核酸的物理化學(xué)性質(zhì)

1、會(huì)計(jì)學(xué)1核酸的物理化學(xué)性質(zhì)核酸的物理化學(xué)性質(zhì)第1頁(yè)/共48頁(yè) 核酸可被水解的位點(diǎn)有磷酸酯鍵和糖苷鍵核酸可被水解的位點(diǎn)有磷酸酯鍵和糖苷鍵，其中糖苷鍵更易被水解。，其中糖苷鍵更易被水解。 第2頁(yè)/共48頁(yè)55端端3端端CGA第3頁(yè)/共48頁(yè) 嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶堿的糖苷鍵對(duì)酸更不穩(wěn)嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶堿的糖苷鍵對(duì)酸更不穩(wěn)定，對(duì)酸最不穩(wěn)定的是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷定，對(duì)酸最不穩(wěn)定的是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵。鍵。DNA在在pH1.6于于37對(duì)水透析可完全除去嘌呤對(duì)水透析可完全除去嘌呤堿；在堿；在pH2.8于于100加熱加熱1h，也可完全除去嘌呤堿，也可完全除去嘌呤堿。 第4頁(yè)/共48頁(yè) RNA的

2、磷酸酯鍵易被堿水解，產(chǎn)生核苷酸。的磷酸酯鍵易被堿水解，產(chǎn)生核苷酸。 DNA的磷酸酯鍵則不易被堿水解。這是因?yàn)榈牧姿狨ユI則不易被堿水解。這是因?yàn)镽NA的核糖上有的核糖上有2OH，在堿作用下形成磷酸三酯。，在堿作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯極不穩(wěn)定，隨即水解，產(chǎn)生核苷磷酸三酯極不穩(wěn)定，隨即水解，產(chǎn)生核苷2，3環(huán)磷酸酯。該環(huán)磷酸酯繼續(xù)水解產(chǎn)生環(huán)磷酸酯。該環(huán)磷酸酯繼續(xù)水解產(chǎn)生2核苷核苷酸和酸和3核苷酸。核苷酸。 DNA一般對(duì)堿穩(wěn)定，若在一般對(duì)堿穩(wěn)定，若在1mol/L NaOH中加中加熱至熱至100 4h，可以得到小分子的寡聚脫氧核苷，可以得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。酸。第5頁(yè)/共48頁(yè) 水解核酸的酶種類

3、很多。非特異性水水解核酸的酶種類很多。非特異性水解磷酸二酯鍵的酶為磷酸二酯酶，如蛇毒解磷酸二酯鍵的酶為磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。專一水解磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。專一水解核酸的磷酸二酯酶稱為核酸酶。另外還有核酸的磷酸二酯酶稱為核酸酶。另外還有非特異水解糖苷鍵的糖苷酶。非特異水解糖苷鍵的糖苷酶。 第6頁(yè)/共48頁(yè)按底物專一性分類：作用于按底物專一性分類：作用于RNA的稱為的稱為RNA酶酶（ribonuclease，RNase）；作用于）；作用于DNA的稱為的稱為DNA酶（酶（deoxyribonuclease，DNase）。）。按對(duì)底物作用的方式可分為核酸內(nèi)切酶（按對(duì)底物作

4、用的方式可分為核酸內(nèi)切酶（endonuclease）和核酸外切酶（）和核酸外切酶（exonuclease）。）。少數(shù)核酸酶既可內(nèi)切又可外切。少數(shù)核酸酶既可內(nèi)切又可外切。第7頁(yè)/共48頁(yè)核酸外切酶有核酸外切酶有53方向切割的，也有方向切割的，也有35方向方向切割的，分別稱為切割的，分別稱為53外切酶和外切酶和35外切酶。外切酶。還有對(duì)特定核苷酸序列部位進(jìn)行切割的。如還有對(duì)特定核苷酸序列部位進(jìn)行切割的。如:限制限制性核酸內(nèi)切酶性核酸內(nèi)切酶 第8頁(yè)/共48頁(yè)1 1、堿基的解離、堿基的解離第9頁(yè)/共48頁(yè)ONHNHOON-NHOCH3ONHNHOCH3ON-NHO19.5pK 19.9pK HHONH

