生物技術綜合大實驗

1、 2013-2014學年生命科學綜合大實驗GFP分離與純化 1.文獻綜述綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238個氨基酸組成，分子量是26.9kDa，最初是從維多利亞多管發(fā)光水母(Aequorea victoria )中分離出來的，在藍光照射下會發(fā)出綠色熒光。來源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分別有主要和次要的激發(fā)峰，它的發(fā)射峰在509nm，處于可見光譜的綠色區(qū)域，來源于海腎的GFP只在498nm有單個激發(fā)峰。GFP是典型的桶形結構，包含折疊和螺旋，將熒光基團包含在其中。嚴密的桶形結構保護著熒光基團，防止它被周圍環(huán)境淬滅，內(nèi)部面向桶形的

2、側鏈誘Ser65-Tyr66-Gly67三肽環(huán)化，導致熒光基團形成。北京時間10月8日下午5點45分，2008年諾貝爾化學獎揭曉，三位美國科學家，美國Woods Hole海洋生物學實驗室的Osamu Shimomura(下村修)、哥倫比亞大學的Martin Chalfie和加州大學圣地亞哥分校的Roger Y.Tsien（錢永?。┮虬l(fā)現(xiàn)并發(fā)展了綠色熒光蛋白（GFP）而獲得該獎項。下修村首次從Aequorea victoria 中分離出GFP。他發(fā)現(xiàn)該蛋白在紫外線下會發(fā)出明亮的綠光。Martin Chalfie證明了GFP作為多種生物學現(xiàn)象的發(fā)光遺傳標記的價值。在最初的一項實驗中，他用GFP使秀

3、麗隱桿線蟲的6個單獨細胞有了顏色。錢永健的主要成就在于讓人們理解了GFP發(fā)出熒光的機制。同時，他拓展出綠色之外的可用于標記的其他顏色，從而使科學家能夠對各種蛋白質和細胞施以不同的色彩。這一切，令在同一時間跟蹤多個不同的生物學過程成為了現(xiàn)實。2. 實驗器材2.1實驗材料：含GFP融合質粒，Top10菌株2.2實驗試劑：質粒提?。喝芤海?0mM 葡萄糖/10mM EDTA /25mM Tris-HCl，pH=8.0；溶液：0.2M NaOH/1% SDS；溶液：3M醋酸鉀/2M 醋酸；無水乙醇，75%乙醇，TE Buffer；轉化：0.1M預冷 CaCl2，LB培養(yǎng)基，氨芐青霉素，阿拉伯糖；GFP

4、提取：液氮，Lysis Buffer，飽和(NH4)2SO4溶液，溶菌酶；疏水作用層析柱材：苯基瓊脂糖凝膠CL-4B；離子交換柱層析柱材：DEAE+纖維素， Start Buffer(A液20mM Tris-HCl，pH7.0（透析液）) Elution buffer(B液20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.0)SDS-PAGE電泳：PEG10000，Loading Buffer，溴酚藍，丙烯酰胺，Tris，SDS，過硫酸銨，TEMED，Gly，SDS，甘油，-巰基乙醇，溴酚藍，甲醇，考馬斯亮藍，乙酸等2.3實驗儀器高速冷凍離心機,移液槍，超聲波破碎儀，梯度混合器，恒流泵,層析

5、柱,色譜儀,自動記錄儀,SDS-PAGE電泳裝置。3. 實驗方法3.1質粒提取1.取1.5mL菌液，12000rpm離心1min，棄上清液；2.加100L溶液，充分懸??；3.加200L溶液，溫和混勻，室溫5min；4.加150L溶液，混勻，冰浴5min；5.12000rpm離心8min，將上清加入一新的1.5ml EP管中；6.加800L無水乙醇至上清液中，混勻，-20放置10min，12000rpm離心8min，棄上清；7.70%乙醇洗DNA一次，離心棄上清；8.在超凈臺中吹干DNA（一般吹5-10min即可）；9.加40L TE Buffer溶解DNA，4備用。3.2感受態(tài)細胞的制備以及轉

