實驗五細菌鑒定中常見的生理生化反應

1、實驗五 細菌鑒定中常見的生理生化反應一、實驗目的。1) 了解細菌生理生化反應原理，掌握細菌鑒定中常見的生理生化反應方法。2) 了解不同細菌對不同含碳、含氮化合物的分解利用情況。3) 了解細菌在不同培養(yǎng)基的不同生長現(xiàn)象及其代謝產物在鑒別細菌中的意義。二、實驗原理。各種細菌所具有的酶系統(tǒng)不盡相同，對營養(yǎng)基質的分解能力也不一樣，因而代謝產物存在差別。以此用生理生化試驗的方法檢測細菌對各種基質的代謝作用及其代謝產物，從而鑒別細菌的種屬，稱之為細菌的生理生化反應。1. 糖（醇）類發(fā)酵試驗不同的細菌含有發(fā)酵不同的糖（醇）的酶，因而發(fā)酵糖（醇）的能力各不相同，產生的代謝產物也不同：有的產酸產氣，有的產酸不產

2、氣。指示劑溴甲酚紫，pH5.2黃色pH6.8紫色，當發(fā)酵產酸時，培養(yǎng)基將由紫變黃。產氣可由杜氏小管中有無氣泡來證明。2. 甲基紅試驗（M.R試驗）甲基紅試驗，pH4.4紅色pH6.2黃色，是用來檢測由葡萄糖產生的有機酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。有些細菌分解糖類產生丙酮酸，丙酮酸進一步反應形成甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的pH降低到4.2以下。有些細菌在培養(yǎng)的早期產生有機酸，但在后期將有有機酸轉化為非酸性末端產物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大約6。3. Voges-Proskauer試驗（伏-普試驗，V.P. 試驗）伏-普試驗是用來測定某些細菌利用葡萄糖產生非酸性或中性末端產物的能力。某些細菌分

3、解葡萄糖成丙酮酸，再將丙酮酸縮合脫羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性條件下，被氧化為二乙酰，二乙酰與培養(yǎng)基中所含的胍基作用，生成紅色化合物為V.P.反應陽性。4. 靛基質試驗某些細菌，如大腸桿菌，能產生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，產生靛基質，靛基質與對二甲基氨基苯甲酸結合，形成玫瑰色靛基質。5. 硫化氫試驗某些細菌能分解含硫的氨基酸，產生硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的鐵鹽反應，形成黑色的硫化鐵沉淀，為硫化氫試驗陽性。6. 明膠液化實驗明膠在25度以下可維持凝膠狀態(tài)，以固體狀態(tài)存在，而在25度以上時明膠就會液化。有些微生物可產生一種成為明膠酶的胞外酶，水解這種蛋白質，而使明膠液化，甚至在4度仍

4、能保持液化狀態(tài)。7. 檸檬酸鹽利用試驗有的細菌如產氣桿菌，能利用檸檬酸鈉為碳源，因此能在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長，并分解檸檬酸鹽后產生碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。此時培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍指示劑pH6.0(黃)7.6(藍)，由綠色變?yōu)樯钏{色。8. 淀粉水解實驗細菌水解淀粉的過程可以通過底物的變化來證明，即用碘測定不再產生藍色。三、實驗儀器、材料和用具實驗儀器：32度恒溫培養(yǎng)箱、4度冰箱；微生物材料：大腸桿菌、變形桿菌、枯草桿菌、產氣桿菌、待鑒定的未知菌的平板單菌落；試劑：甲基紅試劑、V.P.試劑、吲哚試劑，KOH溶液；實驗用具：試管：每個試驗3根試驗管，1根對照管，8個試驗，共32管；杜氏小管、接種

5、環(huán)、接種針、酒精燈、火柴、試管架、記號筆。四、實驗步驟。1. 配制培養(yǎng)基（上次實驗完成）2. 鑒別實驗1）糖(醇)類發(fā)酵試驗編號：在各試管上分別標明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱，所接種的菌名和組號，下同。接種：取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基3支，按編號1支接種大腸桿菌，另1支接種普通變形桿菌，第3支不接種，作為對照。同樣取3支乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，1支接種大腸桿菌，1支接種普通變形桿菌，第3支不接種，作為對照。將已接種好的培養(yǎng)基置32溫箱中培養(yǎng)24h。2）. 甲基紅試驗(M.R.試驗)將大腸桿菌和產氣桿菌分別接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，32培養(yǎng) 24h，加甲基紅指示劑數(shù)滴，觀察結果，呈現(xiàn)紅色者為陽性，呈現(xiàn)黃色者為陰性。3）

