實(shí)驗(yàn)9 毛細(xì)管電泳法在材料分析中的應(yīng)用(黃寶美)

1、實(shí)驗(yàn)九 毛細(xì)管電泳法在材料分析中的應(yīng)用一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.進(jìn)一步理解毛細(xì)管電泳的基本原理；2.熟悉毛細(xì)管電泳儀器的構(gòu)成；3.了解影響毛細(xì)管電泳分離的主要操作參數(shù)。二 實(shí)驗(yàn)原理1.電泳淌度毛細(xì)管電泳（CE）是以電滲流 (EOF)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一種液相微分離技術(shù)。離子在自由溶液中的遷移速率可以表示為：n = mE（1）式中n是離子遷移速率，m為電泳淌度，E為電場(chǎng)強(qiáng)度。對(duì)于給定的荷電量為q的離子，淌度是其特征常數(shù)，它由離子所受到的電場(chǎng)力（FE）和通過介質(zhì)所受到的摩擦力（FF）的平衡所決定。FE = qE（2）對(duì)于球形離子：FF = -6

2、phrn（3）式中h為介質(zhì)粘度，r為離子的流體動(dòng)力學(xué)半徑。在電泳過程達(dá)到平衡時(shí)，上述兩種力方向相反，大小相等：qE = -6phrn（4）因此，離子的電泳淌度與其荷電量呈正比，與其半徑及介質(zhì)粘度呈反比。帶相反電荷的離子其電泳淌度的方向也相反。需要指出，我們?cè)谖锢砘瘜W(xué)手冊(cè)中可以查到的離子淌度常數(shù)是絕對(duì)淌度，即離子帶最大電量時(shí)測(cè)定并外推至無限稀釋條件下所得到的數(shù)值。在電泳實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的值往往與此不同，故我們將實(shí)驗(yàn)值稱為有效淌度（me）。有些物質(zhì)因?yàn)榻^對(duì)淌度相同而難以分離，但我們可以通過改變介質(zhì)的pH值，使離子的荷電量發(fā)生改變。這樣就可以使不同離子具有不同有效淌度，從而實(shí)現(xiàn)分離。下文中所提到的電泳淌度

3、除特別說明外，均指有效淌度。2.電滲流和電滲淌度電滲流（EOF）是CE中最重要的概念，指毛細(xì)管內(nèi)壁表面電荷所引起的管內(nèi)液體的整體流動(dòng)，來源于外加電場(chǎng)對(duì)管壁溶液雙電層的作用。Zeta電勢(shì)主要取決于毛細(xì)管表面電荷的多寡。一般來說，pH越高，表面硅羥基的解離程度越大，電荷密度越大，電滲流速率就越大。除了受pH的影響外，電滲流還與表面性質(zhì)（硅羥基的數(shù)量、是否有涂層等）、溶液離子強(qiáng)度有關(guān)，雙電層理論認(rèn)為，增加離子強(qiáng)度可以使雙電層壓縮，從而降低Zeta電勢(shì)，減小電滲流。此外，溫度升高可以降低介質(zhì)粘度，增大電滲流。電場(chǎng)強(qiáng)度雖然不影響電滲淌度，但卻可改變電滲流速率。顯然，電場(chǎng)強(qiáng)度越大，電滲流速率越大。由上可知

4、，電滲流的方向一般是從正極到負(fù)極，然而，在溶液中加入陽離子表面活性劑后，由于毛細(xì)管表面強(qiáng)力吸附陽離子表面活性劑的親水端，而陽離子表面活性劑的疏水端又會(huì)緊密結(jié)合一層表面活性劑分子，結(jié)果就形成了帶負(fù)電的表面，雙電層Zeta電勢(shì)的極性發(fā)生了反轉(zhuǎn)，最后使電滲流的方向發(fā)生了變化。在分析小分子有機(jī)酸時(shí)，這是常用的電滲流控制技術(shù)。電滲流的一個(gè)重要特性是具有面流型。由于引起流動(dòng)的推動(dòng)力在毛細(xì)管的徑向上均勻分布，所以管內(nèi)各處流速接近相等。其優(yōu)點(diǎn)是徑向擴(kuò)散對(duì)譜帶擴(kuò)展的影響非常小。與此形成鮮明對(duì)照的是高壓泵驅(qū)動(dòng)的拋物線流型（如在HPLC中），由于管內(nèi)徑向上各處的流速不同，使得譜帶峰形變寬。這也是與HPLC相比，CE

