感受態(tài)細(xì)胞的制備的實(shí)驗(yàn)步驟

1、CaCl2感受態(tài)細(xì)胞的制備的實(shí)驗(yàn)步驟1 .前夜接種受體菌DH5a或DH10B,挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37C搖床培養(yǎng)過夜約16小時；2 .取1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100mlLB培養(yǎng)基中,在37c搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時250-300rpm;3 .將0.1MCaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作4 .吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中,在冰上冷卻10分鐘；5 .4c下3000g冷凍離心5分鐘；6 ,棄去上清,參加100111預(yù)冷0.1MCaCl2溶液,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細(xì)胞重新懸浮,在冰放置20分鐘；7 .4c下3000g冷凍離心5分鐘；8

2、.棄去上清,參加100111預(yù)冷0.1MCaCl2溶液,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細(xì)胞重新懸??；9 .細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或添加冷凍保護(hù)劑15%-20%甘油后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆?0o電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟1 .前夜接種受體菌DH5a或DH10B,挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37C搖床培養(yǎng)過夜；2 .取2ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于200mlLB培養(yǎng)基中,在37c搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6約2.5- 3小時；3 .將菌液迅速置于冰上.以下步驟務(wù)必在超凈工作臺和冰上操作4 .吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中,在冰上冷卻10分鐘；5 .4c下3000g冷凍離

3、心5分鐘；6 .棄去上清,參加1500g1冰冷的10%甘油,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細(xì)胞重新懸??；7 .4c下3000g冷凍離心5分鐘8 .棄去上清,參加750g1冰冷的10%甘油,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細(xì)胞重新懸浮；9 .4c下3000g冷凍離心5分鐘10 .參加20冰冷10%的甘油,用移液器輕輕上下吸動打勻,使細(xì)胞重新懸浮；11 .立即使用或迅速置于-70C超低溫保存.附注：影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實(shí)際操作過程中應(yīng)注意的事項(xiàng)：1 .細(xì)菌的生長狀態(tài)：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長狀態(tài)和密度,盡量使用對數(shù)生長期的細(xì)胞一般通過檢測OD600來限制.DH5x菌株OD600為0.5時細(xì)胞

4、密度是5X107/ml；2 .所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行；3 .經(jīng)CaCl2處理的細(xì)胞,在低溫條件下,一定的時間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時間的推移而增加,24小時到達(dá)最高,之后轉(zhuǎn)化率再下降這是由于總的活菌數(shù)隨時間延長而減少造成的；4 .化合物及無機(jī)離子的影響：在Ca2+的根底上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子如Mn2+或Co2+、DMSO或復(fù)原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌,可使轉(zhuǎn)化效率大大提升100-1000倍；5 .所使用的器皿必須干凈.跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率；6 .質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA;7 .一定范圍內(nèi),轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比；感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)

5、化效率的檢驗(yàn)為確定感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率,可將一定量的完整質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中,取一局部轉(zhuǎn)化的細(xì)菌,涂布到選擇培養(yǎng)基上,可用菌落生長單位/“gDNA,按下面的方法計(jì)算感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率.計(jì)算公式：轉(zhuǎn)化效率=產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量.例如,取1屋(0.1ng/g1)完整的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100Ml的感受態(tài)細(xì)胞.向轉(zhuǎn)化反響液中參加900Ml培養(yǎng)液,讓細(xì)菌恢復(fù)一小段時間,取100Ml鋪板.培養(yǎng)過夜,產(chǎn)生1000個菌落.轉(zhuǎn)化0.1ngDNA,用SOC稀釋到1000Ml后,取1/10涂平板,那么涂平板共用0.01ngDNA質(zhì)粒,所以轉(zhuǎn)化率=1000克隆/0.01ngDNA=105cfu/ng=108c

6、fu/gg.轉(zhuǎn)化效率1X106cfu/ggDNA可滿足普通的亞克隆實(shí)驗(yàn)；1X107cfu/ggDNA用于作更復(fù)雜的亞克隆,有限量的DNA的轉(zhuǎn)化,T-克隆實(shí)驗(yàn)；構(gòu)建文庫和突變要求用的轉(zhuǎn)化的效率為>1X108cfu/ggDNA高效感受態(tài)細(xì)胞制備方法一：效率非常高,一般可到10*8,好時可到10*9,特別適宜于大片段與文庫構(gòu)建及珍貴材料的連接轉(zhuǎn)化.實(shí)驗(yàn)試劑：A液：1M,MnCl2:B液：1M,HEPES,pH=6.2-6.8,用無菌水配,配后不需滅菌；C液稱取CaCl20.10g,KCl1.18g,全部轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶,然后參加46ml三蒸水,輕輕振蕩使所有組分充分溶解.將瓶塞蓋上并用牛皮紙、棉

7、線包扎,然后放入滅菌鍋121C高壓滅菌備用.取1管B液(0.6ml),全部參加C液(46ml)中,混勻后,再用1ml移液器參加3.3mlA液,混勻冰浴即可使用.實(shí)驗(yàn)步驟：1、劃線得到單菌落,37C培養(yǎng)箱培養(yǎng)約17小時.2、挑取2-4個形態(tài)飽滿的單菌落接種于裝有100mlSOB培養(yǎng)基的三角瓶,37C劇烈振蕩(300rpms)培養(yǎng)3-4小時.3、將培養(yǎng)溫度調(diào)至18c劇烈振蕩(3280rpms)培養(yǎng),其余與普通感受態(tài)差不多.4、每管參加4mlTB緩沖液,輕輕振蕩,使菌體重新懸浮.5、參加280mlDMSO(可用國產(chǎn)分析純),混勻后分裝入1.5mlEP管,冰上靜置15分鐘.6、用紗布將所有裝有感受態(tài)的

