不同而使物質(zhì)分的不同溶劑中總的分配系數(shù)的不同而使物質(zhì)分別的方法。別的方法。以濾紙為支持介質(zhì)，水被吸附在濾紙纖維上構(gòu)以濾紙為支持介質(zhì)，水被吸附在濾紙纖維上構(gòu)成固定相，有機(jī)溶劑如酚等為流動(dòng)相。成固定相，有機(jī)溶劑如酚等為流動(dòng)相。把預(yù)分別物質(zhì)加在紙的一端，使流動(dòng)溶劑經(jīng)此把預(yù)分別物質(zhì)加在紙的一端，使流

3、動(dòng)溶劑經(jīng)此向另一端挪動(dòng)，隨著流動(dòng)相的挪動(dòng)，待分別物向另一端挪動(dòng)，隨著流動(dòng)相的挪動(dòng)，待分別物質(zhì)進(jìn)展延續(xù)、動(dòng)態(tài)的不斷分配。在固定相分配質(zhì)進(jìn)展延續(xù)、動(dòng)態(tài)的不斷分配。在固定相分配趨勢(shì)大的組份，隨流動(dòng)相挪動(dòng)的速度慢；反之，趨勢(shì)大的組份，隨流動(dòng)相挪動(dòng)的速度慢；反之，在流動(dòng)相分配趨勢(shì)較大的成分，挪動(dòng)速度快，在流動(dòng)相分配趨勢(shì)較大的成分，挪動(dòng)速度快，最終不同的組份彼此分別。最終不同的組份彼此分別。p ALT催化的轉(zhuǎn)氨基反響催化的轉(zhuǎn)氨基反響紙層析察看轉(zhuǎn)氨基作用的技術(shù)根底：紙層析察看轉(zhuǎn)氨基作用的技術(shù)根底： 丙氨酸和谷氨酸可以經(jīng)過(guò)紙層析得以分丙氨酸和谷氨酸可以經(jīng)過(guò)紙層析得以分別別實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟p 肝勻漿制備：肝勻漿

4、制備：p 轉(zhuǎn)氨基反響：取試管二支，分別標(biāo)明測(cè)定管與轉(zhuǎn)氨基反響：取試管二支，分別標(biāo)明測(cè)定管與對(duì)看管，各參與肝勻漿對(duì)看管，各參與肝勻漿10滴，測(cè)定管參與滴，測(cè)定管參與37水浴保溫水浴保溫10分鐘，對(duì)看管放入沸水浴中煮分鐘，對(duì)看管放入沸水浴中煮10分分鐘，待對(duì)看管冷卻后，于兩試管中分別參與鐘，待對(duì)看管冷卻后，于兩試管中分別參與0.1 mol/L 丙氨酸丙氨酸10滴，滴，0.1 mol/L -酮戊二酸酮戊二酸10滴，滴，pH 7.4 0.01 mol/l 磷酸緩沖液磷酸緩沖液1.5 ml，搖勻，放，搖勻，放進(jìn)進(jìn)37水浴保溫水浴保溫30分鐘，保溫終了，立刻將測(cè)分鐘，保溫終了，立刻將測(cè)定管放入沸水浴中煮沸

5、定管放入沸水浴中煮沸10分鐘以終止反響，取分鐘以終止反響，取出冷卻后，過(guò)濾。取濾液備用。出冷卻后，過(guò)濾。取濾液備用。p層析：預(yù)備濾紙層析：預(yù)備濾紙點(diǎn)樣點(diǎn)樣層析層析終止。終止。 測(cè)定管上清液測(cè)定管上清液 0.1 mol/L丙氨酸丙氨酸 對(duì)看管上清液對(duì)看管上清液 0.1 mol/L谷氨酸谷氨酸 p 顯色：將上述濾紙平放在培育皿上，用顯色：將上述濾紙平放在培育皿上，用噴霧器噴上噴霧器噴上0.5 %茚三酮之丙酮溶液，使茚三酮之丙酮溶液，使濾紙全部潮濕再用吹風(fēng)機(jī)或?yàn)V紙全部潮濕再用吹風(fēng)機(jī)或60烘箱枯烘箱枯燥之，此時(shí)可見(jiàn)紫色斑出現(xiàn)。燥之，此時(shí)可見(jiàn)紫色斑出現(xiàn)。p 分析：比較色斑的位置及色澤深淺，計(jì)分析：比較色斑的位置及色澤深淺，計(jì)算算Rf值，分析能否發(fā)生了轉(zhuǎn)氨基反響。值，分析能否發(fā)生了轉(zhuǎn)氨基反響。本卷須知本卷須知p 層析液中含有腐蝕性酚，取用時(shí)留層析液中含有腐蝕性酚，取用時(shí)留意平安，防止濺到皮膚及眼睛；意平安，防止濺到皮膚及眼睛；p 操作中接觸濾紙前要洗手擦凈，并操作中