5、具有更高分離效率的一個(gè)重要原因。電滲流的另一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是可以使幾乎所有被分析物向同一方向運(yùn)動(dòng)，而不管其電荷性質(zhì)如何。這是因?yàn)殡姖B淌度一般比離子的電泳淌度大一個(gè)數(shù)量級(jí)，故當(dāng)離子的電泳淌度方向與電滲流方向相反時(shí)，仍然可以使其沿電滲流方向遷移。這樣，就可在一次進(jìn)樣分析中，同時(shí)分離陽離子和陰離子。中性分子由于不帶電荷，故隨電滲流一起運(yùn)動(dòng)。如果對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行修飾可以降低電滲流，而被分析物的淌度則不受影響。在此情況下，陰陽離子有可能向不同的方向遷移。3.毛細(xì)管電泳的儀器及操作其組成部分主要是高壓電源、緩沖液瓶（包括樣品瓶）、毛細(xì)管和檢測(cè)器。下面分別簡(jiǎn)要討論之。高壓電源是為分離提供動(dòng)力的，商品化儀器的輸出

6、直流電壓一般為030kV，也有文獻(xiàn)報(bào)道采用60kV以至90kV電壓的。大部分直流電源都配有輸出極性轉(zhuǎn)換裝置，可以根據(jù)分離需要選擇正電壓或負(fù)電壓。緩沖液瓶多采用塑料（如聚丙烯）或玻璃等絕緣材料研制成，容積為13mL。考慮到分析過程中正負(fù)電極上發(fā)生的電解反應(yīng)，體積大一些的緩沖液瓶有利于pH的穩(wěn)定。進(jìn)樣時(shí)毛細(xì)管的一端伸入樣品瓶，采用壓力或電動(dòng)方式將樣品加載到毛細(xì)管入口，然后將樣品瓶換為緩沖液瓶，接通高壓電源開始分析。4.毛細(xì)管電泳的分離模式CE有6種常用的分離模式。其中毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MEKC）和毛細(xì)管電色譜（CEC）最為常用。本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容為CZE。表1 6種CE分離模

7、式的分離依據(jù)及應(yīng)用范圍分離模式分離依據(jù)應(yīng)用范圍毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）溶質(zhì)在自由溶液中的淌度差異可解離的或離子化合物、手性化合物及蛋白質(zhì)、多肽等毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜（MECC）溶質(zhì)在膠束與水相間分配系數(shù)的差異中性或強(qiáng)疏水性化合物、核酸、多環(huán)芳烴、結(jié)構(gòu)相似的肽段毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）溶質(zhì)分子大小與電荷/質(zhì)量比差異蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）等電點(diǎn)差異蛋白質(zhì)、多肽毛細(xì)管等速電泳（CITP）溶質(zhì)在電場(chǎng)梯度下的分布差異(移動(dòng)界面)同CZE，電泳分離的預(yù)濃縮毛細(xì)管電色譜（CEC）電滲流驅(qū)動(dòng)的色譜分離機(jī)制同HPLC毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）是最簡(jiǎn)單的CE模式，因?yàn)槊?xì)管中的分離介質(zhì)只是

8、緩沖液。在電場(chǎng)的作用下，樣品組分以不同的速率在分立的區(qū)帶內(nèi)進(jìn)行遷移而被分離。由于電滲流的作用，正負(fù)離子均可以實(shí)現(xiàn)分離。在正極進(jìn)樣的情況下，正離子首先流出毛細(xì)管，負(fù)離子最后流出。中性物質(zhì)在電場(chǎng)中不遷移，只是隨電滲流一起流出毛細(xì)管，故得不到分離。在CZE中，影響分離的因素主要有緩沖液的種類、濃度和pH值、添加劑、分析電壓、溫度、毛細(xì)管的尺寸和內(nèi)壁改性等。緩沖液種類的選擇主要考慮其pKa值要與分析所用pH匹配，另外，有的緩沖液與樣品組分之間有特殊的相互作用，可提高分析選擇性。比如，分析多羥基化合物時(shí)，多用硼酸緩沖液，因?yàn)榕鹚岣膳c羥基形成絡(luò)合物，有利于提高分離效率。增大緩沖液的濃度一般可以改善分離，