6、. 伏一普試驗(VP試驗)將被檢菌接種到葡萄糖蛋白胨水中，32培養(yǎng)24h，取出，加入40KOH 7滴，然后再加入等量的5a-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37溫箱中保溫30min，以加快反應速度。若培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色，為伏普反應陽性。4)靛基質(吲哚)試驗 將被檢菌接種到胰蛋白胨水培養(yǎng)基中，32培養(yǎng)24h后，滴加數(shù)滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面，輕輕搖動，觀察結果。 出現(xiàn)紅色者為陽性，出現(xiàn)黃色者為陰性。5). 硫化氫試驗：將大腸桿菌和變形桿菌以接種針穿刺接種到醋酸鉛或檸檬酸鐵氨培養(yǎng)基中，32培養(yǎng)24h，觀察結果，若有黑色出現(xiàn)者為陽性。6)明膠液化試驗 取大腸桿菌和枯草桿菌的純培養(yǎng)物少許，以接種針分別穿刺接種到

7、營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基中，置32培養(yǎng)24小時。故觀察結果時，應將明膠培養(yǎng)基輕輕放入4冰箱30min，此時明膠又凝固。若放置于冰箱30min仍不凝固者，說明明膠被試驗細菌液化，是為陽性。7） 檸檬酸鹽利用試驗取少量被檢菌接種到檸檬酸鹽培養(yǎng)基上，32培養(yǎng)24h后，觀察結果。培養(yǎng)基變深藍色者為陽性。8） 淀粉水解試驗在培養(yǎng)進表面滴加碘液，觀察是否變紫。五、實驗結果及分析1.觀察結果如下表：表1 實驗結果編號大腸桿菌枯草桿菌產氣桿菌變形桿菌未知菌空白對照葡萄糖發(fā)酵實驗變黃色，有氣泡/變黃色，無氣泡變黃色，無氣泡紫色，無氣泡乳糖發(fā)酵實驗變黃色，有氣泡/紫色，無氣泡紫色，無氣泡紫色，無氣泡甲基紅試驗紅色/黃色/桔

8、紅色淡黃色伏-普試驗黃色紅色紅色淡黃色吲哚試驗玫瑰紅色/玫瑰紅色/無色淡黃色硫化氫試驗黃色/黑色從中間向外蔓延黃色黃色明膠液化試驗無液體/無液體/液體無液體檸檬酸鹽利用試驗下藍上黃/下黃上藍/下藍上黃綠色淀粉試驗紫色紫色紫色黃色紫色紫色表2. 各項生理生化實驗現(xiàn)象及意義陽性陰性（對照）現(xiàn)象意義現(xiàn)象意義葡萄糖發(fā)酵實驗溶液變黃細菌代謝產有機酸溶液仍為紫色細菌代謝不產酸杜氏小管中有氣體（體積10% ）細菌代謝產生氣體杜氏小管中無氣體細菌代謝不產生氣體乳糖發(fā)酵實驗溶液變黃細菌代謝產有機酸溶液仍為紫色細菌代謝不產酸杜氏小管中有氣體（體積10% ）細菌代謝產生氣體杜氏小管中無氣體細菌代謝不產生氣體甲基紅試

9、驗加入甲基紅，培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色pH下降到4.2以下加入甲基紅，培養(yǎng)基為黃色pH值大于6伏-普試驗培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色細菌代謝產生乙?；状寂囵B(yǎng)基為黃色細菌代謝不產生乙?；状歼胚嵩囼炁囵B(yǎng)基呈現(xiàn)紅色細菌代謝可分解色氨酸培養(yǎng)基為黃色細菌代謝不能分解色氨酸硫化氫試驗產生黑色固體細菌代謝產生硫化氫無黑色固體產生細菌代謝不產生硫化氫明膠液化試驗明膠在4仍能保持液化狀態(tài)細菌可產生明膠酶明膠在25以下不能液化細菌不能產生明膠酶檸檬酸鹽利用試驗培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樯钏{色細菌可利用檸檬酸鹽作為碳源培養(yǎng)基仍為綠色細菌不能利用檸檬酸鹽作為碳源淀粉水解試驗不變，黃色細菌可利用淀粉變紫細胞無法利用淀粉2.照片及分析：1）糖(醇)類

10、發(fā)酵試驗現(xiàn)象：葡萄糖發(fā)酵中，三個菌種的溶液都變黃，為陽性；僅大腸桿菌杜氏小管含氣泡。分析：大腸桿菌能分解葡萄糖，產生甲酸等產物，并有甲酸解氫酶，可將其分解為CO2和H2，故生化反應結果為產酸產氣。而另外兩種菌代謝產生了酸，但沒有氣體產生。另外，未知菌溶液臨近表面處有一層深色區(qū)域，不像指示劑的顏色，可能為某種代謝產物。圖1 葡萄糖發(fā)酵（從左到右依次為對照、大腸桿菌、未知菌、變形桿菌）現(xiàn)象：乳糖發(fā)酵中，未知菌和變形桿菌都不變色，大腸桿菌的培養(yǎng)液變黃。只有大腸桿菌杜氏小管有氣泡。分析：變形桿菌無法利用乳糖，未知菌無法利用乳糖或在乳糖代謝途徑中沒有產生有機酸，大腸桿菌乳糖代謝途徑產生了有機酸，且產生了