8、EP管包好,用棉線系好后放入液氮中速凍,在液氮中靜置12小時以上.7、 取出感受態(tài)放入-70C超低溫冰箱備用.考前須知：1、潔凈是最重要的.無菌都無所謂,在操作臺上可正常操作.2、離心力要注意不要超過2500g,建議1500-2000g5min.3、涂板不要覺得不勻而屢次反復(fù),輕輕在平板上帶一下感覺板上大局部地方走過即可,特別在冰箱中保存過或在溫箱中溫浴2小時以上的板.4、涂完后建議空氣晾干(20-30分鐘)這樣會減少衛(wèi)星菌落出現(xiàn).5、預(yù)冷是必要的.整個過程的低溫也并非特別重要.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化中的影響因素1、感受態(tài)細(xì)胞的概念重組DNA分子體外構(gòu)建完成后,必須導(dǎo)入特定的宿主受體細(xì)胞

9、,使之無性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀,這個導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化.在原核生物中,轉(zhuǎn)化是一個較普遍的現(xiàn)象,在細(xì)胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生,一方面取決于供體菌與受體菌兩者在進(jìn)化過程中的親緣關(guān)系,另一方面還與受體菌是否處于一種感受狀態(tài)有著很大的關(guān)系.所謂的感受態(tài),即指受體或者宿主最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài),它是由受體菌的遺傳性狀所決定的,同時也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響.cAMP可以使感受態(tài)水平提升一萬倍,而Ca2也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用.細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期,新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵.制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時,可

10、參加占總體積15%的無菌甘油或-70C保存有效期6個月.2、轉(zhuǎn)化的概念及原理在基因克隆技術(shù)中,轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi),使之獲得新的遺傳特性的一種方法.它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的根本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法如：電擊法,CaCl2等化學(xué)試劑法處理后,使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化,成為能容許外源DNA分子通過的感受態(tài)細(xì)胞.進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀.大腸桿菌的轉(zhuǎn)化常用化學(xué)法CaCl2法,該法最先是由Cohen于1972年發(fā)現(xiàn)的.其原理是細(xì)菌處于0C,CaCl2的低滲溶液中,菌細(xì)胞膨脹

11、成球形,轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)月外表,經(jīng)42C短時間熱沖擊處理,促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物,在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后,球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值,被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中,重組子中基因得到表達(dá),在選擇性培養(yǎng)基平板上,可選出所需的轉(zhuǎn)化子.Ca2處理的感受態(tài)細(xì)胞,其轉(zhuǎn)化率一月能到達(dá)5X1062x107轉(zhuǎn)化子/ug質(zhì)粒DNA,可以滿足一般的基因克隆試驗(yàn).如在Ca2的根底上,聯(lián)合其它的二價(jià)金屬離子如Mn2、Co2、DMSO或復(fù)原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌,那么可使轉(zhuǎn)化率提升1001000倍.化學(xué)法簡單、快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好,菌株適用范圍廣,感受態(tài)細(xì)菌可以在-70C保存,因此被廣泛用于

12、外源基因的轉(zhuǎn)化.除化學(xué)法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外,還有電擊轉(zhuǎn)化法,電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感受態(tài),依靠短暫的電擊,促使DNA進(jìn)入細(xì)菌,轉(zhuǎn)化率最高能到達(dá)1091010轉(zhuǎn)化子/ug閉環(huán)DNA.因操作簡便,愈來愈為人們所接受.3、感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化中的影響因素、細(xì)胞的生長狀態(tài)和密度最好從-70C或-20C甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液.不要用已經(jīng)過屢次轉(zhuǎn)接,及貯存在4C的培養(yǎng)菌液.細(xì)胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5X107個左右為佳.即應(yīng)用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細(xì)菌,可通過測定培養(yǎng)液的OD600限制.對TG1菌株,OD600為0.5時,細(xì)胞密度在5X107個/ml左右.應(yīng)注意OD600

13、值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同.密度過高或缺乏均會使轉(zhuǎn)化率下降.此外,受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株,即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株.并且受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配.、質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的,轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)參加的外源DNA的量過多或體積過大時,那么會使轉(zhuǎn)化率下降.一般地,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%,1ng的cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細(xì)胞到達(dá)飽和.對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言,分子量大的轉(zhuǎn)化效率低,實(shí)驗(yàn)證實(shí),大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化.止匕外,重組DN

14、A分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān),環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10100倍,因此重組DNA大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子.整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行,所用器皿,如離心管,移液槍頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理所有的試劑都要滅菌,且注意預(yù)防被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染,否那么均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入.、整個操作均需在冰上進(jìn)行,不能離開冰浴,否那么細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會降低.重組DNA轉(zhuǎn)化目的：在體外連接組裝而成的重組DNA分子只能轉(zhuǎn)入適宜的受體細(xì)胞,才能大量地進(jìn)行復(fù)制、增殖和表達(dá).通過實(shí)驗(yàn)學(xué)會重組DNA轉(zhuǎn)化的最根本的操作以及如何提升轉(zhuǎn)化效率的根本思路.原理：帶有外源DN

15、A片段的重組體分子在體外構(gòu)建成后,需要導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)進(jìn)行繁殖或表達(dá)出具有一定生物活性的蛋白.能夠作為重組體轉(zhuǎn)化的受體,主要有動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、微生物細(xì)胞等.導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑重要有轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染,顯微注射和電穿孔等多種不同的方式.可以根據(jù)不同的受體選擇不同的導(dǎo)入方式.一般情況下,細(xì)菌一類的原核生物和酵母這樣的低等真核細(xì)胞可用轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入,而高等動植物細(xì)胞那么需采用顯微注射或電穿孔來進(jìn)行.細(xì)菌外表通過CaCl2處理后,局部失去細(xì)胞壁或細(xì)胞壁溶解,DNA分子能夠通過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞.其進(jìn)入細(xì)胞的方式是完整的雙鏈DNA分子首先吸附到細(xì)胞外表,雙鏈DNA分子解鏈變成單鏈,單鏈DNA分子一條進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)

16、,另一條被降解.進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的單鏈DNA那么復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA,隨同復(fù)制子同時復(fù)制,并被轉(zhuǎn)錄譯.儀器與主要試劑：一儀器1 .隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱2 .超凈工作臺3 .高速冷凍離心機(jī)4 .水浴鍋二主要試劑1. .LB液體培養(yǎng)基：1%蛋白陳、0.5%酵母提取物、1%NaCl,用5mol/LnaOH調(diào)節(jié)PH值至7.4,于103.42kPa15磅滅菌20分鐘.2. LB固體培養(yǎng)基：在配制的液體培養(yǎng)基三角燒瓶中參加2克瓊脂,于103.42kPa15磅滅菌20分鐘.3. 抗菌素：1氨葦青霉素Amp用前在無菌試管中,用滅菌水配制,母液濃度為100mg/ml.2鏈霉素Str用前在無菌試管中,用滅菌水配制,母液

