高分辨率溶解曲線PPT課件

1、第1頁/共46頁內(nèi)容提示內(nèi)容提示 高分辨熔解曲線（High Resolution Melting） 高分辨熔解曲線在遺傳育種中的應(yīng)用 篩查突變篩查突變 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+內(nèi)標(biāo)法（ Small Amplicon Genotyping ） 非標(biāo)記探針法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 檢測(cè)甲基化檢測(cè)甲基化 HRM儀器第2頁/共46頁第3頁/共46頁High Resolution DNA Melting（HRM)是基于有序列變化的是基于有序列變化的Am

2、plicon之間微弱的之間微弱的Tm值差異，通過值差異，通過DNA片段熔解曲線的差異進(jìn)行突變檢測(cè)，比如：片段熔解曲線的差異進(jìn)行突變檢測(cè)，比如：第4頁/共46頁P(yáng)CRTube 1Tube 2Tube 3Wild typeHomozygoteHeterozygoteLightScanner突變檢測(cè)原理突變檢測(cè)原理第5頁/共46頁Lightscanner高分辨溶解曲線結(jié)果高分辨溶解曲線結(jié)果第6頁/共46頁Saturating dyeSaturating dyeLC Green plus LC Green plus 高分辨溶解曲線專用熒光染料高分辨溶解曲線專用熒光染料第7頁/共46頁內(nèi)容提示內(nèi)容提示

3、高分辨熔解曲線（High Resolution Melting）的定義 高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用 篩查突變篩查突變 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+內(nèi)標(biāo)法（ Small Amplicon Genotyping ） 非標(biāo)記探針法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 檢測(cè)甲基化檢測(cè)甲基化 HRM儀器第8頁/共46頁未知未知SNPSNP掃描掃描第9頁/共46頁等對(duì)北京油雞CAPN1基因外顯子進(jìn)行掃描，篩查其潛在SNPs。第10頁/共46頁Bernhard J

4、. HoWnger Hai-Chun Jing Kim E. Hammond-Kosack Kostya Kanyuka(Barley Application) Theor Appl Genet (2009) 119:851865DOI 10.1007/s00122-009-1094-2 數(shù)據(jù)來自英國洛桑農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站Bernhard等對(duì)Barley的eukaryotic translationinitiation factor 4E (eIF4E) gene基因外顯子進(jìn)行突變掃描結(jié)果基因外顯子進(jìn)行突變掃描結(jié)果第11頁/共46頁第12頁/共46頁內(nèi)容提示內(nèi)容提示 高分辨熔解曲線（High Reso

5、lution Melting）的定義 高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用 篩查突變篩查突變 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+內(nèi)標(biāo)法（ Small Amplicon Genotyping ） 非標(biāo)記探針法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 檢測(cè)甲基化檢測(cè)甲基化 HRM儀器第13頁/共46頁Small Amplicon Genotyping擴(kuò)增小片段直接進(jìn)行基因型鑒定擴(kuò)增小片段直接進(jìn)行基因型鑒定第14頁/共46頁使用已知Tm值的雙鏈DNA做溫度內(nèi)標(biāo)，低溫內(nèi)標(biāo)Tm(

6、61) ,高溫內(nèi)標(biāo)Tm (92 )內(nèi)標(biāo)能夠?qū)崿F(xiàn)96/384孔板的溫度均一矯正。PCR片段的Tm值范圍： 70-88 優(yōu)點(diǎn)：不需要探針，直接利用PCR產(chǎn)物針對(duì)已知突變位點(diǎn)進(jìn)行基因分型第15頁/共46頁第16頁/共46頁第17頁/共46頁第18頁/共46頁為何要使用溫度內(nèi)標(biāo)為何要使用溫度內(nèi)標(biāo)第19頁/共46頁第20頁/共46頁第21頁/共46頁第22頁/共46頁等對(duì)北京油雞A-FABP基因進(jìn)行小片段法基因分型，擴(kuò)增片段為56bp，灰色曲線顯示的是雜合型（CT），藍(lán)顏色和紅顏色曲線分別代表純合型CC和TT。第23頁/共46頁內(nèi)容提示內(nèi)容提示 高分辨熔解曲線（High Resolution Melti

7、ng）的定義 高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用 篩查突變篩查突變 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+內(nèi)標(biāo)法（ Small Amplicon Genotyping ） 非標(biāo)記探針法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 檢測(cè)甲基化檢測(cè)甲基化 HRM儀器第24頁/共46頁第25頁/共46頁第26頁/共46頁第27頁/共46頁Class 1 C:T, G:AClass 2 C:A, G:TClass 3 C:GClass 4 A:T第28頁/共46頁第29頁/共46頁第