9、但電滲流會(huì)降低，因而延長(zhǎng)了分析時(shí)間，過高的鹽濃度還會(huì)增加焦耳熱。緩沖液的pH主要影響電滲流的大小和被分析物的解離情況，進(jìn)而影響被分析物的淌度，是CZE分析中最重要的操作參數(shù)之一。緩沖液添加劑多為有機(jī)試劑，如甲醇、乙腈、尿素、三乙胺等，其作用主要是增加樣品在緩沖液中的溶解度，抑制樣品組分在毛細(xì)管壁的吸附，改善峰形。提高分析電壓有利于提高分離效率和縮短分析時(shí)間，但可能造成過大的焦耳熱。溫度的變化可以改變緩沖液的粘度，從而影響電滲流。毛細(xì)管內(nèi)徑越小，分離效率越高，但樣品容量越低；增加毛細(xì)管長(zhǎng)度可提高分離效率，但延長(zhǎng)了分析時(shí)間。有時(shí)為了改善分離，要對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行改性，比如采用涂層技術(shù)。5.毛細(xì)管電泳

10、的基本參數(shù)CE中的分析參數(shù)可以用色譜中類似的參數(shù)來描述，比如與色譜保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)的有遷移時(shí)間，定義為一種物質(zhì)從進(jìn)樣口遷移到檢測(cè)點(diǎn)所用的時(shí)間，遷移速率（n）則是遷移距離（l，即被分析物質(zhì)從進(jìn)樣口遷移到檢測(cè)點(diǎn)所經(jīng)過的距離，又稱毛細(xì)管的有效長(zhǎng)度）與遷移時(shí)間（t）之比：實(shí)驗(yàn)中可以采用一種中性化合物，如二甲亞砜或丙酮等，來單獨(dú)測(cè)定電滲流淌度，然后求得被分析物的有效淌度。例如，圖4是一個(gè)混合物的分離結(jié)果，其中三個(gè)峰分別為陽離子（t = 39.5s）、中性化合物（t = 66.4s）和陰離子（t = 132.3s）。實(shí)驗(yàn)用毛細(xì)管總長(zhǎng)度為48.5cm，有效長(zhǎng)度（從進(jìn)樣口到檢測(cè)點(diǎn)的距離）為40cm，施加電壓為2

11、0kV。根據(jù)上述公式，我們便可以計(jì)算出電滲淌度以及不同離子的表觀淌度和有效淌度。注意，陰離子的有效淌度為負(fù)值，因?yàn)槠潆娪咎识扰c電滲淌度的方向相反。三 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑每八人一組共用一臺(tái)電泳儀。5 mL移液管2只，1mL 移液管共2支，分別標(biāo)上四種標(biāo)樣的標(biāo)簽，兩組公用。每組10 mL容量瓶2個(gè)，滴管2支，分別標(biāo)上標(biāo)準(zhǔn)、未知的標(biāo)簽。塑料樣品管共16個(gè)，每組8個(gè)，分別用于標(biāo)準(zhǔn)樣品、未知樣品、三種緩沖溶液、NaOH、水和廢液，做好標(biāo)號(hào)。滴瓶一共5個(gè)，分別裝三種緩沖液(buffer)、1mol/L的NaOH和乙醇。鑷子、洗瓶、吸耳球、試管架、塑料樣品管架、廢液燒杯每組一個(gè)。剪刀一把，記號(hào)筆一支，濾紙。標(biāo)樣

12、：苯甲醇、苯甲酸、水楊酸、對(duì)氨基水楊酸，均溶于二次水中，濃度1.00 mg/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)品，混合稀釋作為標(biāo)樣。另有一個(gè)預(yù)先配制的未知濃度混合樣品。緩沖溶液(buffer)：10 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4 1:1緩沖溶液(NaH2PO4和Na2HPO4 各5mMol/L)，20 mmol/L HAc-NaAc pH為6 (HAc:NaAc大約1:15)緩沖溶液，20 mmol/L Na2B4O7緩沖溶液。1mol/L NaOH溶液，二次去離子水。四 實(shí)驗(yàn)步驟：1.儀器的預(yù)熱和毛細(xì)管的沖洗在實(shí)驗(yàn)教師的指導(dǎo)下，打開儀器和配套的工作站。工作溫度設(shè)置為30，不加電壓，沖洗毛細(xì)管，順