17、濃度為50mg/ml.4. 100mmol/LCaCl2溶液：稱取無水CaCl25.6克,加重蒸水至500毫升,于103.42kPa15磅滅菌20分鐘.5. 50%的PEG6000溶液：稱取50克聚乙二醇6000加重蒸水溶解,定容至100毫升,103.42kPa15磅滅菌20分鐘.實(shí)驗(yàn)方法用CaCl2制備新鮮的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法：感受態(tài)細(xì)菌制備1挑取在平板上活化的菌落接種于2毫升LB培養(yǎng)液中,在370C培養(yǎng)過夜.2按1%挑取過夜培養(yǎng)菌接種于50mlLB培養(yǎng)液中,370C振蕩培養(yǎng)22個半期小時OD600約在0.20.4.3培養(yǎng)物放冰浴中冷卻10分鐘.4分裝離心管中,40C5000rpm離心5min

18、,收集菌體,培養(yǎng)液盡量倒干凈.（5） 把菌體懸浮于10ml的100mmol/LCaCl2溶液,置冰浴中20min,40C5000rpm離心5min,收集菌體.(6)再將菌體懸浮于1-2ml的100mmol/LCaCl2溶液中,40C保存,12-24小時后即可作為感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化.轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(7)取200ml感受態(tài)菌,參加待轉(zhuǎn)化的重組DNA(體積應(yīng)小于10ml,DNA<50ng)混勻后置冰浴中30min(一般同時要做陽性對照和陰性對照.陽性對照為參加量的未重組質(zhì)粒DNA的感受態(tài)菌,用于檢測轉(zhuǎn)化效率.陰性對照為完全不加質(zhì)粒DNA的的感受態(tài)菌,用于檢測感受態(tài)細(xì)菌有無污染及檢測抗生素的活性).(

19、8)放入冰浴中30min,轉(zhuǎn)入420C水浴90s,再冰浴1-2min,參加培養(yǎng)液800ml,放370C振蕩培養(yǎng)45min.(9)將適當(dāng)體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞均勻鋪于平皿上.(10)待平皿中液體吸收后,倒置平皿,于370C培養(yǎng)12-16小時可出現(xiàn)菌落.雙酶切連接反響之全攻略雙酶切連接反響之全攻略前一陣子一直在做雙酶切質(zhì)粒重組,失敗了很屢次,不過很快改善了實(shí)驗(yàn)方法,用2周重組了14個質(zhì)粒.現(xiàn)就自己的體會,結(jié)合丁香園戰(zhàn)友的珍貴經(jīng)驗(yàn),談一下質(zhì)粒重組的一些個人經(jīng)驗(yàn).1、回收PCR產(chǎn)物：在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時候,給引物兩端設(shè)計(jì)好酶切位點(diǎn),一般說來,限制酶的選擇非常重要,盡量選擇粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶

20、,如BamHI,HindIII,提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER,以及各酶在公用BUFFER里的效率.選好酶切位點(diǎn)后,在各個酶的兩邊加上保護(hù)堿基.雙酶切時間及其體系：需要強(qiáng)調(diào)的是很多人建議酶切過夜,其實(shí)完全沒有必要,我一般酶切3個小時,其實(shí)1個小時已經(jīng)足夠.應(yīng)用大體系,如100微升.純化問題：純化PCR產(chǎn)物割膠還是柱式,我推薦柱式,由于割膠手法不準(zhǔn),很容易割下大塊的膠,影響純化效率.現(xiàn)在的柱式純化號稱可以祛除引物,既然如此,酶切掉的幾個堿基肯定也會被純化掉了.所以,PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物的純化均可應(yīng)用柱式純化.我用的是TAKARA的純化柱試劑盒酶量的問題：以TAKARA的為例,其對

21、1單位酶的定義如下：在50gl反響液中,30c溫度下反響1小時,將1gg的人DNA完全分解的酶量定義為1個活性單位(U).而該酶濃度約為15單位/微升,在除外酶降解的因素外,該酶可分解15Vg的DNA,而一般從1-4ml菌液提出的DNA約為3“g,而PCR純化后的產(chǎn)物(50體系)約為3“g,所以即便全部加進(jìn)去,只要純化的質(zhì)量好,酶切完全切得動.2、酶切、回收后的PCR產(chǎn)物與載體的連接摩爾比的計(jì)算,很多人憑經(jīng)驗(yàn)也可以.但對于初學(xué)者從頭認(rèn)真計(jì)算那么非常有必要.回收的載體片段：回收的PCR產(chǎn)物片段=1:10,一般取前者0.03pmol,后者取0.3pmol.pmol為單位的DNA轉(zhuǎn)換為為四單位的DN

22、A:(Xpmolesx長度bpx650)/1,000,000(注：長度bpx650是該雙鏈DNA的分子量)所得數(shù)值即為也可以直接用這個公式套.1pmol1000bpDNA=0.66gg,如載體是5380bp,貝U0.03pmol為0.03X5.38X0.66=0.106524/.測DNA濃度可以在專用機(jī)子上測,注意OD值,一般約1.8-2.0.另外,如果嫌麻煩,也可用MARKER進(jìn)行估測,如MARKER2000,5微升的MARKER每個條帶約50ng.連接反響：TAKARA的連接酶上的說明寫的過夜,而其對連接酶單位的定義為：在20從1的連接反響體系中,6gg的人DNA-HindIII的分解物在