11、氣體圖2 乳糖發(fā)酵（從左到右依次為對照、未知菌、變形桿菌、大腸桿菌）2）. 甲基紅試驗(M.R.試驗)現(xiàn)象：甲基紅試驗中，大腸桿菌為深紅色，說明其產生的酸最多；未知菌為桔紅色，說明它產酸量中等；產氣桿菌為黃色，說明它基本不產酸。分析：大腸桿菌分解糖類產生丙酮酸，丙酮酸進一步反應形成甲酸等，使培養(yǎng)基的pH降低，培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色。產氣桿菌在培養(yǎng)的早期產生有機酸，但在后期將有有機酸轉化為非酸性末端產物，使pH升至大約6，培養(yǎng)基呈現(xiàn)黃色。圖3 甲基紅試驗（從左到右依次為對照、大腸桿菌、產氣桿菌、未知菌）3）. 伏一普試驗(VP試驗)現(xiàn)象：大腸桿菌黃色（即無變化），產氣桿菌稍有紅色，未知菌為紅色。分析：，

12、說明大腸桿菌在葡萄糖蛋白胨水中代謝不產生乙酰基甲醇；產氣桿菌產生了少量乙?；状迹晃粗a生了較多乙?；状甲ⅲ篤.P.試驗一開始是沒有現(xiàn)象的，最后把其他的試管都洗了后(這也是沒有對照的原因)，我們重新滴加了邊臺的NaOH，然后用a-萘酚溶液處理，所以估計一開始沒有現(xiàn)象的原因可能和KOH失效有關。圖4 V.P試驗（從左到右依次是大腸桿菌、產氣桿菌、未知菌）4)靛基質(吲哚)試驗現(xiàn)象：吲哚試驗中，未知菌沒有變化；產氣桿菌和大腸桿菌溶液表面產生了少量玫瑰紅。分析：未知菌無法分解色氨酸，產氣桿菌和大腸桿菌可以分解色氨酸。另外，對照組也出現(xiàn)了玫瑰紅，照理說里面沒有微生物分解蛋白胨中的色氨酸產生靛基質的

13、話，是不會反應產生紅色化合物的，估計試劑有污染，比如有含色氨酸酶的雜菌引入。圖5 吲哚試驗（從左到右依次是對照、未知菌、產氣桿菌、大腸桿菌）5). 硫化氫試驗：圖片不是很清晰，請見諒?，F(xiàn)象：硫化氫試驗中，僅有變形桿菌產生了黑色物質。三只試管接種周圍都有向外擴展現(xiàn)象。分析：僅變形桿菌能分解含硫的氨基酸并產生硫化氫。三種菌均具有運動能力圖6 硫化氫試驗（從左到右依次是對照、未知菌、變形桿菌、大腸桿菌）6). 明膠液化試驗現(xiàn)象：明膠液化試驗中，僅有未知菌使明膠在25以下液化分析：僅未知菌可產生明膠酶圖7 明膠液化試驗（從左到右依次是對照、未知菌、大腸桿菌、枯草桿菌）7). 檸檬酸鹽利用試驗現(xiàn)象：檸檬

14、酸鹽利用實驗中，未知菌和大腸桿菌使培養(yǎng)基變黃；產氣桿菌培養(yǎng)基變藍。分析：未知菌和大腸桿菌不能利用檸檬酸鈉作碳源或在利用檸檬酸鹽時產生了酸，產氣桿菌在利用檸檬酸鹽時產生了堿圖8 檸檬酸鹽利用實驗（從左到右依次是對照、未知菌、產氣桿菌、大腸桿菌）8). 淀粉水解試驗變形桿菌空白對照未知菌枯草桿菌產氣桿菌大腸桿菌圖9 淀粉水解實驗現(xiàn)象：淀粉水解實驗中，除了未知菌外，所有菌均有變藍的現(xiàn)象。分析：未知菌分解了淀粉，其他菌無法分解或只能少量利用淀粉。六、實驗小結這次實驗重點是觀察，而且要注意觀察前的操作，比如明膠要觀察必須先在4冰箱冷藏，拿出來后要盡快觀察防止其在室溫下融化；而吲哚試驗要注意不要晃動，因為

15、產生的玫瑰色靛基質本來就不多，如果劇烈晃動使之擴散開來的話，就基本上看不見了；V.P.試驗是最糾結的，很多組在32下放了很久還是沒有現(xiàn)象，我們開始認為是因為溫度不夠，可是加熱也沒有效果，于是考慮是不是試劑的問題，于是擅自用了實驗室邊臺用于調pH的NaOH溶液，結果果然變紅了。七、思考1. 接種后的明膠試管可以在37度培養(yǎng)，在培養(yǎng)后你必須采取什么措施才能證明液化的存在？將明膠培養(yǎng)基放入4冰箱30min，仍不凝固說明明膠被試驗細菌液化，為陽性。2. 在吲哚試驗和硫化氫產生試驗中細菌各分解哪種氨基酸？吲哚試驗:含有色氨酸酶的細菌（如大腸桿菌、變形桿菌等）可分解色氨酸生成吲哚。硫化氫試驗：變形桿菌、乙型副傷寒桿菌等能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氫。3. 假設某種微生物可以有氧代謝