正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選鬼臼毒素固體脂質(zhì)納米粒制備工藝

1、正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選鬼臼毒素固體脂質(zhì)納米粒制備工藝                           作者：史毓杰 曾抗 李國鋒 張敏 谷東風(fēng) 楊健 【摘要】  目的優(yōu)化鬼臼毒素固體脂質(zhì)納米粒配方及工藝條件。方法采用正交設(shè)計(jì)方法對制劑配方及工藝條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以表面活性劑含量及表面活性劑成分，固體脂質(zhì)的含量，攪拌速度為4個(gè)因

2、素，固體脂質(zhì)納米粒粒徑大小為考察指標(biāo)，篩選出鬼臼毒素固體脂質(zhì)納米粒最佳的制劑量配方，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)和穩(wěn)定性觀察。結(jié)果通過對各配方的綜合評價(jià)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析研究得出表面活性劑含量為5%，主要成分為Brij78，固體脂質(zhì)含量為1%，攪拌速度1 000 r/min為最佳制備條件，鬼臼毒素含量為0.5%。結(jié)論根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果制備的鬼臼毒素固體脂質(zhì)納米粒在粒徑方面符合要求，且在穩(wěn)定性、外觀方面均較理想。 【關(guān)鍵詞】  正交設(shè)計(jì) 鬼臼毒素 固體脂質(zhì)納米粒Abstract：ObjectiveTo select the optimum condition of the podophyllotoxin so

3、lid lipid nanopartcles(PODSLN)preparation.MethodsThe optimization of PODSLN preperation was performed based on the orthogonal esperimental design.In this study，the particle size of PODSLN were taken as the index and the influenece of factors such as concentration of surfactant，matrix lipid，the compo

4、sition of surfactant and agitation velocity were evaluated.ResultsThe best formulation of POD SLN were 5% surfactant (Brij78)，1% matrix lipid and agitation velocity was 1 000 r/min，in which podophyllotoxin was 0.5%.ConclusionThe POD SLN designed according to orthogonal experiment was coincidenced wi

5、th the requirements in aspect of the particle size and it has been proved to be stable，reasonable and scientific.Key words：Orthogonal design;  Podophyllotoxin;  Solid lipid nanoparticles    隨著納米技術(shù)在生物工程學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的不斷，固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticle，SLN)作為一種新型藥物載體制劑，因其良好的組織相容性和靶向緩

6、釋特性，成為目前藥物和基因治療的研究熱點(diǎn)1。人乳頭瘤病毒（HPV ）的傳播和蔓延是當(dāng)今困擾醫(yī)學(xué)界的難題之一，在我國其發(fā)病率也逐年提高，目前已占我國性傳播疾病的第2位。目前治療HPV感染的藥物主要有0.5%鬼臼毒素酊劑、0.5%鬼臼毒素凝膠等制劑，但是其吸收后可引起嚴(yán)重的全身副作用，而且對局部正常組織的刺激性也較大，限制了其臨床應(yīng)用。因此我們設(shè)計(jì)出靶向性、緩釋性的鬼臼毒素新型外用制劑鬼臼毒素固體脂質(zhì)納米粒（Podophyllotoxin solid lipid nanoparticles，PODSLN)，并通過正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選其基質(zhì)成分及工藝條件，以進(jìn)一步提高制劑的質(zhì)量，優(yōu)化制備工藝。1 

7、; 材料和儀器1.1  試劑鬼臼毒素（陜西德賽高科技生物股份有限公司，純度98%）；棕櫚酸（汕頭市西隴化工廠）；卵磷脂（上海太偉藥業(yè)有限公司）；F68、Brij78(sigma公司）；Myrj53（遼寧奧克納米材料有限公司，藥用規(guī)格）；二氯甲烷、乙醇及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2  儀器Zetasizer 3 000 HS粒徑分析儀（Malvern Instruments Ltd，UK)；磁力攪拌器（GL2型 鞏儀市英峪華儀器廠）；JB3A 型定時(shí)恒溫磁力攪拌器（上海雷磁新涇儀器有限公司）；TMP1 型天平（德國制造）2  方法2.1  考察因素和水平