23、16c下反響30分鐘時,有90%以上的DNa段被連接所需要的酶量定義為1個活性單位(U).而它的濃度為350U/,所以完全夠用.連接酶容易失活,注意低溫操作,最好在冰上.時間3個小時足已.3、轉(zhuǎn)化：a、全量10U1參加至100illJM109感受態(tài)細(xì)胞中,冰中放置30分鐘.b、42C加熱45秒鐘后,再在冰中放置1分鐘.c、參加890mAMP陰性培養(yǎng)基,37c振蕩培養(yǎng)60分鐘.取100Ml鋪板.也可離心后余100Ml幾個非常重要的問題1做轉(zhuǎn)化的時候,進(jìn)行酶連接反響時,注意保持低溫狀態(tài),由于LIGASE酶很容易降解.為保險(xiǎn)起見,一般連接3小時,16度.2對含有AMP-RESISTENCE的質(zhì)粒鋪板

24、時,注意加AMP時的溫度,溫度過高,會使克隆株無法篩選出來.我的方法是培基高溫消毒后放在烤箱里,烤箱一般溫度為55-60度,然后做的時候拿出來,這樣好掌握溫度.鋪板前后注意用吹風(fēng)機(jī)吹干3對照的設(shè)立：為驗(yàn)證雙酶切是否成功,可做如下對照:A酶切反應(yīng)時加各單酶分別切,兩管,用同一種BUFFER,跑膠,看單切的兩管是否成線性.如兩管均成線性可初步判斷雙酶切成功.做轉(zhuǎn)化時,也要進(jìn)行對照.設(shè)4個:A.即拿雙酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物也進(jìn)行連接反響,這個對照可進(jìn)一步看雙酶切是否成功,如果長出克隆,說明很有可能只進(jìn)行了單酶切,如沒長出克隆,那么證實(shí)雙酶切成功,當(dāng)然要保證感受態(tài),培基,連接酶都正常的情況下.B.酶切過的未進(jìn)

25、行連接反響的雙酶切產(chǎn)物,進(jìn)行車t化,這一步可以證實(shí)是否有殘留的未被任何酶切的原始質(zhì)粒C.設(shè)原始質(zhì)粒為對照,意為檢測整個操作過程中是否有誤.D.AMP陰性板上用同一批感受態(tài)細(xì)胞鋪板20微升足夠,檢測感受態(tài)狀況.4.所有的試劑切記低溫保存.一步一個腳印.不要偷懶,圖省事最后卻更費(fèi)事.注意設(shè)立對照.經(jīng)PCR鑒定,克隆90%-100%的陽性率,所以在后面的挑克隆中,我只挑選4個就足夠了.然后雙酶切鑒定,測序一種挑取重組子克隆的簡易方法-菌落PCR凡經(jīng)過體外DNA重組以后,都要通過挑取重組子克隆的方法將改變以后的DNA序列固定下來.通常挑取克隆是一項(xiàng)十分繁瑣費(fèi)時的工作,特別對于連結(jié)效率較低、自連機(jī)率高的

26、情況,通過堿裂解法或煮沸法提取質(zhì)粒常常是事倍功半；另外一種情況是重組質(zhì)粒向農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的檢測過程中,由于提取農(nóng)桿菌的質(zhì)粒通常獲得的質(zhì)粒量很少,且背景不干凈,因此難以對酶切結(jié)果作出判斷.針對上述情況,我們在實(shí)踐中使用了PCR方法挑取重組子克隆,簡化了操作程序,取得了較滿意效果.1材料與方法1.1菌種與質(zhì)粒DH5A大腸桿菌受體菌及植物表達(dá)載體pBin438含有卡那霉素篩選標(biāo)記基因均由中國科學(xué)院微生物所田穎川提供.B21,32葡聚糖酶基因片段為作者從煙草中別離得到.pBLG為B21,32葡聚糖酶基因插入pBin438中所得到的植物表達(dá)載體.1.2 酶與試劑限制性內(nèi)切酶BamHI,SalI,Hind?

27、,EcoRI及T4DNA連接酶均購自Boehringermannhein等公司.TaqDNA聚合酶及PCR反響緩沖液為中科院微生物所田穎川先生實(shí)驗(yàn)室自制.1.3 PCR引物檢測B21,32葡聚糖酶基因的兩個引物為：5'端引物：5'2GCGGATCCGACCATGGCTGCTATCACACTCC23'3'端引物：5'2CGGTCGACCTCACATCTCACTTACGAGA23'.止匕引物由上海生物工程合成.1.4 轉(zhuǎn)化菌落的備份及菌落PCR反響物的制備將B21,32葡聚糖酶基因與植物表達(dá)載體pBin438的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5A感受態(tài)細(xì)胞,

28、并涂布于含卡那霉素50Lg-ml-1的LB培養(yǎng)基上,37C培養(yǎng)過夜,待菌落長至12mm時,用滅菌的牙簽沾取全部菌落先在預(yù)先分格并標(biāo)記數(shù)字的另一塊平皿上輕沾一下,然后在PCR反響混合液PCR反響緩沖液、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、dH2O中同樣輕洗一下,依次將需挑取的克隆全部在另一塊平皿上備份,并將剩余菌洗入對應(yīng)的PCR小管,加封石蠟油后進(jìn)行反響.PCR的反響條件為：94C預(yù)變性2min;94C變性lmin,55C復(fù)性1min,72C延伸1min,共30個循環(huán),將備份平皿放入37C培養(yǎng)至菌落出現(xiàn),置4C保存.2. 1菌落PCR挑取重組子克隆的優(yōu)勢倒置的平皿及底部的編號通常挑克隆中較繁瑣的

29、步驟是質(zhì)粒提取.每一種基因在導(dǎo)入植物或微生物之前都需要進(jìn)行體外重組構(gòu)建,然后通過挑取轉(zhuǎn)化單菌落得到重組子克隆.常規(guī)的堿裂解和煮沸法Sambrook,1989均需要經(jīng)過菌體過夜培養(yǎng)、菌體裂解及乙醇沉淀過程.一般情況下,在挑取的假設(shè)干克隆中只有少局部為重組子,因此提取質(zhì)粒過程消耗的時間很多,而利用菌落PCR挑取重組子克隆的過程那么避開了提取質(zhì)粒的繁瑣過程,只需將挑取的菌落在另一平皿備份圖1,再將剩余的菌洗入PCR反響混合液小管中,即可進(jìn)行PCR反響.由于檢測重組子對Taq酶的要求不是很嚴(yán)格,因此,自行提取及配制的Taq酶與緩沖液完全可以滿足需求,這使得實(shí)驗(yàn)本錢大大降低.一般PCR反響所需時間為34