13、序依次是：1 mol/L NaOH溶液5 min，二次水5 min，10 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4 1:1緩沖溶液5 min，沖洗過程中出口(outlet)對(duì)準(zhǔn)廢液的位置，并不要升高托架。2.混合標(biāo)樣的配制毛細(xì)管沖洗的同時(shí)，配制混合標(biāo)樣。分別用5ml的移液管移取3ml苯甲醇、3ml苯甲酸，用1ml的移液管移取1ml水楊酸、0.5ml對(duì)氨基水楊酸于10ml的容量瓶中，定容，得到苯甲醇、苯甲酸、水楊酸、對(duì)氨基水楊酸濃度分別為300g/mL、300g/mL、100g/mL、50.0g/mL的混合溶液作為混合標(biāo)樣。（試思考為什么不采用濃度一樣的混合溶液作為混合標(biāo)樣？）3.混合標(biāo)樣的

14、測(cè)定待毛細(xì)管沖洗完畢，取1 ml混合標(biāo)樣，置于塑料樣品管，放在電泳儀進(jìn)口(Inlet)托架上sample的位置，然后調(diào)整出口(outlet)對(duì)準(zhǔn)緩沖溶液(buffer)，升高托架并固定，然后開始進(jìn)樣。進(jìn)樣壓力30 mbar，進(jìn)樣時(shí)間5 s。進(jìn)樣后將進(jìn)口(Inlet)托架的位置換回緩沖溶液(buffer)，切記換回buffer的位置！選擇方法2004CE.mtw，修改合適的文件說明，然后開始分析，電壓25 kV，時(shí)間約10 min。4.未知濃度混合樣品的測(cè)定方法與條件同上，測(cè)試未知濃度混合樣品，分析時(shí)間約10 min。5.不同緩沖溶液下遷移時(shí)間的變化未知濃度混合樣品的測(cè)定完畢后，沖洗毛細(xì)管，順序

15、依次是：1 mol/L NaOH溶液5 min，二次水5 min，然后更換進(jìn)出口兩端的緩沖溶液為20 mmol/L Na2B4O7，沖洗5 min；并在此條件下測(cè)試未知濃度混合樣品，電壓25 kV，時(shí)間約10 min。按照前面的順序再次沖洗毛細(xì)管，再次更換進(jìn)出口兩端的緩沖溶液為10 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4 pH為6，沖洗5 min；并在此條件下測(cè)試未知濃度混合樣品，電壓25 kV，時(shí)間約15 min。6.完成實(shí)驗(yàn)以后，用水沖洗毛細(xì)管10 min，一天中的第二組(4:00-7:00)的同學(xué)用水沖洗以后再用空氣吹干10 min。7.打印報(bào)告，清理實(shí)驗(yàn)臺(tái)。五 數(shù)據(jù)處理：1.根據(jù)

16、電泳的原理，判斷兩組混合標(biāo)樣中4個(gè)峰各自的歸屬(需要查找被分析物的pKa值)，找到在未知濃度混合樣品中與之遷移時(shí)間一致的峰。2.按照已知濃度峰的積分面積之比折算未知濃度混合樣品中各個(gè)組分的濃度（外標(biāo)定量法）。3.計(jì)算各個(gè)組分的表觀淌度和有效淌度，并說明哪個(gè)組分可以作為電滲流標(biāo)記物。本次CE實(shí)驗(yàn)使用的毛細(xì)管總長(zhǎng)度L50cm，有效長(zhǎng)度l40.5cm。4.根據(jù)電泳的原理，判斷在另外兩種緩沖溶液下，各個(gè)峰的歸屬，并對(duì)各個(gè)組分遷移時(shí)間的變化做出合理分析和討論。六 注意事項(xiàng)：1.沖洗毛細(xì)管時(shí)禁止在毛細(xì)管上加電壓；不允許更改講義上給定的工作電壓，也不建議改變進(jìn)樣時(shí)間。2.樣品和緩沖溶液之間的切換是手動(dòng)的，在實(shí)驗(yàn)過程中要隨時(shí)注意是不是放在正確位置；如果在分析時(shí)將樣品或者洗滌液當(dāng)作緩沖溶液，請(qǐng)停止分析并重新用對(duì)應(yīng)緩沖溶液沖洗管路10 min。因?yàn)殡娪臼切枰谕粋€(gè)下午和其他