5、2NH+NHONH2NNHO-NH2NNH212.5pK 14.6pK HH 胞嘧啶中胞嘧啶中 尿嘧啶及胸腺嘧啶中尿嘧啶及胸腺嘧啶中第10頁(yè)/共48頁(yè)NNH+NHNNH2NNNHNNH2NNN-NNH214.15pK HH29.8pK NNHNHNH+NH2ONNHNHNNH2ONN-NHNH+NH2ONN-N-NNH2OHHH13.2pK 29.6pK 312.4pK 鳥(niǎo)嘌呤和次黃嘌呤中質(zhì)子鳥(niǎo)嘌呤和次黃嘌呤中質(zhì)子則結(jié)合到則結(jié)合到N7上上第11頁(yè)/共48頁(yè)2、核苷的解離、核苷的解離戊糖可增強(qiáng)堿基的酸性解離戊糖可增強(qiáng)堿基的酸性解離核糖中的羥基也可發(fā)生解離核糖中的羥基也可發(fā)生解離3.3.核苷酸的解

6、離核苷酸的解離磷酸基使核苷酸具有很強(qiáng)的酸性磷酸基使核苷酸具有很強(qiáng)的酸性第12頁(yè)/共48頁(yè)ROHOHOOPRO-OHOOPRO-O-OOP10.7 1.6pK HH25.96.5pK OHN-CH2OOOHOOPOHNCH2OOHN-CH2OOO-OOPOHNCH2OH11.5pK 第13頁(yè)/共48頁(yè)第14頁(yè)/共48頁(yè)第15頁(yè)/共48頁(yè)核酸溶液紫外吸收以摩爾磷的吸光度表示，摩爾核酸溶液紫外吸收以摩爾磷的吸光度表示，摩爾磷即相當(dāng)于摩爾核苷酸。磷即相當(dāng)于摩爾核苷酸。30.98APWL（ ） ：摩爾吸光系數(shù)：摩爾吸光系數(shù) A：吸收值：吸收值 W：每升溶液磷重量：每升溶液磷重量 L ：比色杯內(nèi)徑：比色杯

7、內(nèi)徑第16頁(yè)/共48頁(yè) OD260的應(yīng)用：的應(yīng)用：1. DNA或或RNA的定量的定量 OD260=1.0相當(dāng)于相當(dāng)于 50g/ml雙鏈雙鏈DNA 40g/ml單鏈單鏈DNA（或（或RNA） 20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度判斷核酸樣品的純度 DNA純品純品: OD260/OD280 = 1.8 RNA純品純品: OD260/OD280 = 2.0 含雜蛋白及苯酚，降低含雜蛋白及苯酚，降低3.判斷判斷DNA是否變性是否變性第17頁(yè)/共48頁(yè)第18頁(yè)/共48頁(yè) 某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力，某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力， 使核酸分子高級(jí)結(jié)構(gòu)改變、理化性質(zhì)及使核酸分子高

8、級(jí)結(jié)構(gòu)改變、理化性質(zhì)及 生物活性發(fā)生改變。生物活性發(fā)生改變。 不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級(jí)結(jié)構(gòu)不變不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級(jí)結(jié)構(gòu)不變2 2、變性的實(shí)質(zhì)、變性的實(shí)質(zhì)第19頁(yè)/共48頁(yè)降解：核苷酸骨架上降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯鍵的斷裂磷酸二酯鍵的斷裂DNADNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂第20頁(yè)/共48頁(yè) 高溫（一般高溫（一般7575） 熱變性熱變性 強(qiáng)酸、堿強(qiáng)酸、堿 酸堿變性酸堿變性 甲醛甲醛（Agarose中中RNA ） 尿素尿素（PAGE中中DNA ）3 3、變性因素、變性因素第21頁(yè)/共48頁(yè) ODOD260260增高增高 粘度下降粘度下降 比旋度下

9、降比旋度下降 浮力密度升高浮力密度升高 酸堿滴定曲線改變酸堿滴定曲線改變生物活性喪失生物活性喪失4、變性后理化性質(zhì)變化、變性后理化性質(zhì)變化RNA變性：從螺旋到線團(tuán)之間的轉(zhuǎn)變變性：從螺旋到線團(tuán)之間的轉(zhuǎn)變RNA的變性引起的性質(zhì)變化沒(méi)有的變性引起的性質(zhì)變化沒(méi)有DNA明顯明顯第22頁(yè)/共48頁(yè)第23頁(yè)/共48頁(yè)由于變性或降解引起紫外吸收增加的現(xiàn)由于變性或降解引起紫外吸收增加的現(xiàn)象稱象稱增色效應(yīng)增色效應(yīng)第24頁(yè)/共48頁(yè)第25頁(yè)/共48頁(yè)解鏈曲線：解鏈曲線：連續(xù)加熱連續(xù)加熱DNADNA，以溫度對(duì)，以溫度對(duì)A A260260作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。第26頁(yè)/共48頁(yè) 指增