30、h,在這期間,可以進(jìn)行其它的實(shí)驗(yàn),只需在PCR反響完成后進(jìn)行電泳檢查即可.根據(jù)PCR反響得到的重組子克隆,從備份中挑出35個菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取及酶切鑒定,并對正確插入外源片段的重組子克隆及時保存菌種.這大大地減輕了工作量.在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒檢測中,此方法更顯出其優(yōu)越性.由于農(nóng)桿菌的質(zhì)粒提取在目前還沒有一種較好的方法賈盤興,1992,通常采用大腸桿菌質(zhì)粒提取的方法進(jìn)行,只能得到很少的質(zhì)粒,且背景很雜圖2,難以正確判斷重組質(zhì)粒是否已導(dǎo)入農(nóng)桿菌中,而采用菌落PCR卻能得到非常好的結(jié)果圖3.3. 2菌落PCR過程中的假陽性問題通常在PCR反響過程中,無論是質(zhì)粒PCR還是菌落PCR都會遇到假陽性問題.為減

31、少或預(yù)防假陽性,每次進(jìn)行PCR反響所用的0.5ml離心管和移液槍頭必須是新的、無菌的,無菌雙蒸水分成500Ll每一小管,每次都用新的,不反復(fù)使用；設(shè)正、負(fù)對照,以保證在沒有模板條件下不產(chǎn)生任何條帶；平時培養(yǎng)良好的、正確的實(shí)驗(yàn)操作,使自己的實(shí)驗(yàn)用具不要被污染,這樣就可在一定的程度上預(yù)防假陽性機(jī)率.如果產(chǎn)生了假陽性,通常可采取一些識別方式加以判斷.一般重組子克隆的PCR反響條帶比擬亮且寬,形狀較規(guī)那么,而假陽性的PCR條帶,多數(shù)不太亮或假設(shè)隱假設(shè)現(xiàn),條帶細(xì)而不規(guī)那么,假設(shè)與重組子克隆的PCR條帶在一起時,較容易識別出來.目前在重組子克隆挑取及鑒定方面已有不少方法,如酚、氯仿一步抽提法(魏征宇,19

32、93)、快速裂解法、過柱法等.筆者認(rèn)為菌落PCR的方法是一種簡易而實(shí)用的方法,由于從它得到的結(jié)果就可以直觀地看出是否有外源片段插入,而其它的方法必須經(jīng)過提質(zhì)粒酶切前方可知是否真有外源片段插入,因此,此法對于解除繁重的實(shí)驗(yàn)工作將會有很大的幫助.Wazard大量DNA純化系統(tǒng)堿法大量提取DNA往往需要很長的時間,Promega公司的Wiazrd大量DNA純化系統(tǒng)既簡單又快速,只需要離心和真空抽干,這個系統(tǒng)可以從500ml培養(yǎng)液中在3小時以內(nèi)獲得1mg以上的高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA(200-20000bp).該系統(tǒng)不需要酚和氯仿抽提,純化后的DNA溶于水或TE緩沖液中,不含任何鹽份,可以直接用于DNA序列

33、分析和酶切反響,也可以用于在核酸酶抑制劑(如RNasin)存在的條件下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反響等.該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可以用于10次100-500ml質(zhì)粒培養(yǎng)液的別離和純化,試劑包括：150ml細(xì)胞懸浮150ml細(xì)胞裂解液,150ml中和液,100mlWizard大量DNA純化樹脂,125mlWizard柱子洗脫溶液和10支Wizard帶有存儲離心管的柱子.1、100-500ml細(xì)胞培養(yǎng)液置離心管中,22-25C下5000g離心10分鐘,所得細(xì)胞沉淀充分懸浮于細(xì)胞懸浮液中.2、加15ml細(xì)胞裂解溶液并輕輕混合,可以反復(fù)倒置混合,但不能用渦旋振蕩,細(xì)胞裂解完全時,溶液會變清,這一步需要20分鐘.3、

34、加15ml中和溶液,立即反復(fù)倒置離心管數(shù)次,并使之混勻.4、 14000g,22-25C離心15分鐘.5、小心地將上清液吸出并移至一個新離心管中.6、加0.5倍體積的異丙醇,混合均勻,14000g22-25C下離心15分鐘.7、棄上清,懸?DDNA沉淀于2mlTE緩沖液中.這一步中也許有的沉淀不能溶解.8、加10mlWizard大量DNA純化樹脂溶液,并渦旋混合.9、每一個樣品,使用一支Wizard大量柱子,柱子的頭插在真空器上(Promega產(chǎn)品,與此配套).10、將樹脂/DNA混合液轉(zhuǎn)入柱子中,真空抽取樹脂/DNA混合液.11、將樹脂/DNA混合液抽干后,加13ml柱子洗脫溶液至離心管中,

35、對管底部的樹脂/DNA進(jìn)行洗脫(柱子一邊旋轉(zhuǎn)一邊參加洗脫液),并參加柱子中.12、真空抽干所參加的洗脫.13、再加12ml柱子洗脫液進(jìn)柱子并抽干.14、參加5ml80%乙醇漂洗柱中的樹脂,柱子真空抽干后將柱子放入用戶提供的離心管中,2500rpm(1300g)離心5分鐘.15、取出柱子,真空抽干5分鐘,再將柱子放入系統(tǒng)中所提供的離心管中,2500rpm(1300g)離心5分鐘.16、在柱子中參加1.5ml65-70C預(yù)熱過的滅菌重蒸水或TE,1分鐘后2500rpm(1300g)離心柱子/離心管5分鐘.17、取出柱子,離心管中溶液即為提取的質(zhì)粒DNA,可以直接放在離心管中,蓋上蓋子,儲存在4c或