8、根據(jù)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇影響配方主要方面的表面活性劑量含量及表面活性劑量成分，固體脂質(zhì)的含量，攪拌速度為4個(gè)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，采用正交表 L9（34）進(jìn)行篩選。因素水平表見表1。固體脂質(zhì)納米粒粒徑的大小能夠直接影響到制劑的質(zhì)量和藥物療效，作為經(jīng)皮給藥的固體脂質(zhì)體，其粒徑的大小影響到制劑與皮膚之間的閉塞效應(yīng)和皮膚滲透能2。因此我們以粒徑大小作為評價(jià)指標(biāo)對鬼臼毒素 固體脂質(zhì)納米粒的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。表1  正交實(shí)驗(yàn)因素水平表（略）2.2  鬼臼毒素固體脂質(zhì)納米粒的制備文獻(xiàn)3，取處方量卵磷脂，加入適量乙醇，超聲使其溶解；精密稱取處方量的鬼臼毒素，棕櫚酸、十八烷酰胺溶于適量二

9、氯甲烷，兩者混合共同構(gòu)成油相。另取處方量的F68，Brij78或Myrj53加入50 ml 雙蒸水中，超聲使其充分溶解，構(gòu)成水相。油相緩慢注入1 0003 000 r/min攪拌的（75±2) 恒溫水相中持續(xù)攪拌約24h，使有機(jī)溶媒完全蒸發(fā)并使體系濃縮至約515ml。將所行半透明微乳快速混于另一04的5  ml冰水中，并在冰水中超聲1 h，即得鬼臼毒素固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?。2.3  納米粒徑的測定取制備的鬼臼毒素固體脂質(zhì)納米粒混懸液適量，加適量雙蒸水稀釋后，用Zetasizer 3 000HS型粒徑分析儀測定其粒徑。2.4  形態(tài)學(xué)觀察取根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

10、制備的PODSLN混懸液適量加雙蒸水稀釋后滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，以2%的磷鎢酸鈉液負(fù)染，在掃描電鏡下照片，觀察其粒徑大小和形態(tài)。2.5  外觀性狀及穩(wěn)定性考察將制成的PODSLN混懸液和空白SLN混懸液裝入青霉素小瓶各3份，分別于室溫及冰箱（4)中 ，在24h， 1個(gè)月，3個(gè)月，6個(gè)月時(shí)觀察其外觀、性狀（粘稠度、色澤、亮度、細(xì)膩、均勻性等）變化，4 000 r/min離心15 min觀察是否分層或出現(xiàn)沉淀。2.6  統(tǒng)計(jì)方法采用正交設(shè)計(jì)的方差分析。1         3  結(jié)果3.1

11、  正交分析實(shí)驗(yàn)方案及檢測結(jié)果見表23，方差分析顯示A、C、D因素對制劑的質(zhì)量有影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05)；其中A因素即表面活性劑的含量有極顯著影響（P0.01)，而B則對制劑的質(zhì)量無顯著性影響。我們的最優(yōu)方案是A3B2C1D1。即鬼臼毒素固體脂質(zhì)納米粒處方中含有表面活性劑量5%，成分為Brij78，固體脂質(zhì)含量為1%，攪拌速度為1 000 r/min，其中鬼臼毒素含量為0.5%。表2  正交實(shí)驗(yàn)各評價(jià)指標(biāo)及結(jié)果（略）表3  方差分析（略）3.2  形態(tài)學(xué)觀察制備的PODSLN混懸液呈外觀均一、穩(wěn)定的透明膠體狀分散體系，電鏡下納米粒呈圓形或卵圓