10、色效應(yīng)達(dá)指增色效應(yīng)達(dá)50%時(shí)的溫度時(shí)的溫度 一般一般DNA Tm 值在值在85 - 90 C之間之間 Tm：DNA變性時(shí)，變性時(shí)，OD260達(dá)達(dá)到最大值的到最大值的50%時(shí)的溫度稱時(shí)的溫度稱為為DNA的的解鏈溫度解鏈溫度或或融解溫融解溫度度(Tm)。大小與大小與G+C含量成正比。含量成正比。第27頁(yè)/共48頁(yè)第28頁(yè)/共48頁(yè)（1 1）DNA的均一性：的均一性：（2）GC含量：含量： 經(jīng)驗(yàn)公式：經(jīng)驗(yàn)公式： XG+C（Tm69.3）2.44（3）介質(zhì)中的離子強(qiáng)度：）介質(zhì)中的離子強(qiáng)度： Tm值大小與下列因素有關(guān)：值大小與下列因素有關(guān)：第29頁(yè)/共48頁(yè)熱變性的熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，經(jīng)

11、緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過(guò)程稱為這一過(guò)程稱為退火退火(annealing) 。第30頁(yè)/共48頁(yè)第31頁(yè)/共48頁(yè)第32頁(yè)/共48頁(yè)復(fù)性時(shí)紫外吸收減少的現(xiàn)象復(fù)性時(shí)紫外吸收減少的現(xiàn)象第33頁(yè)/共48頁(yè)( (三三) ) 核酸的雜交核酸的雜交第34頁(yè)/共48頁(yè)第35頁(yè)/共48頁(yè)DNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子變性變性 復(fù)性復(fù)性 不同來(lái)源的不同來(lái)源的DNA分子分子第36頁(yè)/共48頁(yè)第37頁(yè)/共48頁(yè) SouthernSouthern雜交雜交 NorthernNorthern雜交雜交 WesternWestern雜交雜交第38頁(yè)/共48頁(yè)第39頁(yè)/共48頁(yè)第40頁(yè)/共48頁(yè)第41頁(yè)/共48頁(yè) RN

12、A的磷酸酯鍵易被堿水解，產(chǎn)生核苷酸。的磷酸酯鍵易被堿水解，產(chǎn)生核苷酸。 DNA的磷酸酯鍵則不易被堿水解。這是因?yàn)榈牧姿狨ユI則不易被堿水解。這是因?yàn)镽NA的核糖上有的核糖上有2OH，在堿作用下形成磷酸三酯。，在堿作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯極不穩(wěn)定，隨即水解，產(chǎn)生核苷磷酸三酯極不穩(wěn)定，隨即水解，產(chǎn)生核苷2，3環(huán)磷酸酯。該環(huán)磷酸酯繼續(xù)水解產(chǎn)生環(huán)磷酸酯。該環(huán)磷酸酯繼續(xù)水解產(chǎn)生2核苷核苷酸和酸和3核苷酸。核苷酸。 DNA一般對(duì)堿穩(wěn)定，若在一般對(duì)堿穩(wěn)定，若在1mol/L NaOH中加中加熱至熱至100 4h，可以得到小分子的寡聚脫氧核苷，可以得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。酸。第42頁(yè)/共48頁(yè) 水解核酸的

13、酶種類很多。非特異性水水解核酸的酶種類很多。非特異性水解磷酸二酯鍵的酶為磷酸二酯酶，如蛇毒解磷酸二酯鍵的酶為磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。專一水解磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。專一水解核酸的磷酸二酯酶稱為核酸酶。另外還有核酸的磷酸二酯酶稱為核酸酶。另外還有非特異水解糖苷鍵的糖苷酶。非特異水解糖苷鍵的糖苷酶。 第43頁(yè)/共48頁(yè)核酸外切酶有核酸外切酶有53方向切割的，也有方向切割的，也有35方向方向切割的，分別稱為切割的，分別稱為53外切酶和外切酶和35外切酶。外切酶。還有對(duì)特定核苷酸序列部位進(jìn)行切割的。如還有對(duì)特定核苷酸序列部位進(jìn)行切割的。如:限制限制性核酸內(nèi)切酶性核酸內(nèi)切酶 第44頁(yè)/共48頁(yè) 某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力，某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力， 使核酸分子高級(jí)結(jié)構(gòu)改變、理化性質(zhì)及使核酸分子高級(jí)結(jié)構(gòu)改變、理化性質(zhì)及 生物活性發(fā)生改變。生物活性發(fā)生改變。 不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級(jí)結(jié)構(gòu)不變不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級(jí)結(jié)構(gòu)不變2 2、變性的實(shí)質(zhì)、變性的實(shí)質(zhì)第45頁(yè)/共48頁(yè)由于變性或降解引起紫外吸收增加的現(xiàn)由于變性或降解引起紫外吸收增加的現(xiàn)