36、-20C備用.注意1.在使用之前,系統(tǒng)所提供的柱子洗脫液按1:1參加125ml95%乙醇.2.純化樹脂必須混勻后再用.質(zhì)粒的大量提取之細(xì)菌的培養(yǎng)及收集在制作酶譜、測定序列、制備探針等實(shí)驗(yàn)中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒DNA,為此需要大量提取質(zhì)粒DNA,許多年來,一直認(rèn)為在氯霉素存在下擴(kuò)增質(zhì)粒只對生長在根本培養(yǎng)基上的細(xì)菌有效,然而在帶有pMBl或ColEl復(fù)制子的高拷貝數(shù)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中,采用以下步驟可提升產(chǎn)量至每500ml培養(yǎng)物25mg質(zhì)粒DNA,而且重復(fù)性也很好.1、將30ml含有目的質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)到對數(shù)晚期OD600約0.6.培養(yǎng)基中應(yīng)含有相應(yīng)抗生素,用單菌落或從單菌落中生長起來的小

37、量液體閉關(guān)物進(jìn)行接種.2、將含相應(yīng)抗生素的500mlLB或Terrific肉湯培養(yǎng)基預(yù)加溫至37C參加25ml對數(shù)晚期的培養(yǎng)物,于37C劇烈振搖培養(yǎng)2.5h搖床轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分,所得培養(yǎng)物的OD600值約為0.4.3、可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液34mg/ml溶于乙醇,使終濃度為170gg/ml.有些質(zhì)粒只要生長到達(dá),新一代的質(zhì)粒如pUC質(zhì)粒可復(fù)制到很高的拷貝數(shù),因此無需擴(kuò)增.但像pBR322一類在宿主菌內(nèi)只以中等拷貝復(fù)制質(zhì)粒,有必要擴(kuò)增.用氯霉素進(jìn)行處理,具有抑制細(xì)菌復(fù)制的優(yōu)點(diǎn),可減少細(xì)菌裂解物的體積和粘稠度,極大地簡化質(zhì)粒純化的過程.所以一般說來,盡管要在生長中的細(xì)菌培養(yǎng)物里參加氯霉

38、素略顯不便,但用氯霉素處理還是利大于弊.4、于37C劇烈振搖300轉(zhuǎn)/分,繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時.5、用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭或相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭于4c以4000rpm離心15min,棄上清,敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡.將細(xì)菌沉淀重懸于100ml用冰預(yù)冷的STE中.STE：0.1mol/LNaCl10mmol/LTris.ClpH8.01mmol/LEDTApH8.05%TritonX-100根據(jù)前面所述收集細(xì)菌細(xì)胞.質(zhì)粒小量提取之堿裂解法試驗(yàn)原理：堿裂解法是較常用的提取的方法.其優(yōu)點(diǎn)是收獲率高,適于多數(shù)的菌株,所得產(chǎn)物經(jīng)純化后可滿足多數(shù)的DNA重組操作.十二烷基磺進(jìn)行質(zhì)粒的小量制備.十

39、二烷基磺酸鈉SDS是一種陰離子外表活性劑,它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解,又能使一些蛋白質(zhì)變性.用SDS處理細(xì)菌后,會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞破裂,釋放出質(zhì)粒DNA和染色體DNA,兩種DNA在強(qiáng)堿環(huán)境都會變性.由于質(zhì)粒和主染色體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同,變性時前者雖然兩條鏈別離,卻仍然纏繞在一起不分開；但后者完全變性分甚至出現(xiàn)斷裂,因此,當(dāng)參加pH4.8的酸性乙酸鉀降低溶液pH值,使溶液pH值恢復(fù)較低的近中性水平時,質(zhì)粒的兩條小分子單鏈可迅速復(fù)性恢復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu),但是主染色體DNA那么難以復(fù)性.在離心時,大局部主染色體與細(xì)胞碎片,雜質(zhì)等纏繞一起被沉淀,而可溶性的質(zhì)粒DNA留在上清夜中.再由異丙醇沉淀、乙醇洗滌,可得到純化的質(zhì)粒D

40、NA.堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列分析等.試驗(yàn)準(zhǔn)備：1、溶液I:pH8.0GET緩沖?50mmol葡萄糖,10mmol/LEDTA,25mmol/LTrisHCl;溶液I可成批配制,在10lbf/in26.895x104Pa高壓下蒸氣滅菌15min,貯存于4C.葡萄糖的作用是使懸浮后的大腸桿菌不會很快沉積到管子的底部,增加溶液的粘度,維持滲透壓及預(yù)防DNA受機(jī)械剪切力作用而降解.EDTA是Ca2十和Mg2十等二價(jià)金屬離子的螯合劑,在溶液I中參加EDTA,是要把大腸桿菌細(xì)胞中的二價(jià)金屬離子都螯合掉.從而起至ij抑制DNase對DNA的降解和抑制微生物生長的作用.2

41、、溶液U:0.2mol/LNaOH內(nèi)含1%的SDS,這個用的時候需現(xiàn)配.要新配置溶液II是為了預(yù)防NaOH接觸空氣中的CO2而減弱了堿性.NaOH是最正確溶解細(xì)胞的試劑.不管是大腸桿菌還是哺乳動物細(xì)胞,碰到了堿都會在瞬間溶解,這是由于細(xì)月膜發(fā)生了從bilayer雙層膜結(jié)構(gòu)向micelle微囊結(jié)構(gòu)的相變化.用不新鮮的0.4NNaOH,即便有SDS也無法有效溶解大腸桿菌.SDS是離子型外表活性劑.它主要作用是：a溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白,從而破壞細(xì)胞膜.b解聚細(xì)胞中的核蛋白.c能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-R+-蛋白質(zhì)的復(fù)合物,使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來.SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在接下來

42、的提取過程必須把它去除干凈,以便下一步試驗(yàn)的更好進(jìn)行.3、溶液W:pH4.8乙酸鉀溶液60ml5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸,28.5mlH2O;該溶液鉀離子濃度為3mol/L,醋酸根離子濃度為5mol/L.pH4.8的乙酸鉀溶液是為了把抽提液的pH調(diào)至中性,從而使變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性,且穩(wěn)定存在.溶液III參加后的沉淀實(shí)際上是K+置換了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS,而高濃度的鹽有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚,使得沉淀更完全.前者是由于中和核酸上的電荷,減少相斥力而互相聚合,后者是由于鹽與SDS-蛋白復(fù)合物作用后,能形成較小的鹽形式復(fù)合物.4、