6、化1.取1.5mL Top10菌液，在4 4000rpm離心10min，棄上清；2.加200L預冷的0.1M CaCl2懸浮沉淀（無菌操作），冰浴15min后4 4000rpm離心10min，棄上清；3.加200L 預冷的0.1M CaCl2懸浮沉淀（無菌操作），4備用；4.將1L質粒和感受態(tài)細胞混合，冰浴30min；5.42熱激90s；6.立即放在冰上3-5min；7.加入800L LB液體培養(yǎng)基，37 150rpm培養(yǎng)60min（使Top10恢復正常生長）；8.取200L菌液涂布在LB（Amp 100ng/ml，阿拉伯糖4mg/ml）培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)過夜。3.3擴大培養(yǎng)1.取含GFP質粒

7、的Top10平板并挑取單克?。ㄔ谧贤鉄粽丈湎掠芯G色熒光的菌落）；2.將挑取的單菌落接種于試管中（含4mL的LB液體培養(yǎng)基，100ng/ml的Amp和4mg/ml的阿拉伯糖）37，200rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（約3-4h）；3.將上述搖好的菌液，按1:100轉接至250mL LB液中（Amp工作濃度 100ng/ml，阿拉伯糖工作濃度2mg/ml），37，200rpm培養(yǎng)過夜。3.4細胞破碎1.將培養(yǎng)好的細菌3000g離心10min，紫外燈觀察棄上清，沉淀用液氮凍融；2.用30mL Lysis Buffer(50mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA)懸浮沉淀；3.向懸浮液中加

8、15mg溶菌酶，混勻后室溫溶解10min；4.400W功率下，超聲處理10min；5.將破碎液9000g離心15min，紫外燈觀察，留上清備用；6.選取合適的濃度破碎(NH4)2SO4沉淀GFP；一般(NH4)2SO4飽和度為30%時，雜蛋白的沉淀量最大，飽和度達到70%時GFP沉淀量達最大附：(NH4)2SO4濃度與含量表，體積為10ml；(NH4)2SO4飽和度10%20%30%40%50%60%70%80%90%(NH4)2SO4（g）0.561.141.762.433.133.94.725.616.627. 向上清中加5.28g(NH4)2SO4，充分溶解，室溫放置20min，9000

9、rpm離心15min，轉移上清至另一試管中，再加入6.88g(NH4)2SO4，充分混勻，室溫放置至少20min，9000rpm離心15min，棄上清，留沉淀備用；3.5疏水作用層析1.將沉淀的GFP，用10mL 2M (NH4)2SO4/Lysis Buffer，pH8.0溶解，9000rpm，離心10min，留上清；（2號樣品）2.用3倍體積平衡Buffer（2M(NH4)2SO4，pH8.0）平衡柱子；3.將步驟1中的上清液上柱，用3倍柱體積的Washing Buffer（1.3M(NH4)2SO4，pH8.0）洗柱子；4.用恒流泵泵TE Buffer（Elution Buffer：10

10、mM Tris, 1mM EDTA，pH8.0）洗柱，紫外燈檢查，GFP快流出時，準備收集；5.將收集液透析過夜。（3號樣品）3.6離子交換層析1.將透析后所得的透析液9000rpm離心10min，棄去沉淀（4）；2.用3倍體積的Start Buffer(A液)平衡柱子；3.將步驟1中所得的上清液上柱，再用3倍柱體積的Start Buffer洗柱子；4.梯度洗脫GFP，梯度液：Start Buffer(A液)、Elution Buffer(B液)，紫外燈觀察，GFP快流出來時，準備收集5.將收集液透析過夜(透析液為A液)。3.7凝膠過濾純化GFP1.將透析袋置入含PEG10000的培養(yǎng)皿中，濃