8、30頁/共46頁第31頁/共46頁第32頁/共46頁David De ，Yong Song at el.Application og high-resolution DNA melting for genotyping and variant scanning of diploid and autotetraploid potato Mol Breeding (2010) 25:6790 rrRRRrMix Rr:rr by 1:1 RrrrMix RR:Rr by 1:1 RRRr第33頁/共46頁內(nèi)容提示內(nèi)容提示 高分辨熔解曲線（High Resolution Melting）的定義 高分

9、辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用 篩查突變篩查突變 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+內(nèi)標(biāo)法（ Small Amplicon Genotyping ） 非標(biāo)記探針法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析 檢測(cè)甲基化檢測(cè)甲基化 HRM儀器第34頁/共46頁Rosario Muleo（2009）等用HRM方法對(duì)三個(gè)品種的SSR DCA4進(jìn)行分析，DCA4的等位基因有131bp的重復(fù)序列，雜合等位基因的序列為131-133bp，分析結(jié)果如圖8所示，HRM曲線可以將純合樣品和雜合

10、樣品明顯的區(qū)分，其中一個(gè)等位基因只相差2bp。 三種顏色（淺灰，深灰、黑色）表明3種不同的品種。 Rosario Muleo等得出結(jié)論：HRM是一種快速、重復(fù)性高、成本低，操作簡(jiǎn)單，且可以應(yīng)用于其他物種的SNP檢測(cè)及SSR基因分型的方法。Rosario Muleo,Marir Chiara Colao,Dario Miano at el. 2009 Genome52:252-260第35頁/共46頁內(nèi)容提示內(nèi)容提示 高分辨熔解曲線（High Resolution Melting）的定義 高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用 篩查突變篩查突變 （mutation scanning） 基因分型基因

11、分型（Mutation Genotyping） 小片段+內(nèi)標(biāo)法（ Small Amplicon Genotyping ） 非標(biāo)記探針法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 檢測(cè)甲基化 HRM儀器第36頁/共46頁第37頁/共46頁第38頁/共46頁第39頁/共46頁內(nèi)容提示內(nèi)容提示 高分辨熔解曲線（High Resolution Melting）的定義 高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用 篩查突變篩查突變 （mutation scanning） 基因分型基因分型（Mutation Genotyping） 小片段+內(nèi)標(biāo)法（ Small A

12、mplicon Genotyping ） 非標(biāo)記探針法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） SSR分析分析 檢測(cè)甲基化檢測(cè)甲基化HRM儀器第40頁/共46頁2005LightScanner 96/38496/384 孔板孔板8 分鐘分鐘/板板2-6 秒秒/樣品樣品溫度均一性：溫度均一性： 0.15oC 數(shù)據(jù)采集速度：大于數(shù)據(jù)采集速度：大于100pts/秒秒 升溫速度：升溫速度： 0.1oC/秒秒2010LS32 32 樣品轉(zhuǎn)盤樣品轉(zhuǎn)盤, 玻璃毛細(xì)管玻璃毛細(xì)管HRM 檢測(cè)檢測(cè) 60 分鐘內(nèi)完成定量分鐘內(nèi)完成定量 PCR 和和 HRM 檢測(cè)檢測(cè) HRM檢測(cè)升

13、溫速度可以在檢測(cè)升溫速度可以在 0.05 0.90oC/秒之間調(diào)秒之間調(diào)節(jié)節(jié)在升溫速度小于在升溫速度小于0.3/秒時(shí)，溫度均一性：秒時(shí)，溫度均一性：0.05oC 數(shù)據(jù)采集速度：數(shù)據(jù)采集速度：20pts/秒秒400pts/秒（與升溫速度有秒（與升溫速度有關(guān)）關(guān)） 0.3oC/秒秒 升溫速度升溫速度= 67 pts/ 0.05oC/秒秒 升溫速度升溫速度 = 400 pts/ 第41頁/共46頁LunaProbesLunaProbes非標(biāo)記探針基因分型非標(biāo)記探針基因分型未知未知SNPSNP掃描掃描Small AmpliconSmall Amplicon小片段小片段基因分型基因分型第42頁/共46頁HRM分析流程分析流程在PCR反應(yīng)前加入 LCGreen 熒光染料時(shí)間大約時(shí)間大約2 2小時(shí)（包含試劑準(zhǔn)備）小時(shí)（包含試劑準(zhǔn)備）在LightScanner上進(jìn)行高分辨溶解曲線分析大約需要大約需要5-10 5-10 分鐘分鐘數(shù)據(jù)分析和處理大約需要大約需要5-10 5-10 分鐘分鐘PCR產(chǎn)物可以直接進(jìn)行下游的測(cè)序分析等（如需要）大約需要大約需要30-6030-60分鐘分鐘第43頁/共46頁LightScanner適于適于SNP分析分析1.速度、通量LightScanner 510分鐘完成96/384孔板的PCR產(chǎn)物檢測(cè)， 20000個(gè)SNP/天 2.可檢測(cè)未知、已知突變，