43、異丙醇；采用PEG(6000)沉淀DNA,大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同,PEG的濃度低,選擇性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的濃度只需1%左右,小分子所需PEG濃度高達(dá)20%.5、無水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶,而DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在,同時乙醇與核酸不起化學(xué)反響,因此是理想的沉淀劑.參加的乙醇后,乙醇會奪去DNA周圍的水分子,DNA失水聚合.一般實(shí)驗(yàn)中,是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合,其乙醇的最終含量占67%左右.也可改用95%乙醇來替代無水乙醇.但是加95%的乙醇使總體積增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA損失也增大,尤其用屢次

44、乙醇沉淀時,就會影響收得率.折中的做法是初次沉淀DNA時可用95%乙醇代替無水乙酵,最后的沉淀步驟要使用無水乙醇.也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA.一般在室溫下放置1530min即可.但因?yàn)槭褂卯惐紩r常把鹽沉淀下來,所以較多的還是使用乙醇.6、 pH8.0TE緩沖10mmol/LTrisHCl,1mmol/LEDTA,其中含RNA酶20ug/ml.在基因操作實(shí)驗(yàn)中,選擇緩沖液的主要原那么是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分干擾作用.磷酸鹽緩沖系統(tǒng)(pKa=7.2)和硼酸系統(tǒng)(pKa=9.24)等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH),可作DNA的保存液,但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時,磷酸根離子的

45、種類及數(shù)量將與Ca2+產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反響時,不同的酶對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同,有的要求高離子濃度,有的那么要求低鹽濃度,采用Tris-HCl(pKa=8.0)的緩沖系統(tǒng),由于緩沖液是TrisH+/Tris,不存在金屬離子的干擾作用,故在提取或保存DNA時,大都采用Tris-HCl系統(tǒng),而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性.酚與水有一定的互溶,苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中,不致吸收樣品中含有DNA的水分,減少DNA的損失.用Tris調(diào)節(jié)至pH為8是由于DNA在此條件下比擬穩(wěn)定.在中性或堿性條件下(pH57),RNA比DNA更容易游離到水相,所以可獲

46、得RNA含量較少的DNA樣品.7、 70%乙醇試驗(yàn)步驟：1、無菌操作臺上,取1.5ml培養(yǎng)菌體置于離心管(Eppendorf管)中,微量離心機(jī)上以10000rpm離心1min,或者以4000rpm離心5-10min,棄上清液,離心管倒扣于干凈的吸水紙上吸干.2、沉淀中加100用冰預(yù)冷的溶液I,加或不參加少量溶菌酶粉末,充分混合需要劇烈振蕩.室溫下放置10min.3、參加200g1溶液II新鮮配置,加蓋后輕輕快速顛倒離心管數(shù)次混勻千萬不要振蕩,冰浴5min4、參加150預(yù)冷溶液III,輕輕顛倒數(shù)次混勻10s,置于冰浴15min.5、微量離心機(jī)上以4,12000rpm離心15min,取上清液于另一

47、新Eppendorf管中.6、上清夜中參加等體積酚/氯仿1:1混勻,微量離心機(jī)上以4,12000rpm,離心5min.經(jīng)驗(yàn)之談：如果選用宿主適宜的話如DH5a、XL1-red等,HB101和BL21那么不行,可以不用酚氯仿抽提這一步.用1倍體積的乙醇沉淀,沉淀中所含的鹽和RNA就很少了,完全去除上清液后就可以直接加TE溶解質(zhì)粒,后續(xù)的限制性酶切、轉(zhuǎn)化完全沒有問題.僅供參考7、小心轉(zhuǎn)上層至一新的離心管棄去中層的蛋白質(zhì)和下層的有機(jī)相.8、小心移出上清于一新Eppendorf管中,參加2/3倍體積異丙醇,混勻,4C離心12000gx5min.9、上清夜中參加2倍體積的無水乙醇混勻,室溫下放置5min

48、-10min,以12000rpm,離心5min-15min.10、1.0ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀12次,沉淀在室溫下晾干.11、小心吸去上清夜,將離心管倒置于一張紙上,使所有的液體流出.再將附著在管壁上的液滴除去.在除去管壁上的液滴時,可以用一次性吸頭與真空管相連,用吸頭接觸液面.但在液體吸出時應(yīng)當(dāng)盡量使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀.自然枯燥或者真空抽干到看不到液滴最好.12、參加5011lTE緩沖?PPH8.0含20Mg/mlRNaseA溶解質(zhì)粒粗提物,在-20C保存.考前須知：提取過程應(yīng)盡量在低溫環(huán)境中進(jìn)行,蛋白質(zhì)的去除以酚/氯仿混合效果最好,可以采取屢次抽提盡量將蛋白質(zhì)除干凈,在沉淀DNA時通常

49、使用冰乙醇,在低溫條件下放置可使DNA沉淀完全.同時反響中參加的鹽濃度一定要限制好,當(dāng)參加的鹽溶液濃度太低時,只有局部DNA形成DNA鉀鹽而聚合,這樣就造成DNA沉淀不完全,當(dāng)參加的鉀溶液濃度太高時,其效果也不好.在沉淀的DNA中,由于過多的鹽雜質(zhì)存在,影響DNA的酶切等反響,必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀.一般情況下都是參加的最終濃度達(dá)0.10.25mol/L為宜.質(zhì)粒DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳一堿變性法提取質(zhì)粒DNA質(zhì)粒Plasmid是細(xì)菌染色體外能自身獨(dú)立復(fù)制的雙股環(huán)狀DNA.帶有遺傳信息,可賦予細(xì)菌某些新的表型.將質(zhì)粒指紋圖譜分析方法、質(zhì)粒DNA探針技術(shù)及檢測質(zhì)粒的PCR技術(shù)用于臨床感染性疾病

50、的診斷和流行病學(xué)調(diào)查已成為現(xiàn)實(shí).質(zhì)粒作為載體在基因工程中起著重要的作用.別離和純化質(zhì)粒DNA的方法很多,但這些方法根本包括三個步驟：即細(xì)菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增,細(xì)菌菌體的裂解；質(zhì)粒DNA的提取與純化.本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)用堿變性方法提取質(zhì)粒DNAo【原理】細(xì)菌培養(yǎng)物參加SDS和NaOH堿性溶液處理后,菌體裂解,可使細(xì)菌的質(zhì)粒DNA、染色體DNA和RNA一起從細(xì)胞內(nèi)釋放出來,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,因各種核酸分子的遷移率不同將上述核酸分成不同的帶.用溟化乙錠(EB)染色后,在紫外線燈下可看到各種核酸帶發(fā)出的熒光.根據(jù)熒光的位置,可區(qū)分不同的核酸帶.【材料】1 ,菌株E.coliJM109(pUC19),E.