11、縮至體積約2mL；2.用3倍柱體積的20mM Tris-HCl，pH7.0平衡柱子；3.將步驟1中所得的GFP上柱，用20mM Tris-HCl，pH7.0洗柱子，紫外燈檢測，GFP快流出時收集備用。3.8 SDSPAGE將收集的各樣品加入等體積的2SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm離心10min，取上清-20保存?zhèn)溆谩?.按照電泳裝置的使用說明，裝好潔凈干燥的玻璃板。2.分離膠的制備按下列成分配制分離膠：ddH2O30%丙烯酰胺混合液1.5M Tris(pH8.8)10%SDS10%過硫酸銨TEMED8.2 mL6.68mL5.

12、0mL0.1 mL0.1 mL0.04 mL各成分加入后迅速旋渦混勻，用微量移液器將其小心地注入準備好的玻璃板間隙中，并為濃縮膠留出足夠空間。輕輕在頂層加入一薄層20%乙醇封頂，以防止空氣中的氧對凝膠聚合的抑制作用。凝膠聚合完成后，倒掉覆蓋的乙醇，用濾紙吸干凝膠頂端的乙醇。3.濃縮膠的制備按下列成分配制2mL 5%的積層膠：ddH2O30%丙烯酰胺混合液1.0M Tris(pH6.8)10%SDS10%過硫酸銨TEMED7.35mL1.3mL1.25mL0.1mL0.1mL0.1mL各成分加入后迅速旋渦混勻，用微量移液器將其灌注到分離膠上，灌滿后小心插入加樣梳，盡可能避免產(chǎn)生氣泡。4.待濃縮膠

13、凝固后，小心拔出梳子。5.將凝膠固定于電泳裝置上，加入足量的1Tris-甘氨酸電泳緩沖液，在加樣孔中分別加入20L各樣品。6.樣品在濃縮膠中電泳時，使用80V電壓，待溴酚藍帶進入分離膠后，將電壓升至120V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍帶到達分離膠的底部且開始泳出膠底面，關閉電源。7.卸下凝膠，將其浸泡在至少5倍體積的考馬斯亮藍R-250染色液（50%甲醇，0.05%考馬斯亮藍，10%乙酸，40%ddH2O）中，置水平搖床上室溫染色45min，之后取出凝膠并回收染色液，將凝膠浸泡于考馬斯亮藍脫色液（與染色液同，只是無考馬斯亮藍）中，在水平搖床上脫色1h，其間更換脫色液3-4次，直至凝膠脫色到條帶清晰為止

14、，觀察結果并拍照。（注：由于濃縮膠制備過程中凝固太快，所以最后未使用濃縮膠而只用分離膠進行SDS-PAGE。）思考題1. 實驗純化效果如何？如果要得到較純的GFP，你會采用哪些方法進一步純化？答：實驗純化效果請見實驗結果分析。2. SDS-PAGE的樣品緩沖液中有哪些成分？它們有什么作用？為什么要將樣品和緩沖液混合后煮沸？答：SDS-PAGE的樣品緩沖液的主要成分有SDS，甘油，溴酚藍和-巰基乙醇，其中SDS的作用主要是使蛋白質變形，斷裂蛋白質分子間和分子內(nèi)的氫鍵，使蛋白質分子去折疊，破壞蛋白質的二級和三級結構；甘油是增加密度，使蛋白質能很好的沉淀在下面；溴酚藍作為指示前沿，防止電泳時間過長；-巰基乙醇作為保護劑，防止空氣中的氧對蛋白質的氧化作用，同時還能斷裂蛋白質分子中半胱氨酸殘基中的二硫鍵。3. 常用的交聯(lián)葡聚糖有G-25、G-50、G-70其中的25、50、75指的是什么？答：交聯(lián)葡聚糖G-25、G-50、G-70中的25、50、75指的是1g交聯(lián)葡聚糖干膠膨脹時所吸收水克數(shù)的10倍，如G-25中的25指1g這種交