12、形，粒徑大小在4398nm之間，帶銀白色乳光。3.3  穩(wěn)定性觀察PODSLN樣品置4 冰箱6月內(nèi)仍保持半透明、淡乳色、質(zhì)地均勻外觀，未見沉淀及藥物結(jié)晶析出，4 000 r/min離心15 min 未發(fā)現(xiàn)分層現(xiàn)象。置室溫的納米脂質(zhì)體混懸液1個(gè)月時(shí)出現(xiàn)少量混濁，仍均勻，未見藥物結(jié)晶析出等現(xiàn)象，36個(gè)月時(shí)出現(xiàn)沉淀，有少量藥物析出。4  討論    固體脂質(zhì)納米粒是20世紀(jì)90年代起來的一種可替代乳劑、脂質(zhì)體和聚合納米粒的新型膠體載藥系統(tǒng)4。它以固態(tài)的天然或合成的類脂為載體，將藥物包裹于類脂核中制成。由于載藥納米粒的粒徑小，比表面大，對受體組織的黏附

13、性大，給藥后滯留性及與組織的接觸時(shí)間、接觸面積均大為增加，從而可提高藥物的生物利用度、降低毒性、減少藥劑用量5。同時(shí)由于其粒徑較小，可以在皮膚表面形成由緊密排列的球體組成的連貫性的膜，形成閉塞效應(yīng)6，閉塞效應(yīng)可以通過增加角質(zhì)層的水合作用，減少水分蒸發(fā)來促進(jìn)藥物在皮膚的滲透。    在采用超聲乳化法制備PODSLN的過程中，有機(jī)溶劑的含量、溫度、pH值以及乳化、攪拌時(shí)間等因素都會(huì)影響最后制劑的質(zhì)量，但我們在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這些并不是主要的影響因素。因此我們選擇影響配方主要方面的表面活性劑的含量、成分，固體脂質(zhì)的含量以及攪拌速度為四個(gè)因素，采用正交實(shí)驗(yàn)法對鬼臼毒素納米脂質(zhì)

14、體制備配方進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果在考察范圍內(nèi)，方差分析表明，B因素即表面活性劑量的成分對制劑量沒有顯著影響；而A、C、D因素對制劑的質(zhì)量有影響，其中A因素即表面活性劑的含量對制劑影響顯著。    表而活性劑的選擇在SLN的制備過程中起著重要作用，表面活性劑在溶液表面聚集吸附，從而改變?nèi)芤罕砻娴男再|(zhì)，使油水之間表現(xiàn)出較低的表面張力和表面自由能。表面活性劑在粒子周圍有的排列成膜，隨之產(chǎn)生較好的潤濕性、乳化性，因此形成的固體納米粒有較小的粒徑和較好的穩(wěn)定性。表面活性劑量分為陽離子型、陰離子型、兩性離子及非離子型表面活性劑，其中非離子型表面活性劑的毒性最小，我們選用的F68，B

15、rij78，Myrj53均為非離子型表面活性劑。最終確定最優(yōu)配方方案是A3B2C1D1，即鬼臼毒素納米脂質(zhì)體含有表面活性劑量5%，成分為Brij78，固體脂質(zhì)含量為1%，攪拌速度為1 000 r/min，鬼臼毒素含量為0.5%。我們根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明制備的PODSLN經(jīng)過電鏡和穩(wěn)定性考察，外觀均一，粒徑大小符合要求，穩(wěn)定性好，從而可以獲得質(zhì)量更高的產(chǎn)品，為將來制劑的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。【】  1 Bejjani RA， Ben Ezra D，Cohen H，et al.Nanoparticles for gene delivery to retinal pigment epithe

16、lial cellsJ.Mol Vis，2005，11:124.2 Wissing S，Lippacher A，Muller RH.Investigation on the occlusive properties of solid lipid nanoparticles(SLN)J.J Cosmet Sci，2001，52(5):313.3 謝方明，曾 抗，李國鋒，等.鬼臼毒素硬脂酸固體脂質(zhì)納米粒的制備J.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25（1）：99.4 Muller RH，Keck CM.Challenges and solutions for the delivery of biotech drugsa review of drug nanocrystal technology and lipid nanoparticlesJ.J Biotehnol，2004，1