51、coliRRI(pBR322)2 .試劑溶液I(50mM葡萄糖,25mMTris.HclPH8.0,10mMEDTA)溶液II(0.2NNaOH,1%SDS)用前新配制溶液III(5mMKAc溶?PH4.8)TE緩沖液(10mMTris.Hcl,1mMEDTAPH8.0)LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白陳10g,酵母粉5g,Nacl10g.加蒸儲水溶解,用NaOH調(diào)PH至7.5,加水至1000ml,15磅高壓滅菌15分鐘).【方法】1 .接種細(xì)菌于5mlLB液體培養(yǎng)基中,370C培養(yǎng)過夜.2 .3000rpm/min,離心15min,棄上清.參加100ul溶液1懸起細(xì)菌沉淀.3 .參加200ul前新配制

52、的溶液II,顛倒EP管5次混合均勻,置冰浴2min.4,參加150ul溶?III溫和地混勻,12000rpm/min,離心5min.5 .吸取上清清亮裂解液放入另一新EP管中,加等體積酚-氯仿-異戊醇抽提2次,12000rpm/min,離心2min.(假設(shè)不做酶切,此步可省略)吸取上清放入另一新EP管中,參加二倍體積的冷乙醇,12000rpm/min,離心10min.6 .棄乙醇,枯燥后用30ulTE緩沖液洗下核酸,待電泳檢測.(二)瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)(Agarosegelelectroghoresis)是別離、鑒定和提純DNA片斷的有效方法.凝膠分辨率決定于使用材料的濃度,并由

53、此決定凝膠的孔徑.瓊脂糖凝膠可分辯0.16.0kb的雙鏈DNA片段.瓊脂糖凝膠電泳是一個電場作用.它首先利用瓊脂糖的分子篩效應(yīng),止匕外,在弱堿性條件下,DNA分子帶負(fù)電荷,從負(fù)極向正極移動.根據(jù)DNA分子大小、結(jié)構(gòu)及所帶電荷的不同,它們以不同的速率通過介質(zhì)運(yùn)動而相互別離.借助溟化乙錠(EB)能與雙鏈DNA結(jié)合的作用,利用EB染色,并通過紫外線激發(fā)即可觀察被別離DNA片段的位置.【材料】1 .瓊脂糖、10XTAE電泳緩沖液(40mMTris,20mMNaAc,1mMEDTAPH8.0)2 .載體緩沖液(0.25%溟酚藍(lán),30%甘油)、溟化乙錠水溶液(10mg/ml)3 .凝膠槽、電泳儀【方法】1

54、 .取瓊脂糖0.9g,參加100ml1xTAE電泳緩沖液于250ml燒瓶中,1000C加熱溶解.2 .平衡凝膠槽,放好兩側(cè)擋板,調(diào)節(jié)好梳子與底板的距離一般高出底板0.51mm.3 .鋪板：在溶解好的凝膠中參加終濃度為0.5ug/ml的溟化乙錠水溶液,輕輕混勻,待冷至500C左右倒入凝膠槽,膠厚一般為58mm.4 .待膠徹底凝固后,去掉兩側(cè)擋板,將凝膠放入盛有電泳液的槽中加樣孔朝向負(fù)極端,DNA由負(fù)極向正極移動,使液面高出凝膠23mm,小心拔出梳子.5 .DNA樣品與載體緩沖液5:1混合并參加凹孔中樣品不可溢出.6 .翻開電源,調(diào)節(jié)所需電壓,電壓與凝膠的長度有關(guān),一般使用電壓不超過5v/cmo7

55、 .據(jù)指示染料移動的位置,確定電泳是否終止溟酚藍(lán)的涌動距離在5sRNA和0.3kbDNA帶之間.8 .電泳完畢關(guān)閉電源.將凝膠放紫外燈下觀察并拍照.質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒提取質(zhì)粒DNA【根本原理】此試劑盒用于質(zhì)粒DNA小量純化.該試劑盒采用了傳統(tǒng)的SDS堿裂解法,結(jié)合DNA制備膜技術(shù),具有高效、快速、方便之特點(diǎn),全套操作只需1小時便可完成.使用本試劑盒可從1-4ml的過夜培養(yǎng)的菌液中純化得到120Mg的高純度質(zhì)粒DNA,此質(zhì)粒DNA可直接用于DNA序列分析以及各種酶促反響等.【器材】1. .離心機(jī)2. SpinColumn3. CollectionTube2ml* 1初次使用試劑盒時,請將R

56、NaseA1全部參加到Solution1中,混合均勻后4c保存.* 2假設(shè)出現(xiàn)沉淀,請于37C保溫溶解,待恢復(fù)至室溫后使用.* 3ElutionBuffer組成：2.5mmol/LTris-ClpH8.5.【操作方法】1 .大腸桿菌的培養(yǎng).從平板培養(yǎng)基上挑選單菌落接種至14ml的含有抗生素的液體培養(yǎng)基中,37c過夜培養(yǎng).注培養(yǎng)液不宜過量,培養(yǎng)液過量時,會因菌量太大而溶菌不充分,純化時會影響質(zhì)粒的純度.2 .取14ml的過夜培養(yǎng)菌液,12O0Orpm離心2min,棄上清.3 .用250Ml的SolutionI含RNaseA1充分懸浮細(xì)菌沉淀.注注意不要?dú)埩艏?xì)小菌塊,可以使用振蕩器Vortex等劇烈振蕩使菌體充分懸浮.4 .參加250國1的SolutionII輕輕